É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Isolamento de células mononucleares tonsiláres para estudar respostas imunes inatas ex vivo em um tecido linfoide mucosal humano

7.1K vistas

⸱

DOI:

10.3791/60914

⸱

14 de junho de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Virology, Ulm University Medical Center, 2CNRS UMR-8601, Centre Interdisciplinaire Chimie Biologie, 3Team Chemistry & Biology, Modeling & Immunology for Therapy, Université Paris Descartes, 4Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, 5Pediatric Otolaryngology Department, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Université de Paris, Institut Cochin

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

No presente protocolo, explicamos como processar e cultivar facilmente células mononucleares tonsilares de humanos saudáveis submetidos a amidaltomia cirúrgica parcial para estudar respostas imunes inatas após a ativação, imitando infecção viral em tecidos mucosas.

Resumo

Estudar células isoladas de tecidos linfoides associados à mucosa (MALT) permite a compreensão da resposta das células imunes em patologias que envolvem imunidade mucosa, pois podem modelar interações hospedeira-patógeno no tecido. Embora as células isoladas derivadas dos tecidos tenham sido o primeiro modelo de cultura celular, seu uso foi negligenciado porque o tecido pode ser difícil de obter. No presente protocolo, explicamos como processar e cultivar facilmente células mononucleares tonsilares (TMCs) a partir de amígdalas humanas saudáveis para estudar respostas imunes inatas após a ativação, imitando infecção viral em tecidos mucosas. O isolamento das TMCs das amígdalas é rápido, porque as amígdalas mal têm epitélio e produzem até bilhões de todos os principais tipos de células imunes. Este método permite a detecção da produção de citocinas utilizando várias técnicas, incluindo imunoensaio, qPCR, microscopia, citometria de fluxo, etc., semelhante ao uso de células mononucleares periféricas (PBMCs) a partir do sangue. Além disso, os TMCs mostram maior sensibilidade aos testes de drogas do que os PBMCs, que precisam ser considerados para futuros ensaios de toxicidade. Assim, as culturas ex vivo TMCs são um modelo mucosa fácil e acessível.

Introdução

Os estudos sobre órgãos humanos são restritos devido à acessibilidade, bem como razões éticas óbvias. No entanto, eles são essenciais para entender completamente a complexidade da biologia humana. Culturas de células isoladas (culturas primárias ou linhas celulares) são um sistema padrão em estudos de biologia celular devido à sua disponibilidade. Embora culturas celulares isoladas tenham permitido descobertas extraordinárias, o uso de linhas celulares tem se tornado um escrutínio mais aprofundado porque elas não imitam totalmente a biologia de órgãos in vivo. No entanto, a cultura de células tridimensionais ou explantas teciduais é altamente complexa4,,5,6. De fato, um pedaço de tecido ou órgão é altamente heterogênios porque sua composição celular difere dependendo da localização no tecido. Assim, o uso de blocos teciduais requer a análise de muitas réplicas técnicas e biológicas, levando à necessidade de um grande número de doadores ou pacientes.

Os tecidos linfoides associados à mucosa (MALT) são estruturalmente semelhantes aos linfonodos, mas têm funções únicas, pois seu principal papel é regular a imunidade mucosa7. Ao contrário dos linfonodos, que geralmente estão localizados a alguma distância dos tecidos, o MALT geralmente está localizado imediatamente abaixo do epitélio do tecido mucosal. Histologicamente, eles são compostos principalmente de altas concentrações de células B e T, mas também células que apresentam antígenos, como macrófagos e células dendríticas. Malt constituem cerca de 50% do tecido linfoide no corpo humano. Malt são subdivididos em nove grupos, dependendo de sua localização: GALT (intestino),BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (conjuntivista), LALT (laringe-), SALT (pele-), VALT (vulvo-), O-MALT (organizado) e D-MALT (difundido). O O-MALT é composto principalmente pelas amígdalas do anel de amígdalas de Waldeyer e é o MALT8,,9. De fato, as amígdalas localizadas na orofaringe constituem a principal barreira que protege os tratos digestivos e respiratórios dos (potenciais) microrganismos invasivos10. Além disso, as amígdalas são cobertas por um epitélio escânio estratificado estratificado, apoiado por uma cápsula de tecido conjuntivo contendo vasos sanguíneos, nervos e linfáticos, proporcionando fácil acesso às células imunes11,,12. Além disso, a amigdaxia, o ato cirúrgico de remoção de amígdalas, é um procedimento comum realizado em crianças com respiração desordenada do sono, tornando as amígdalas um tecido facilmente disponível13 em ambientes fisiológicos.

As amígdalas permitem o estudo da resposta das células imunes em patologias que envolvem imunidade mucosa. De fato, na infecção pelo HIV, como as amígdalas são compostas por uma alta concentração de células imunes, elas são o principal alvo da replicação viral, mas também produzem uma grande quantidade de citocinas que não são detectadas na circulação14,15. Em estados estáveis, populações raras de células inatas estão presentes em vários tecidos mucosas, incluindo as amígdalas, mas estão essencialmente ausentes do sangue.

Assim, as células mononucleares de amígdalas (TMCs) são um modelo mais relevante e complexo do que os PBMCs e podem responder a perguntas mais profundas. Por outro lado, o uso de explants teciduais pode ser complexo e nem sempre relevante para estudos imunológicos inatas. Assim, estabelecemos um modelo para estudar a ativação imunológica mucosa utilizando TMCs16. Aqui, descrevemos um método para o isolamento eficiente dos TMCs de amígdalas humanas frescas. Este método permite a recuperação de um grande número de células imunes, mantendo sua integridade para estudos ex vivo.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Os espécimes não são coletados especificamente para fins de pesquisa e o estudo não é considerado invasivo. No entanto, a coleta de amígdalas humanas requer aprovação ética das autoridades locais relevantes. No nosso caso, foi aprovado pelo Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Além disso, solicita-se o consentimento de cada paciente ou representante legal para obter dados pessoais dos doadores (por exemplo, sexo, idade, histórico de infecções por ENT) que possam ajudar a interpretar resultados experimentais.

1. Manuseio do tecido tonsilar humano

  1. Coloque amígdalas de cada doador em um frasco estéril de 50 mL contendo 25 mL PBS 1x e transporte à temperatura ambiente (RT) para o laboratório de acordo com as recomendações da autoridade (use três níveis de proteção: frascos, uma caixa de segurança e um saco).
    NOTA: Todo o procedimento deve ser realizado em laboratório de segurança biológica nível 2. Todos os espécimes humanos devem ser tratados com cuidado, pois não foram previamente qualificados e podem conter agentes infecciosos.
  2. Limpe todas as ferramentas entre cada uso.
    1. Após o uso, desmonte o coador celular e mantenha com todos os outros instrumentos (por exemplo, pilão, fórceps) em um banho contendo uma solução de detergente (1/10 detergente de volume em H2O) durante a noite.
    2. Escove cada utensílio para remover o tecido e lave com água limpa.
    3. Seque bem todas as peças, depois prepare o coador de células (85 mL, 37 mm de diâmetro) colocando uma grade de aço de 60 malha em cima de uma grade de aço de 10 malha e feche firmemente o anel.
    4. Coloque todas as ferramentas em sacos estéreis e autoclave.

2. Dissecção do Tecido Tonsilár humano e Isolamento das Células Mononucleares Tonsilares (TMCs)

  1. Coloque o coador de células em um prato de cultura celular de 150 x25 mm 2 (SPL150) e todos os instrumentos em outro SPL150 para mantê-los estéreis.
  2. Transfira as amígdalas do frasco para o coador celular usando fórceps estéreis. Despeje também toda a PBS, que contém algumas células que egressaram as amígdalas. Se necessário, adicione mais PBS para imergir a grade.
    NOTA: O tecido deve ser imerso o tempo todo para evitar a proficação.
  3. Remova tecido cauterizado, ensanguentado e miomado usando fórceps e um bisturi.
    NOTA: Amígdalas retiradas de crianças não precisam dessa etapa.
  4. Corte os tecidos em pequenos pedaços de menos de 0,5 cm de diâmetro usando o bisturi e a pinça curva. Corte todo o tecido para que os pequenos pedaços possam ser imersos o tempo todo.
  5. Coloque alguns pedaços de tecido no coador celular e raspe-os na grade com um pilão de vidro até que apenas uma camada muito fina de estroma branco permaneça. Remova e descarte o estroma para evitar entupir a grade.
  6. Uma vez que todos os tecidos tenham sido espremidos através da grade, use uma pipeta de 10 mL para transferir toda a suspensão da célula para a grade e raspá-la uma última vez.
  7. Transfira a suspensão celular com uma pipeta de 10 mL para um frasco estéril. Lave a grade e o coador de células com PBS 1x. Deixe a suspensão da cela descansar por 5 minutos no RT no banco. Esta etapa permite a precipitação e aglomeração do estroma restante, células mortas e qualquer DNA liberado, e facilitará o próximo passo.
  8. Coloque uma peneira estéril de 70 μm em cima de um novo frasco de 50 mL (retire cuidadosamente do envelope) e transfira suavemente a suspensão da célula para ele com uma pipeta de 10 mL. Não misture a suspensão, pois uma pelota está frequentemente presente. Se a peneira estiver entupida, use a parte de trás de uma ponta de pipeta estéril de 1 mL para arranhar as células da peneira. Troque a peneira quantas vezes for necessário.
  9. Centrifugar as células a 250 x g por 10 min a 4 °C.
  10. Descarte o supernaspe e resuspenque a pelota misturando suavemente o frasco, em seguida, resuspend as células em 35 mL de PBS.
  11. Em um novo frasco, coloque uma nova peneira de 70 μm por cima e transfira a suspensão da célula para ele com uma pipeta de 10 mL. Se a peneira estiver entupida, utilize a técnica detalhada na etapa 2.7.

3. Isolamento dos TMCs por Gradiente de Densidade Celular

NOTA: Os TMCs podem ser usados após a etapa 2.10. No entanto, para obter uma solução celular mais clara e remover outros detritos celulares e quaisquer células vermelhas, é aconselhável realizar um isolamento gradiente de densidade celular das células mononucleares.

  1. Adicione 15 mL do meio gradiente de densidade (d = 1,076 g/mL) em um novo frasco de 50 mL. Despeje a solução TMCs em cima do meio gradiente de densidade, tendo o cuidado de minimizar a mistura da suspensão com o meio gradiente de densidade.
  2. Centrifugar a solução a 1.000 x g por 30 min no RT com aceleração e quebra.
  3. Remova com uma pipeta de 10 mL e descarte a camada superior (contendo principalmente PBS 1x) sem perturbar a interface entre os TMCs e o meio de gradiente de densidade.
    NOTA: Os TMCs contêm um baixo número de eritrócitos, portanto a solução é clara. Assim, a interface entre a solução de TMCs em PBS e o meio gradiente de densidade pode ser difícil de visualizar. Assim, as células podem ser resuspended em RPMI 1640 suplementado com 20 mM HEPES (sem FBS) antes que o gradiente de densidade seja realizado.
  4. Remova os TMCs com uma ponta de pipeta estéril de 1 mL e coloque em um novo frasco de 50 mL.
  5. Lave as células adicionando 50 mL de PBS contendo 2% de soro bovino fetal (FBS) e 2 mM EDTA e centrífugas do tubo a 250 x g por 10 min a 4 °C para remover as plaquetas restantes.
  6. Repita o passo 3.5, mas centrífugue o tubo a 400 x g por 10 min a 4 °C.
  7. Prepare o meio cultura (R10) suplementando rpmi 1640 com FBS inativado por calor de 10%, 2 mM L-glutamina e a solução antibiótica (penicillium de 100 U/mL e 100 μg/mL estreptomicina).
  8. Resuspenque os TMCs em 10 mL de R10 e conte as células. Em média, esta técnica rende 5 x 108-2 x 109 TMCs por par de amígdalas. As células agora podem ser usadas para investigações como PBMCs de sangue inteiro (por exemplo, purificação de tipo celular específico, cultura celular, citometria de fluxo, RT-qPCR, congelamento, etc.).
  9. Se necessário, congele as células para uso adicional usando técnicas padrão para congelamento celular primário.
    1. Conte o número de células.
    2. Centrifugar as células e remover o supernante. Dissolva a pelota em 100% FBS suficientes para uma concentração final de 1 x 108 células/mL, em seguida, adicione o mesmo volume de uma solução de 80% FBS + 20% DMSO. As células estarão em 57 x 107 células/mL. Esta etapa deve ser feita a 4 °C e a solução FBS e DMSO deve ser mantida a 4 °C antes de usar.
    3. Distribua 1 mL da solução celular em criotubos e coloque-os em um recipiente de congelamento lento que esteve a 4 °C durante a noite para controlar a taxa de congelamento celular. Coloque-o a -80 °C.
    4. Para descongelar as células, coloque os criovias em um banho quente a 37 °C por alguns segundos com agitação constante. Assim que as células começarem a descongelar, transfira-as para 49 mL de R10 e centrífuga para remover o DMSO. Conte as células e use-as como PBMCs.
      NOTA: Embora o congelamento e o descongelamento dos TMCs removam os detritos, também danificará alguns tipos de células raras. Se aglomerados ou detritos estiverem presentes após o descongelamento, é melhor passar a suspensão da célula através de uma peneira estéril de 70 μm antes de usá-la.

4. Fenotipagem de TMCs por Citometria de Fluxo

  1. Recupere 5 x 106 células da solução anterior para cada painel de mistura de anticorpos que precisa ser testado e coloque em um tubo de citometria de 5 mL. Recupere 1 x 106 células para o controle não manchado.
  2. Lave as células em PBS e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C. Resuspensá-los em 500 μL de PBS (1 x 106 células/mL) e incubar com uma mancha de viabilidade por 30 min a 4 °C no escuro.
  3. Adicione 5 μL de calor humano inativado ab soro por 100 μL de suspensão celular e incubar por 15 min a 4 °C no escuro.
  4. Lave as células em PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (Wash Buffer) e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C.
  5. Resuspenque os TMCs em 500 μL de Wash Buffer contendo os anticorpos conforme detalhado na Tabela 1. Incubar as células por 30 min a 4 °C no escuro.
  6. Lave as células em Wash Buffer e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C. Resuspentive os TMCs em 500 μL de PBS contendo 0,5% de paraformaldeído (PFA). Mantenha-se no escuro a 4 °C até a aquisição por citometria de fluxo.
    NOTA: PfA é perigoso. Use uma solução comercial pronta para uso para preparar a solução PFA de 0,5%.
AnticorpoCloneFluorochromeEmpresa
Live-DeadBV405ThermoFisher Scientific
CD3SP34-2V500BD Pharmingen
CD8SK1AmcyanBD Pharmingen
CD8BW135/80VioBlueMiltenyi Biotec
CD4RPA-T4PE-Cy7BD Pharmingen
CD45HI30PerCP-cy5.5Bd
CD19HD237EcdBeckman Coulter
CD202H7Alexa Fluor 700BD Pharmingen
CD14M5E2PE-cy7BD Pharmingen
CD14M5E2ApcBD Pharmingen
CD163G8APC-H7BD Pharmingen
CD56MEM188PeBD Pharmingen
CD1237G3PeBD Pharmingen
BDCA-1L161Azul do PacíficoBD Pharmingen
BDCA-3AD5-14H12FITCMiltenyi Biotec
BDCA-4AD5-17F6ApcMiltenyi Biotec
HLA-DRG646-6PerCP-cy5.5BD Pharmingen
CD11c3.9Alexa Fluor 700ebiociências

Tabela 1: Lista de anticorpos para caracterização celular por citometria de fluxo.

5. Exemplo de Ativação de TMCs e Medição da Produção de Citocinas

  1. Diluir os TMCs em meio R10 para obter uma concentração de 2 x 106 células/mL.
  2. Distribua 400.000 TMCs em 200 μL de R10 em uma placa inferior bem redonda de 96.
  3. Para ativar as células, adicione 5 μg/mL do resiquimod agonista TLR7/8 (R848) durante a noite.
  4. Centrifugar as placas e recuperar o supernatante dos TMCs e congelá-lo para análise suplementar. A produção de citocinas será avaliada usando imunoensatórios à base de contas para quantificar várias citocinas solúveis simultaneamente usando um citômetro de fluxo seguindo o protocolo do fabricante.
  5. Avalie a viabilidade das células usando um ensaio de viabilidade celular luminescente seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, adicione 60 μL de solução de viabilidade celular aos poços e meça luminescência dentro de 10 min (aquisição para 1 s/well).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Primeiro caracterizamos o perfil imunológico das células presentes na cultura e analisamos a quantidade de TMCs. Nós fenítipamos os TMCs de amígdalas com citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 1,todos os principais tipos de células imunes presentes em PBMCs do sangue foram representadores nos TMCs das amígdalas. No entanto, nos TMCs a frequência de todos os tipos de células, exceto as células B, foram menores do que em PBMCs.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

As amígdalas humanas representam um modelo ex vivo integrativo e fisiológico para estudar respostas imunes inatas na interface mucosa, pois imitam o papel de um órgão linfoide secundário. Curiosamente, a composição celular dos TMCs é semelhante aos PBMCs e inclui todas as populações de células principais, embora sua porcentagem possa ser diferente das PBMCs do sangue(Figura 1). Populações adicionais também podem ser encontradas, pois todas as respostas imunológicas são iniciadas em tecidos (...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) para os experimentos e bolsa n.b. (AAP 2017 166). A N.S. reconhece o apoio da ANRS para a bolsa (AAP 2016 1), da Organização Europeia de Biologia Molecular EMBO for Fellowship (LT 834 2017), do programa de financiamento de startups "Baustein" da Faculdade de Medicina da Universidade de Ulm (LSBN.0147) e do Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/11).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Grade de aço de 10 malhas - 1910 µ mDutscher198586Para colocar no filtro de células Cellector
60 malhas grade de aço - 230 µ mDutscher198591Para colocar no filtro de células Cellector
70 µ m filtros de células ClearLine brancosDutscher141379C
Anios Excell D detergenteDutscher59852Detergente
Solução antibiótica, 100xThermoFisher 15140122100 U/mL Penicilium e 100 μ g/mL de estreptomicina - para adicionar aos meios de cultura
Tubos de fundo redondo BD FalconTM, tubosBiosciences352063FACS
Filtro de células Cellector, 85 mL e 37 mm de diâmetroDutscher198585
CellTiter-Glo (CTG) Ensaio de viabilidade celular luminescentePromegaG7572
Centrífuga 5810 REppendorf
Tubos cônicos Falcon 50 mLDutscher352070
Pinças curvasDutscher711200
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS)Sigma-AldrichD8537Sem cálcio e magnésio
EnVisionPerkinElmerMede a luminescência
Soro fetal bovino (FBS)Para adicionar aos meios de cultura
Marcadores de fluorescência anticorposConsulte a Tabela 1
Pilão de vidroDutscher198599
Hepes (1 M)Thermo Fisher15630056Uso a 20 mM
Incubadora
LEGENDplex Painel de Resposta Antivírus HumanoBioLegend740390Imunoensaio baseado em grânulos
LymphoprepStemCell7801Gradiente de densidade médio
Mr. Recipiente FrostyThermo Fisher5100-0001Recipiente de congelamento lento
Pierce 16% Formaldeído (p/v), sem metanolThermo Fisher28908
Resiquimod (R848)InvivoGentlrl-r848TLR7/8 agonista
RPMI-1640 PlacaSPL Sigma-AldrichR8758
, 150 mm x 25 mm (SPL150)Dutscher330009
Lâmina cirúrgica estéril N° 23Dutscher132523
UltraComp eBeads Contas de CompensaçãoThermo Fisher01-2222-41
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0ThermoFisher 15575020Para fazer tampão de lavagem em PBS
BD de 5 mL de Cultura de Células Média

Referências

  1. Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
  2. Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
  3. Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
  4. Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
  5. Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
  6. Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013(2018).
  7. Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687(2006).
  8. Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
  9. Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
  10. Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
  11. Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
  12. Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
  13. Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
  14. Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
  15. Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
  16. Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019(2019).
  17. Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678(2013).
  18. Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
  19. Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
  20. Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Isolamento CelularCentrifuga o em Gradiente de DensidadeAn lise por Citometria de FluxoDetec o de Produ o de CitocinasResposta Imune InataCultura Ex VivoProcessamento de Tonsilas HumanasCaracteriza o de C lulas Imunes
Isolamento de células mononucleares tonsiláres para estudar respostas imunes inatas ex vivo em um tecido linfoide mucosal humano
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.