Artigo de método

Análise de defeitos cardíacos congênitos em embriões de camundongos usando métodos histológicos qualitativos e quantitativos

DOI:

10.3791/60926

⸱

10 de março de 2020

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 2Institute for Quantitative Health Sciences and Engineering, Michigan State University

Neste artigo

Resumo

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Neste protocolo, descrevemos procedimentos para analisar qualitativamente e quantitativamente fenótipos de desenvolvimento em camundongos associados a defeitos cardíacos congênitos.

Resumo

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Os defeitos cardíacos congênitos (DCh) são o tipo mais comum de defeito de nascimento em humanos, afetando até 1% de todos os nascidos vivos. No entanto, as causas subjacentes à DCh ainda são pouco compreendidas. O camundongo em desenvolvimento constitui um modelo valioso para o estudo da ChD, porque os programas de desenvolvimento cardíaco entre camundongos e humanos são altamente conservados. O protocolo descreve em detalhes como produzir embriões de camundongos do estágio gestacional desejado, métodos para isolar e preservar o coração para processamento a jusante, métodos quantitativos para identificar tipos comuns de CHD por histologia (por exemplo, septal ventricular defeitos, defeitos septos atrial, patente ductus arteriosus) e métodos quantitativos de histomormormetria para medir fenótipos comuns de compactação muscular. Esses métodos articulam todas as etapas envolvidas na preparação, coleta e análise da amostra, permitindo aos cientistas medir corretamente e reprodutivelmente a CHD.

Introdução

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Os CHDs são o tipo mais comum de defeito de nascimento em humanos e são a principal causa de mortes relacionadas a defeitos congênitos1,2,3,4,5,6. Embora cerca de 90% das crianças recém-nascidas sobrevivam à Dra, ela é frequentemente associada a significativa morbidade e intervenções médicas ao longo dos anos, impondo um fardo pesado na vida dos pacientes e no sistema de saúde7,8,9

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Protocolo

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Todos os animais utilizados nos experimentos mencionados neste artigo foram tratados utilizando as diretrizes de cuidados com animais do Comitê de Cuidado e Uso de Animais Institucionais da Universidade Estadual de Michigan (IACUC).

1. Acasalamento cronometrado de camundongos C57BL6/J para produção de embriões

  1. Uma vez que os camundongos tenham atingido a idade de reprodução (6-8 semanas), coloque-os juntos em formato de reprodução de harém (ou seja, duas fêmeas por um macho). Configurá-los para a reprodução em algum momento da tarde ou da noite.
    NOTA: Os ratos geralmente se reproduzem dentro de 1h depois que as luzes foram desl....

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Resultados

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O índice de compactação muscular foi comparado entre os corações em desenvolvimento em dois ambientes diferentes, um controle e um grupo experimental. Esses protocolos foram utilizados para analisar quantitativamente a compactação do tecido muscular, o que permitiu a análise estatística. A compactação muscular mostrou-se significativamente reduzida nos corações experimentais em relação aos embriões que se desenvolveram em condições não experimentais.

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Discussão

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Este protocolo explora as técnicas envolvidas na análise do desenvolvimento cardíaco em corações embrionários. Algumas limitações deste método são a destreza física necessária para as técnicas preparatórias, que podem exigir prática, e habilidade com imagens de microscópio. Se as fatias obtidas no criostato forem bagunçadas, a coloração de hematoxilina e eosina não será clara, ou se as imagens tiradas no microscópio tiverem pouca iluminação, então o método usado com imagej não funcionará. Uma limitação do recurso de limi.......

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Divulgações

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Os autores não têm divulgações para relatar.

Agradecimentos

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O Aguirre Lab é apoiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute dos Institutos Nacionais de Saúde o número do prêmio K01HL135464 e pela American Heart Association o prêmio número 19IPLOI34660342.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo(s) cônico(s) de 15 mLFisher Scientific# 1495970C
C57BL/6J RatosJackson LabsC57BL/6J - estoque 000664
Frascos de coloração Coplin (x6)VWR Scientific# 25457-006
Coverslips 24X50MM #1.5VWR Scientific# 48393-241
Cryostat - Leica CM3050SLeicaN/A
Prato(s) de DissecaçãoFisherScientific# 50930381
Dumont #5 - Pinça Fina (x2)Ferramentas de Ciência Fina# 11254-20
Solução de Eosina YMillipore Sigma# HT110116-500ML
Álcool Etílico (Puro, 200 provas)Fisher Scientific# BP2818-500
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Millipore Sigma# E9884-100G
EukittMillipore Sigma# 03989-100ML
Tesoura FinaFerramentas de Ciência Fina# 14060-10
Microscópio Estéreo Fluorescente Leica M165 FCLeicaN / A
GlicinaMillipore Sigma# 410225-250G
Graefe FórcepsFerramentas de Ciência Fina# 11052-10
Software Graphpad Prism 8Software Graphpad
ImageJ SoftwareImageJ
KimwipesFisher Scientific# 06666A
Solução de hematoxilina de MayerMillipore Sigma# MHS16-500ML
Ponta(s) de micropipeta - p200Fisher Scientific# 02707448
SoftwareMicrosoft ExcelMicrosoft
OCT CompoundVWR Scientific# 102094-106
Microscópio Olympus CkX53Olympus
(pelo menos 2)
ParaformaldeídoVWR Scientific# 0215014601Faça em solução a 4% (dissolvido em PBS)
Pipeta(s) Pasteur Scientific# 13-711-7M
Penicilina-estreptomicinaThermoFisher Scientific# 15140122
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)ThermoFisher Scientific# 70011044Diluir de 10x a 1x antes de usar
ScaleMettler Toledo# MS1602TS
ScaleMettler Toledo# MS105
Cabo de bisturi #3VWR Scientific# 10161-918
Lâminas de bisturiVWR Scientific# 21909-612
Molde quadradoVWR Scientific# 100500-224Para moldes OCT
SacaroseMillipore Sigma# S9378-500G
Superfrost Plus SlidesFisher Scientific# 1255015
Tesoura CirúrgicaFine Science Tools# 14002-14
Lâminas de micrótomo descartáveis Tissue-Tek Accu-EdgeVWR Scientific# 25608-964
Balança de viagemAcculabVIC 5101
XilenoMillipore Sigma214736-1L
Pincéis

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kathiresan, S., Srivastava, D. Genetics of human cardiovascular disease. Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).
  2. Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72

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