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Análise de defeitos cardíacos congênitos em embriões de camundongos usando métodos histológicos qualitativos e quantitativos

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DOI:

10.3791/60926

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10 de março de 2020

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 2Institute for Quantitative Health Sciences and Engineering, Michigan State University

Autores correspondentes: Aitor Aguirre <aaguirre@msu.edu>

Neste artigo

Resumo

Neste protocolo, descrevemos procedimentos para analisar qualitativamente e quantitativamente fenótipos de desenvolvimento em camundongos associados a defeitos cardíacos congênitos.

Resumo

Os defeitos cardíacos congênitos (DCh) são o tipo mais comum de defeito de nascimento em humanos, afetando até 1% de todos os nascidos vivos. No entanto, as causas subjacentes à DCh ainda são pouco compreendidas. O camundongo em desenvolvimento constitui um modelo valioso para o estudo da ChD, porque os programas de desenvolvimento cardíaco entre camundongos e humanos são altamente conservados. O protocolo descreve em detalhes como produzir embriões de camundongos do estágio gestacional desejado, métodos para isolar e preservar o coração para processamento a jusante, métodos quantitativos para identificar tipos comuns de CHD por histologia (por exemplo, septal ventricular defeitos, defeitos septos atrial, patente ductus arteriosus) e métodos quantitativos de histomormormetria para medir fenótipos comuns de compactação muscular. Esses métodos articulam todas as etapas envolvidas na preparação, coleta e análise da amostra, permitindo aos cientistas medir corretamente e reprodutivelmente a CHD.

Introdução

Os CHDs são o tipo mais comum de defeito de nascimento em humanos e são a principal causa de mortes relacionadas a defeitos congênitos1,2,3,4,5,6. Embora cerca de 90% das crianças recém-nascidas sobrevivam à Dra, ela é frequentemente associada a significativa morbidade e intervenções médicas ao longo dos anos, impondo um fardo pesado na vida dos pacientes e no sistema de saúde7,8,9,10. Fora fatores puramente genéticos, as causas da DCh são mal compreendidas4. As causas não identificadas representam ~56-66% de todos os casos de CHD de acordo com a American Heart Association e outras fontes2,3,4,11. Fatores bem conhecidos incluem mutações genéticas, CNVs, variantes de novo nucleotídeo único e aneuploidia. Suspeita-se que fatores ambientais e dietéticos também sejam fontes importantes que contribuem para a DCH, como sugerem estudos epidemiológicos que ligam o estilo de vida materno2,12, privação econômica e raça13, e por pesquisas sobre fatores dietéticos como o ácido fólico11,14 e o ácido retinóico lipídico bioativo15,16. Investigar os mecanismos e causas da Doença e outros defeitos cardiovasculares é importante para desenvolver estratégias preventivas e novas opções terapêuticas1,4,17,18,19.

O camundongo em desenvolvimento é um modelo fundamental para estudar CHD em mamíferos. No entanto, alguns dos métodos e análises empregados, como dissecções que preservam a morfologia cardíaca, análise de estágios de desenvolvimento e identificação de defeitos associados à ChD, podem ser assustadores para os cientistas que são novos na análise de corações murina. O objetivo dos métodos descritos neste protocolo é oferecer diretrizes qualitativas e quantitativas para esses processos. Assim, neste protocolo explicamos como realizar acasalamentos cronometrados para produzir embriões do estágio gestacional desejado, dissecar fêmeas grávidas para recuperação cardíaca intacta (incluindo tecidos associados, como o trato de saída), fixação cardíaca e preparação para secção criostato, métodos básicos de histologia, análises quantitativas de defeitos cardíacos comuns e análise qualitativa da compactação muscular cardíaca, um fenótipo precursor comum para alguns tipos de CHD.

Protocolo

Todos os animais utilizados nos experimentos mencionados neste artigo foram tratados utilizando as diretrizes de cuidados com animais do Comitê de Cuidado e Uso de Animais Institucionais da Universidade Estadual de Michigan (IACUC).

1. Acasalamento cronometrado de camundongos C57BL6/J para produção de embriões

  1. Uma vez que os camundongos tenham atingido a idade de reprodução (6-8 semanas), coloque-os juntos em formato de reprodução de harém (ou seja, duas fêmeas por um macho). Configurá-los para a reprodução em algum momento da tarde ou da noite.
    NOTA: Os ratos geralmente se reproduzem dentro de 1h depois que as luzes foram desligadas dentro de suas instalações habitacionais. As fêmeas devem ser retiradas da reprodução por volta de 6-8 meses e os machos devem ser usados no prazo superior a 12 meses de idade.
  2. Se usar o método de pesagem para determinar a fertilização, reproduza camundongos em grandes grupos, porque o método de pesagem faz com que o acasalamento cronometrado prossiga em um ritmo mais lento do que os métodos nos quais apenas os plugues de copulação são monitorados.
  3. Na manhã seguinte, verifique se há plugues de cópula entre 8:00 e 12:00. Certifique-se de que isso seja feito nos horários corretos. Se o ensaio do plugue for realizado antes das 8:00, há o risco de que o plugue esteja muito profundo no canal vaginal para ser observado. Se o ensaio do plugue for realizado depois das 12:00, há o risco de o plugue ter caído.
    1. Pegue a fêmea pela base da cauda e investigue a abertura para o canal vaginal com o uso de uma ponta de micropipeta. Um plugue de cópula vai parecer uma barreira mucosa (Figura 1A), que pode ser um pouco difícil de ver em alguns casos. Crustiness também é uma indicação de que um plugue de cópula está ou estava presente. Se não houver barreira mucosa(Figura 1B),então a fêmea provavelmente não acasalou ou o plugue de cópula já pode ter caído.
    2. Consulte a manhã de cópula como e0.5.
      NOTA: Com ratos C57BL6/J, os plugues de cópula podem ser difíceis de identificar. Portanto, às vezes os ratos acasalaram mesmo sem plugue. A copulação nem sempre leva à concepção. Isso é mais provável em ratos C57BL6/J. Portanto, monitore a progressão de peso para confirmar a gravidez (ver etapa 1.4). As pesagens podem ajudar a identificar fêmeas grávidas e confirmar que os plugues levaram à concepção. Tome cuidado ao acasalar fêmeas por noites consecutivas. Se um macho em particular é observado como bom na produção de um plugue de cópula, esse macho pode ser confiável para acasalar por noites consecutivas com a mesma fêmea.
    3. Tenha em mente que as chances de gravidez são maiores com camundongos que são criadores comprovados, pois já foram criados com sucesso antes. Para aumentar as chances de ter criadores comprovados, os machos utilizados não devem ser muito velhos.
  4. Seguindo o ensaio da ficha, pese as fêmeas. Esta pesagem deve ser acompanhada 7-10 dias depois. Se o ganho de peso exceder 1,73 g, então o mouse provavelmente está grávida20. Se o ganho de peso for inferior a 1,73 g, é provável que não esteja relacionado à gravidez e o camundongo deve ser reintroduzido na população reprodutora.
    NOTA: Os camundongos C57BL6/J produzem pequenas ninhadas (cinco a seis embriões em média). Pesar nos métodos para determinar a gravidez são precisos para a maioria. O uso deste método proporciona uma taxa falsa positiva de 12,8% e excluirá 3% das mulheres que estão realmente grávidasde 20anos . Se o pesquisador está preocupado que o tempo gestacional desejado seja posterior, proceda ao passo 1.5
  5. Opcional: No dia em que a dissecção vai acontecer, certifique-se de que a gravidez tenha progredido por inspeção física. Pegue a fêmea pela base da cauda e estique o corpo para fora. Isso é mais fácil de fazer colocando o mouse no pulso e puxando suavemente a base da cauda. Se a fêmea estiver grávida, então provavelmente haverá ganho de peso especificamente no tronco inferior, e aparecerá como pequenos nódulos.
    NOTA: A gravidez pode ser palpável já em 12,5 e será palpável por e14,5 na maioria dos casos. Os camundongos C57BL6/J têm pequenos tamanhos de lixo, portanto a fêmea pode estar grávida mesmo que não haja sinais físicos.

2. Dissecção de fêmeas e embriões para recuperação cardíaca

  1. Antes do início da dissecção, prepare as seguintes soluções à temperatura ambiente.
    1. Dissolver o ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) em solução salina tamponada fosfato (PBS) a uma concentração de 0,5 mM.
      NOTA: Uma vez preparado, é preferível manter a solução no gelo e usá-la apenas a 4 °C. Se a contaminação for uma preocupação, deve ser autoclaved antes de usar.
    2. Dissolver o paraformaldeído (PFA) em PBS em uma concentração de 4%.
      NOTA: Uma vez preparado, é preferível manter a solução no gelo e usá-la apenas a 4 °C. Armazene a 4 °C ou mais frio para armazenamento a longo prazo. A concentração da solução PFA pode variar dependendo das aplicações a jusante das amostras de tecido. Esta porcentagem é usada para coloração de hematoxilina e eosina, imunohistoquímica e coloração imunofluorescente.
  2. Uma vez que a fêmea tenha atingido o estágio gestacional desejado, o camundongo deve ser eutanizado na hora correta do dia de acordo com as diretrizes aprovadas de uso animal. Se os horários forem no meio dia (por exemplo, por exemplo, 15,5) eles devem ser sacrificados perto das 12:00. Se os tempos forem em dias inteiros (por exemplo, 15,0) devem ser sacrificados perto das 12 horas.
    NOTA: Acredita-se que a concepção ocorra perto da meia-noite durante a noite em que os ratos são emparelhados. No entanto, é difícil determinar o tempo exato da concepção. Devido a isso, o tempo é estimado, não exato.
  3. Depois de fixar os quatro membros para baixo, cuidadosamente faça uma incisão em forma de I ao longo do torso, começando ao redor da uretra até o esterno.
  4. O útero provavelmente estará localizado logo acima da região pélvica. O útero do rato tem forma de Y; portanto, provavelmente será muito longo e enrolado em torno do torso. Remova-o levantando-o suavemente. Faça isso usando os lados dos fórceps finos em um movimento de furo. Os tecidos superficiais do útero podem ser agarrados com muito cuidado pelas pontas dos fórceps finos ao retirar inicialmente o útero. Use uma tesoura para cortar o útero do corpo.
    NOTA: Tendo em mente o incomum formato em Y do útero, certifique-se de que todo o útero seja removido.
  5. Mergulhe o útero em PBS gelado. Fixar uma extremidade do útero para baixo e esticá-lo em uma única linha.
  6. Corte o útero em seções, cada seção contendo um embrião separado. Retire suavemente o embrião com fórceps finos. Isso é mais fácil de fazer com um par de fórceps em cada mão. Uma vez removido, coloque o embrião imediatamente em uma nova placa de Petri cheia de solução PBS-EDTA a 4 °C.
    NOTA: A solução PBS normal também pode ser usada, mas o EDTA previne a coagulação nas amostras.
  7. Encere os embriões utilizando o Theiler Staging21. Porque a encenação pode variar entre embriões dentro de uma única ninhada, entoe cada embrião individual.
    NOTA: Isso também pode fornecer previsão para os possíveis defeitos cardíacos congênitos nos embriões. Normalmente, sintomas de um defeito cardíaco congênito podem ser observados na morfologia embrionária. Outros defeitos importantes frequentemente associados a certas condições cardíacas podem estar presentes.
  8. O coração pode ser removido de várias maneiras, dependendo da idade do embrião.
    NOTA: Se não estiver claro se o tratado de saída permanecerá intacto durante a remoção, remova mais tecidos do que apenas o coração (mantendo o trato de saída intacto e minimizando o contato direto entre o coração e os fórceps) ou analise todo o embrião.
    1. Usando um escopo de dissecção e dois pares de fórceps finos, posicione o embrião nas costas e estabilize o acesso ao peito. Isso pode ser feito prendendo os braços com os fórceps ou removendo os braços e segurando o tronco na posição.
    2. Use o ponto afiado de um segundo par de fórceps finos para fazer uma incisão ao longo do esterno do embrião e estender-se entre as clavículas até o umbigo. Comece fazendo incisões muito finas e superficiais enquanto trabalha gradualmente para o interior da cavidade torácica. O coração mal deve se tornar visível. Não entre em contato com os fórceps durante essas incisões superficiais.
    3. Descasque a caixa torácica aberta usando o primeiro par de fórceps para espremer suavemente o tronco do embrião, ligeiramente caudal para a caixa torácica. O coração deve sair ou se tornar aparente. O coração pode precisar de algum persuasão gentil para sair. Use o lado dos fórceps, certificando-se de que o ponto dos fórceps nunca entre em contato com o coração. Para manter o espaço de trabalho e os fórceps limpos, mantenha um lenço livre de fiapos por perto.
    4. Pegue suavemente os vasos sanguíneos pulmonares com as laterais dos fórceps, certificando-se de não cortar o tecido, e puxe o coração para fora da cavidade torácica. Então, limpe o coração.
      NOTA: Para embriões e13,5 e mais jovens o coração é coberto pelo pericárdio. Isto deve ser removido para alcançar o coração.
  9. Usando um estereóscópio, tire uma foto do coração para referência posterior.
  10. Enxágüe os corações na solução PBS-EDTA por 1-2 min e, em seguida, coloque-os em uma solução PFA de 4% por aproximadamente 45-60 min para corrigi-los. Se a análise de todo o embrião for desejada, mergulhe durante a noite. O volume da solução PFA deve ser de 5-6x o volume do tecido que está sendo fixado.
    NOTA: Esse tempo de incubação pode variar dependendo dos estudos posteriores. Este tempo de incubação é usado para coloração de hematoxilina e eosina, imunohistoquímica e coloração imunofluorescente.
  11. Lave 5-10 min com PBS-glicina 3x e coloque de volta na PBS. Azida de sódio ou penicilina/estreptomicina também podem ser adicionadas para minimizar o crescimento bacteriano e preservar tecidos intactos. Os corações agora podem ser armazenados a curto prazo a 4 °C.

3. Preparação de tecidos

NOTA: Os tecidos podem ser preparados usando a incorporação de OCT (temperatura de corte ideal) ou a incorporação de parafina. Há vantagens e desvantagens para qualquer método e o objetivo da análise deve ser considerado na hora de decidir qual método de incorporação deve ser utilizado.

  1. Incorporação de OCT
    NOTA: Este método pode ser preferível à incorporação de formalina/parafina porque criosesses preservam a reatividade do antígeno, ainda podem ser usadas para coloração de hematoxilina e eosina, e produzem fatias mais rapidamente.
    1. Prepare uma solução de sacarose dissolvida em PBS a uma concentração de 30% (c/v).
    2. Transfira os tecidos para um novo tubo cônico de 15 mL ou tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo PBS-30% de sacarose. Inicialmente, o tecido flutuará.
    3. Coloque-o a 4 °C na geladeira. O tecido estará pronto para a incorporação de OCT quando afundar no fundo do tubo, geralmente em 24-40 h.
      NOTA: Os tecidos musculares sofrem significativamente durante os ciclos de congelamento/degelo e perdem sua morfologia nativa. A sacarose é absorvida pelo tecido e funciona como um agente criopreservador que permite uma melhor preservação da morfologia. Certifique-se de que há solução suficiente no tubo para que a flutuação dos tecidos seja suficientemente monitorada. A sacarose-pbs é facilmente contaminada com bactérias, por isso verifique a solução com freqüência para a nebulosidade, o que indica crescimento fúngico ou bacteriano. Para minimizar o risco de contaminação, penicilina/estreptomicina ou azida de sódio podem ser adicionadas à solução PBS-sacarose.
    4. Remova os corações com uma pipeta pasteur, certifique-se de que a abertura da pipeta é larga o suficiente para não rasgar o tecido. Corte a pipeta com uma tesoura, se necessário. Se trabalhar com embriões inteiros, use fórceps para recuperar a amostra.
      NOTA: Faça isso suavemente. Mesmo que a abertura da pipeta seja larga o suficiente para recuperar os corações, as bordas da pipeta ainda podem rasgar os tecidos. Fórceps podem identificar amostras de tecido se usadas de forma muito agressiva.
    5. Deixe brevemente o tecido secar ao ar em um lenço sem fiapos. Coloque a amostra em um molde de ÓCt na posição desejada para corte (ou seja, sagital, transversal, coronal). Adicione o composto OCT até que a amostra esteja completamente submersa, certificando-se de que não há bolhas em contato com o tecido.
    6. Coloque o molde a -20 °C durante a noite ou vários dias e, em seguida, mova o molde para -80 °C. Depois de 24 h o molde está pronto para criosecção. Tecidos nesse formato podem ser armazenados a longo prazo.
  2. Incorporação de Parafina
    1. Com etanol, desidrataos os tecidos nesta sucessão: 50% de etanol por 10 min, 70% de etanol por 10 min, 80% de etanol por 10 min, 95% de etanol por 10 min, 100% de etanol por 10 min (faça isso 3x).
    2. Mergulhe os tecidos em uma série de soluções de etanol/xileno nesta sucessão: solução de etanol/xileno 2:1 para 10-15 min, 1:1 etanol/xileno para 10-15 min, 1:2 solução de etanol/xileno para 10-15 min, 100% xileno para 10-15 min (fazer isso 3x).
    3. Para substituir o xileno por parafina, mergulhe os tecidos em um forno a vácuo (fixado entre 54-58 °C) nesta sucessão: 2:1 solução de xileno/parafina para 30 min, 1:1 solução de xileno/parafina para 30 min, 1:2 solução de xileno/parafina para 30 min, 100% parafina para 1-2 h, 100% parafina para 1-2 h ou durante a noite.
      NOTA: Aquecer os tecidos além de 60 °C por longos períodos de tempo fará com que os polímeros de parafina se degradem e o tecido fique frágil.
    4. Usando parafina fresca, incorpore os tecidos na posição desejada.

4. Secção criostato para tecidos incorporados oct

  1. No criostato, coloque todas as amostras no interior por um mínimo de 1h se as amostras foram previamente armazenadas no congelador -80 °C. Eles devem permanecer lá até que todas as seções tenham sido coletadas.
  2. Certifique-se de que o criostato está configurado nas configurações corretas de temperatura. A temperatura ambiental dentro da câmara criostato deve ser de cerca de -20 °C e o braço do criostato deve estar em cerca de -24 °C.
    NOTA: Esta temperatura pode variar dependendo de como o bloco responde ao corte. Se o corte inconsistente for um problema, a temperatura do ambiente pode ser reduzida.
  3. Remova o bloco OCT de seu molde puxando as bordas do lado aberto do molde para soltá-lo e, em seguida, beliscando o bloco na extremidade fechada, onde o molde se estreita.
  4. Para montar o bloco OCT, coloque a temperatura ambiente OCT no mandril, começando do meio e trabalhando até a borda. O mandril inteiro não precisa ser coberto.
  5. Coloque o bloco OCT (ver passo 3.1) no molde. A borda do bloco que estava contra o lado fechado do molde deve estar virada para cima no mandril. Deixe o OCT no mandril congelar até ficar branco opaco, cerca de 5-10 min.
  6. Coloque o mandril no braço por mais 5-10 min para que o bloco chegue à temperatura do braço. Para obter uma fatia paralela, ajuste o braço até que a borda do bloco fique paralela ao estágio e há uma distância uniforme entre o estágio e a borda inferior do bloco é a mesma que o palco e a borda superior do bloco.
  7. Insira a lâmina e ajuste a distância do bloco da lâmina para fazer as seções.
  8. Pegue fatias em uma espessura de 10 μm. Mantenha o corte até que o ponto de interesse seja atingido manualmente ou usando a função de corte.
  9. Para coletar fatias, use um pincel pequeno e um pincel de detalhes. Quando o molde começar a ser cortado, use o pincel plano para puxar suavemente a fatia contra o suporte. Ao cortar a amostra, o movimento deve ser contínuo e sem pausa, embora a velocidade possa depender da firmeza da amostra.
  10. Ao cortar, use o pincel plano para guiar suavemente a fatia como ela é feita. A fatia não precisa estar alinhada com o estágio neste momento, por isso deixe-a riscar para não causar lágrimas ou puxões e afetar a histologia.
    NOTA: Ao cortar embriões inteiros, esta parte pode ser especialmente difícil, especialmente quando se altera os tipos de tecido. Certifique-se de que as fatias são feitas sem pausas e o pincel não puxa as fatias muito agressivamente. Quando os tipos de tecido mudam, a fatia pode quebrar, por isso manter a temperatura fria é fundamental. Se a quebra for um problema, diminua a temperatura ou aumente a espessura da amostra.
  11. Pause o movimento do bloco uma vez que a amostra esteja completamente cortada, mas a fatia ainda não está livre do bloco. Sem mover o pincel liso da fatia, use o pincel de detalhes para acariciar a fatia para torná-la plana e congelar contra o palco.
  12. Segure a fatia lá por ~10 s antes de remover o pincel de detalhes e terminar a fatia. Use os dois pincéis de tinta para achatar suavemente a fatia contra o palco, evitar qualquer rolamento e segure-a contra o palco por ~20-30 s.
  13. Vire a fatia e achate contra o palco novamente. Mova um slide eletroestático perto o suficiente para que a fatia seja atraída e adere ao slide sem ter que tocar o slide para o palco. Rotular os slides com um lápis.
  14. Armazene os slides em uma caixa hermética para proteger os tecidos do acúmulo de gelo durante o armazenamento. Para armazenamento a curto prazo, os slides devem ser armazenados a -20 °C antes da coloração. Para armazenamento a longo prazo, mantenha-os a -80 °C.

5. Secção de microtome para tecidos embutidos de parafina

  1. Coloque os blocos no gelo antes da secção para esfriar as amostras. Quando legal, a parafina corta mais facilmente e pode produzir fatias mais finas.
  2. Prepare um banho de água de 40-45 °C usando água ultrapura.
  3. Coloque a lâmina no suporte dentro do microtomo. Certifique-se de que está seguro e, em seguida, defina o ângulo de desembaraço. Certifique-se de que o ângulo de folga está correto. Isto pode ser verificado seguindo as instruções do fabricante.
  4. Coloque o bloco de parafina no microtome. Certifique-se de que está corretamente orientado para que a lâmina corte diretamente através do bloco.
  5. Certifique-se de que a lâmina está orientada corretamente com o bloco, fazendo algumas fatias. Faça isso com cuidado para que ajustes possam ser feitos.
  6. Corte o bloco até que o ponto de interesse seja atingido.
  7. Faça fatias na espessura desejada. Leve em conta que as primeiras fatias provavelmente serão descartadas.
  8. Pegue as seções e mova-as para o banho de água usando fórceps. Isso deve fazer com que as seções se achatem. Use os fórceps para ajustá-los conforme necessário.
  9. Mova um slide eletroestático perto o suficiente para que a fatia seja atraída e adere ao slide. Rotular os slides com um lápis.
  10. Coloque todos os slides coletados em um rack de slides. Deixe os slides secarem durante a noite a 37 °C.

6. Deparafinação de tecidos

  1. Lave os slides na seguinte sequência: 3 min em xileno (2x), 3 min em uma solução de xileno/100% etanol, 3 min em 100% etanol (2x), 3 min em 95% etanol, 3 min em 70% etanol, 3 min em 50% de etanol.

7. Coloração de hematoxilina e eosina

  1. Prepare as lâminas para coloração.
    1. Se usar tecidos preparados para OC, mergulhe em água destilada por ~4 min até que o OCT seja dissolvido e deixe secar.
    2. Se usar tecidos embutidos de parafina, eles devem ser deparafinados. Veja o passo 6.1.
  2. Coloque o slide em hematoxilina filtrada de 0,1% por 10 min. Coloque o escorregador em água destilada, trocando a água 1x imediatamente e depois novamente após 3 min.
  3. Coloque o slide em 0,5% de eosin a 10 s ou mergulhe 12x. Mergulhe o escorregador em água destilada até que o eosinnão estique mais, cerca de 2-3 mergulhos.
  4. Desidrate o slide de molho em 50% de etanol para 10 s, 75% de etanol para 10 s, 95% de etanol para 30 s e 100% de etanol por 1 min. Mergulhe em xileno até que o xileno saia suave, ~5-7 mergulhos.
  5. Deixe o xileno evaporar e montar com um meio de montagem de secagem rápida que tenha um índice de refração próximo ao vidro.

8. Análise qualitativa de defeitos cardíacos comuns

  1. Tire imagens de todas as amostras usando um microscópio invertido ou estéreo e sua respectiva câmera. Pegue imagens macroscópicas e microscópicas, dependendo dos tipos de defeitos analisados. Imagens macroscópicas podem ser tiradas com qualquer ampliação abaixo de 10x. Imagens microscópicas devem ser tiradas em ampliação de 40x ou superior. As fotos tiradas neste papel foram tiradas com ampliação de 5x usando um microscópio estéreo e um objetivo de ar de 40x (lente N.A. de 0,55) usando um microscópio invertido.
    NOTA: As imagens macroscópicas são um bom ponto de partida porque proporcionam uma visão de todo o coração(Figura 3). À medida que os padrões se identificam, áreas específicas podem ser focadas e investigadas posteriormente.
  2. Alinhá-lo todas as imagens lado a lado em uma tela de computador. Tenha todas as imagens de amostras de controle em um lado da tela e todas as imagens de amostras experimentais do outro lado da tela. É melhor analisar um grupo de tratamento de cada vez.
  3. Procure diferenças nos fenótipos entre os grupos de tratamento, começando em áreas-chave onde ocorrem defeitos cardíacos comuns. Isso vai variar dependendo se as imagens são macroscópicas, que retratam anatomia bruta do coração, ou microscópica, que retratam anatomia microscópica do tecido cardíaco.
  4. Comece a procurar defeitos cardíacos macroscópicos comuns, como defeitos septos ventriculares(Figura 2A),defeitos septos atrial(Figura 2B)e patente ductus arteriosus(Figura 2C). Todos esses defeitos são mais facilmente vistos na visão transversa do coração.
  5. Para identificar defeitos septos, considere olhar para múltiplas fatias, pois elas podem ser observadas em um plano do tecido e não em outro.
    NOTA: Às vezes, um defeito não é a falta de um septo, mas um buraco no septo. Portanto, preste atenção para não confundir uma lágrima com um defeito septo. Procurar consistências entre fatias próximas em uma região específica pode confirmar se isso é realmente um defeito ou uma ruptura de corte.
  6. Para identificar defeitos no ramo de saída, como a patente ductus arteriosus, use várias fatias para seguir os principais vasos sanguíneos à medida que saem do coração. Criar uma imagem dos principais vasos sanguíneos em relação um ao outro. Um exemplo é destaque na Figura 2C.
    NOTA: Algumas irregularidades podem ser decorrentes do estágio de desenvolvimento de um embrião (por exemplo, a patente ductus arteriosus fecha no pós-natal, logo após o nascimento; o septo ventricular não fecha completamente até ~e14.5). Alguns outros defeitos cardíacos macroscópicos comuns que não estão incluídos nas figuras incluem truncus atereriosus persistentes, que podem ser detectados mais facilmente em e16,5 e posteriores; ventrículo direito de saída dupla (DORV), que pode ser detectado em fatias nas quais o coração entra no trato de saída; e uma aorta predominante22. Um defeito cardíaco microscópico comum inclui diminuição da compactação muscular(Figura 4).

9. Análise quantitativa da compactação muscular cardíaca utilizando tecidos hematoxilin oseinos

  1. Utilizando a visão macroscópica das amostras de tecido manchado(Figura 4A),identifique uma região de interesse para a imagem em uma ampliação de 40x(Figura 4B). Para este papel, foi utilizada a parede do ventrículo esquerdo. Salve a imagem no formato desejado. Para este artigo, as imagens foram salvas como arquivos .tif.
  2. Abra a imagem no software ImageJ.
  3. Defina a imagem como 8 bits. Isso permite que a imagem utilize a ferramenta limiar na próxima etapa23,24. Para isso, selecione "Image | Tipo | 8 bits".
  4. Defina o limiar da foto. O objetivo desta etapa é selecionar apenas os pixels que representam o fundo, excluindo os pixels que representam os tecidos23,24.
    NOTA: Esta área de superfície será subtraída mais tarde. Um limiar correto selecionará os pixels que o pesquisador deseja excluir da área da superfície do tecido muscular. Portanto, o resultado final deve incluir o tecido em escala de cinza e o fundo será selecionado.
    1. Clique em "ImageJ | Imagem | Ajuste | Limiar". Mova a barra superior para fazer ajustes de limiar. Feche a janela de ajustes de limiar sem fazer outras alterações uma vez que as seções desejadas sejam selecionadas21.
  5. Use a ferramenta Seleções de Polígono para selecionar o espaço que o tecido ocupa. Certifique-se de que os contornos rastreiem as bordas do tecido, pois os traçados soltos fornecerão medidas falsas.
  6. Ajuste as configurações de medição no ImageJ para que o software mede apenas a área de pixels que foram selecionados usando a ferramenta limiar na etapa 9.423. "ImageJ | Analisar | Definir medidas | Área e Limite ao Limite". Selecione apenas Área e Limite para Limite.
  7. Meça a área dos pixels destacados. "ImageJ | Analisar | Medir". Esse valor representa a área do espaço negativo.
  8. Meça a área de toda a região de interesse. Esta é a área que foi selecionada usando a ferramenta Seleções de Polígono. "Imagem J | Analisar | Definir medidas | Área". Selecione apenas Área e desmarque Limite para Limite. Em seguida, meça, selecionando "Image J | Analisar | Medir".
  9. Calcule a área que o tecido muscular real está ocupando dentro da região de interesse. Subtraia a área do espaço negativo da área de toda a região de interesse. Este valor é a área do tecido muscular.
  10. Calcular o Índice de Compactação Muscular (IMC). Divida a área do tecido muscular pela área da região de interesse.
    Fórmula do Índice de Compactação Muscular; razão entre a área do tecido muscular e a área da região de interesse, equação.
    Quanto maior o valor do MCI, mais compactado é o músculo. Esses valores de IMC podem então ser utilizados para análise estatística para testar alterações significativas na compactação muscular entre os grupos de tratamento (Figura 4C).

Resultados

O índice de compactação muscular foi comparado entre os corações em desenvolvimento em dois ambientes diferentes, um controle e um grupo experimental. Esses protocolos foram utilizados para analisar quantitativamente a compactação do tecido muscular, o que permitiu a análise estatística. A compactação muscular mostrou-se significativamente reduzida nos corações experimentais em relação aos embriões que se desenvolveram em condições não experimentais.

Os embriões foram descartados se o tempo de observação parecesse impreciso. Embora o crescimento atrofiado dos embriões possa ser resultado do tratamento do experimento, e há uma amplitude no progresso do desenvolvimento, a reprodução foi espaçada o suficiente para garantir o tempo de desenvolvimento dos embriões. A encenação dos embriões foi feita utilizando-se a Encenação21do Theiler . As amostras foram consideradas mal cortadas se as fatias não refletissem consistência ou se tivessem lágrimas ou dobras óbvias. A coloração forneceu contraste suficiente para fazer as bordas do tecido, mas não era tão escura a fim de tornar as características das células indistinguíveis. Slides foram então imagemcom um microscópio invertido com um objetivo de 40x. Os valores do MCI foram calculados usando o software ImageJ e o Microsoft Excel. Esses valores de IMC foram analisados por meio de teste T.

Exame genital de camundongo, diagrama experimental; manuseio de amostras, configuração de pesquisa de laboratório.
Figura 1: Os resultados do ensaio de plugue em ratos C57BL6/J. (A)Um rato com um plugue de cópula facilmente identificável. (B) Um rato sem plugue de cópula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diagrama de cardiopatia congênita; defeitos septais, conexões das câmaras cardíacas, estágios de desenvolvimento.
Figura 2: Defeitos cardíacos comuns. Esquemas da verdadeira morfologia antecipada de um defeito cardíaco congênito. (A)Visão transversal de um defeito septo ventricular. (B) Visão transversal de um defeito septal atrial. (C) Patente ductus arteriosus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Corte histológico do tecido cardíaco; imagem microscópica; estrutura cardíaca; análise histológica.
Figura 3: Hematoxilina e eosina de e15,5 corações. (A)Um coração manchado que se desenvolveu em condições normais. Barra de escala = 750 μm.(B) Um coração manchado que se desenvolveu em condições experimentais. Barra de escala = 750 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Comparação histológica cardíaca com controle vs. AFE(-); inclui imagens de microscopia e análise de gráfico de caixa MCI.
Figura 4: Análise quantitativa da compactação muscular entre corações que se desenvolveram dietas maternas normais e corações que se desenvolveram dietas maternas deficientes em ácidos graxos essenciais. (A)Hematoxilina e eosina mancharam corações em uma visão macroscópica (5x). Barras de escala = 1.000 μm.(B) Hematoxilina e eosina mancharam corações em vista microscópica (40x). Barras de escala = 75 μm.(C) Os dados resultantes das medições do Índice de Compactação Muscular. Os valores foram analisados por meio de teste T (n = 4 por grupo de tratamento). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este protocolo explora as técnicas envolvidas na análise do desenvolvimento cardíaco em corações embrionários. Algumas limitações deste método são a destreza física necessária para as técnicas preparatórias, que podem exigir prática, e habilidade com imagens de microscópio. Se as fatias obtidas no criostato forem bagunçadas, a coloração de hematoxilina e eosina não será clara, ou se as imagens tiradas no microscópio tiverem pouca iluminação, então o método usado com imagej não funcionará. Uma limitação do recurso de limiar do software ImageJ é que ele seleciona pixels localizados em uma extremidade de um limiar dependente do valor de pixel. Portanto, todos os pixels existentes no lado errado do limiar serão incluídos incorretamente ou excluídos no cálculo. Em última análise, a solução de problemas será necessária para a adoção dos protocolos de uso em um estudo.

Caso a extração cardíaca seja muito difícil, considere pular para o passo 2.8. Além disso, considere remover mais do que apenas o coração e os pulmões da cavidade torácica. O alvo torna-se maior e mais fácil de manipular, e o contato direto entre o coração e os fórceps finos é minimizado. Quando a secção criostato, as amostras experimentais serão sempre diretamente comparadas com amostras de controle. Isso permite algum espaço para erro do usuário, desde que o erro seja consistente em todas as amostras. Para minimizar o erro do usuário e evitar resultados falsos, certifique-se de que seções comparáveis sejam obtidas de ambos os grupos de tratamento. Por exemplo, se mais de uma pessoa estiver produzindo seções, certifique-se de que um indivíduo produza um número uniforme de seções para controles e todos os grupos de tratamento, e não apenas um subgrupo. Por fim, ao limiarizar imagens no ImageJ, a ferramenta limiar é usada para permitir a máxima liberdade na seleção de pixels que representam tecido e pixels que não o fazem. Se necessário, ajuste o contraste das imagens para intensificar ainda mais o valor de pixel do fundo a partir do valor de pixel do tecido. Embora existam opções de solução de problemas, as técnicas ainda requerem um alto grau de habilidade. No entanto, a realização deste protocolo proporciona acesso a dados que normalmente não são medidos em outros estudos de desenvolvimento cardíaco. Assim, a utilização de características deste protocolo pode contribuir significativamente para uma investigação científica.

Identificar os impactos dos tratamentos experimentais na pesquisa em cardiologia muitas vezes é investigado através da avaliação da morfologia. Este é especialmente o caso da biologia do desenvolvimento, em que a placenta dificulta a mensuração de características fisiológicas do desenvolvimento de corações. Portanto, a análise morfológica que permite uma visão da função do coração muda drasticamente a trajetória da pesquisa de biologia do desenvolvimento. Embora a maioria dos artigos analise a espessura do músculo cardíaco para determinar a força do coração, a medição direta da compactação muscular poderia fornecer uma visão mais aprofundada da fisiologia do coração mamífero em desenvolvimento25,26,27.

Divulgações

Os autores não têm divulgações para relatar.

Agradecimentos

O Aguirre Lab é apoiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute dos Institutos Nacionais de Saúde o número do prêmio K01HL135464 e pela American Heart Association o prêmio número 19IPLOI34660342.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo(s) cônico(s) de 15 mLFisher Scientific# 1495970C
C57BL/6J RatosJackson LabsC57BL/6J - estoque 000664
Frascos de coloração Coplin (x6)VWR Scientific# 25457-006
Coverslips 24X50MM #1.5VWR Scientific# 48393-241
Cryostat - Leica CM3050SLeicaN/A
Prato(s) de DissecaçãoFisherScientific# 50930381
Dumont #5 - Pinça Fina (x2)Ferramentas de Ciência Fina# 11254-20
Solução de Eosina YMillipore Sigma# HT110116-500ML
Álcool Etílico (Puro, 200 provas)Fisher Scientific# BP2818-500
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Millipore Sigma# E9884-100G
EukittMillipore Sigma# 03989-100ML
Tesoura FinaFerramentas de Ciência Fina# 14060-10
Microscópio Estéreo Fluorescente Leica M165 FCLeicaN / A
GlicinaMillipore Sigma# 410225-250G
Graefe FórcepsFerramentas de Ciência Fina# 11052-10
Software Graphpad Prism 8Software Graphpad
ImageJ SoftwareImageJ
KimwipesFisher Scientific# 06666A
Solução de hematoxilina de MayerMillipore Sigma# MHS16-500ML
Ponta(s) de micropipeta - p200Fisher Scientific# 02707448
SoftwareMicrosoft ExcelMicrosoft
OCT CompoundVWR Scientific# 102094-106
Microscópio Olympus CkX53Olympus
(pelo menos 2)
ParaformaldeídoVWR Scientific# 0215014601Faça em solução a 4% (dissolvido em PBS)
Pipeta(s) Pasteur Scientific# 13-711-7M
Penicilina-estreptomicinaThermoFisher Scientific# 15140122
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)ThermoFisher Scientific# 70011044Diluir de 10x a 1x antes de usar
ScaleMettler Toledo# MS1602TS
ScaleMettler Toledo# MS105
Cabo de bisturi #3VWR Scientific# 10161-918
Lâminas de bisturiVWR Scientific# 21909-612
Molde quadradoVWR Scientific# 100500-224Para moldes OCT
SacaroseMillipore Sigma# S9378-500G
Superfrost Plus SlidesFisher Scientific# 1255015
Tesoura CirúrgicaFine Science Tools# 14002-14
Lâminas de micrótomo descartáveis Tissue-Tek Accu-EdgeVWR Scientific# 25608-964
Balança de viagemAcculabVIC 5101
XilenoMillipore Sigma214736-1L
Pincéis

Referências

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