Caracterização da diferenciação in vitro dos queratinócitos primários humanos pela análise do RNA-Seq

Jos G.A. Smits; Jieqiong Qu; Hanna Niehues; Huiqing Zhou

doi:10.3791/60905

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Artigo de método

Caracterização da diferenciação in vitro dos queratinócitos primários humanos pela análise do RNA-Seq

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DOI:

10.3791/60905

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16 de maio de 2020

Jos G.A. Smits^*¹ , Jieqiong Qu^*¹ , Hanna Niehues² , Huiqing Zhou¹^,³

¹Department of Molecular Developmental Biology, Faculty of Science, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University, Nijmegen, The Netherlands, ²Department of Dermatology, Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, The Netherlands, ³Department of Human Genetics, Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Apresentado aqui é um procedimento stepwise para diferenciação in vitro de queratinócitos primários humanos por inibição de contato seguido de caracterização a nível molecular pela análise de RNA-seq.

Resumo

Os queratinócitos primários humanos são frequentemente usados como modelos in vitro para estudos sobre diferenciação epidérmica e doenças relacionadas. Métodos têm sido relatados para diferenciação in vitro de queratinócitos cultivados em modos submersos (2D) bidimensionais (2D) usando várias condições de indução. Descrito aqui é um procedimento para método de diferenciação de queratinócito in vitro 2D por inibição de contato e subsequente caracterização molecular por RNA-seq. Resumindo, os queratinócitos são cultivados em meio de queratinócito definido complementado com fatores de crescimento até que estejam totalmente confluentes. A diferenciação é induzida por contatos próximos entre os queratinócitos e estimulada pela exclusão dos fatores de crescimento no meio. Utilizando análises de RNA-seq, mostra-se que ambos os queratinócitos diferenciados exibem assinaturas moleculares distintas durante a diferenciação e 2) o padrão dinâmico de expressão genética se assemelha em grande parte às células durante a estratificação epidérmica. Quanto à comparação com a diferenciação normal de queratinócitos, os queratinócitos portadores de mutações do fator de transcrição p63 apresentam morfologia alterada e assinaturas moleculares, consistentes com seus defeitos de diferenciação. Em conclusão, este protocolo detalha as etapas para a diferenciação de queratinócitos in vitro 2D e sua caracterização molecular, com ênfase na análise bioinformática dos dados RNA-seq. Como a extração de RNA e os procedimentos de RNA-seq foram bem documentados, não é o foco deste protocolo. O procedimento experimental de diferenciação de queratinócito in vitro e pipeline de análise bioinformática pode ser usado para estudar eventos moleculares durante a diferenciação epidérmica em queratinócitos saudáveis e doentes.

Introdução

Os queratinócitos primários humanos derivados da pele humana são frequentemente usados como modelo celular para estudar a biologia da epiderme^1,^2,³^,⁴. A estratificação da epiderme pode ser modelada pela diferenciação de queratinócitos, seja de forma monocamada submersa 2D ou no modelo organotípico 3D air-lift^2,^3,^5,⁶^,⁷. Embora os modelos 3D tenham se tornado cada vez mais important....