Artigo de método

Identificação de campo de matricaria chamomilla usando um sistema portátil qPCR

DOI:

10.3791/60940

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10 de outubro de 2020

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1Herbalife NatSource (Hunan) Natural Products Co., Ltd., 2Corporate Quality Laboratory, Herbalife International of America, Inc., 3Corporate Quality, Herbalife International of America, Inc., 4Hyris Ltd, 5Natural Health Product Research Alliance, University of Guelph

Neste artigo

Resumo

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Apresentado aqui é um protocolo para identificação de campo de Matricaria chamomilla usando um sistema portátil qPCR. Este protocolo de fácil desempenho é ideal como um método para confirmar a identidade de uma espécie botânica em locais onde o acesso a equipamentos de laboratório e expertise é limitado, como fazendas e armazéns.

Resumo

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O controle de qualidade em produtos botânicos começa com o fornecimento de matérias-primas. Tradicionalmente, a identificação botânica é realizada por meio de avaliação morfológica e métodos analíticos químicos. No entanto, a falta de disponibilidade dos botânicos, especialmente nos últimos anos, aliada à necessidade de melhorar o controle de qualidade para combater as tensões na cadeia de suprimentos trazidas pelo aumento da demanda dos consumidores e das mudanças climáticas, exige abordagens alternativas. O objetivo deste protocolo é facilitar a identificação de espécies botânicas utilizando um sistema portátil qPCR no campo ou em qualquer ambiente, onde o acesso a equipamentos de laboratório e perícia é limitado. O DNA alvo é amplificado usando qPCR à base de corante, com DNA extraído de materiais de referência botânica servindo como um controle positivo. O DNA alvo é identificado por sua amplificação específica e corresponde ao seu pico de fusão com o controle positivo. Uma descrição detalhada das etapas e parâmetros, desde a coleta de amostras de campo prático até a extração de DNA, amplificação do PCR, seguida de interpretação de dados, foi incluída para garantir que os leitores possam replicar este protocolo. Os resultados produzidos estão alinhados com os métodos tradicionais de identificação botânica laboratorial. O protocolo é fácil de executar e econômico, permitindo testes de qualidade em matérias-primas o mais próximo possível do ponto de origem da cadeia de suprimentos.

Introdução

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A prática de usar botânicos para manter e melhorar a saúde remonta a milhares de anos. Devido às tensões na cadeia de suprimentos trazidas pelo aumento da demanda do consumidor1, práticas de colheita insustentáveis e mudanças climáticas2, a adulteração botânica está se tornando uma preocupação crescente na indústria de suplementos alimentares ealimentares 3. A presença de espécies botânicas não declaradas ou mal identificadas pode levar a uma eficácia reduzida, ou mesmo questões de segurança. Por exemplo, o cohosh preto (Actaea racemosa), usado para tratar o desconforto pré-menstrual, pode ser substituído por uma espécie asiática de baixo preço com suporte de dados clínicos limitados para sua eficácia4. Em um caso mais grave, a substituição de Aristolochia fangchi por Stephania terandra em um estudo clínico para perda de peso usando ervas chinesas levou a nefrotoxicidade grave e insuficiência renal em alguns participantes5,6. As duas espécies diferentes compartilhavam um nome comum chinês "Fang Ji". Esses casos destacam a necessidade de um controle de qualidade mais rigoroso, a começar pela identificação de matérias-primas7, preferencialmente o mais próximo possível do ponto de origem da cadeia de suprimentos, para que os recursos possam ser alocados de forma eficiente ao material de identidade correta.

Uma série de abordagens ortogonais podem ser usadas para identificação botânica. Tradicionalmente, a identificação botânica é realizada por meio da avaliação morfológica8,,9 e dos métodos analíticos químicos10,,11,,12,,13. A identificação morfológica baseia-se em diferenças nas características macroscópicas e microscópicas dos materiais vegetais se houver diferenças(Figura 1). No entanto, a falta de programas de treinamento sobre botânica clássica nos últimos anos resultou na escassez de especialistas14, tornando essa abordagem impraticável para o controle de qualidade de rotina. Sua aplicação em materiais botânicos em pó também é limitada. Métodos analíticos químicos são amplamente utilizados em farmacocopoeias e laboratórios, mas não são ideais para testes de campo devido ao tamanho de instrumentos como Cromatografia de Camada Fina de Alto Desempenho (HPTLC), Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) e Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (NMR)(Figura 2),e requisitos ambientais. Recentemente, os métodos genômicos surgiram como uma técnica alternativa para a autenticação e detecção de substituição das espécies botânicas e provaram ser eficientes e precisos. Métodos genômicos exploram a alta fidelidade e especificidade das informações genéticas em materiais vegetais15,,16,,17,18,,19. Ferramentas de diagnóstico molecular estão disponíveis na forma de dispositivos portáteis, e muitas vezes incluem ferramentas automatizadas de interpretação de dados que reduzem a barreira ao uso da tecnologia, tornando esta abordagem ideal para identificação de campo20,21,,22,,23,24. Uma vez que o método de análise molecular tenha sido projetado e validado25,,26,27, ele pode ser realizado por qualquer pessoal com treinamento básico de biologia molecular. Entre as diferentes ferramentas portáteis disponíveis, o PCR em tempo real em sequências de DNA é uma das opções econômicas28. A combinação de um dispositivo portátil, juntamente com análise molecular personalizada e validada, permite a verificação de espécies botânicas e ingredientes fora do laboratório, como em fazendas e armazéns de materiais botânicos, reduzindo o tempo e os custos associados aos métodos tradicionais.

O objetivo deste protocolo é introduzir um método de identificação botânica em situações em que o acesso a equipamentos de laboratório e perícia seja limitado ou indisponível, utilizando um sistema portátil qPCR. O método é demonstrado em um campo de matricaria camomila (Figura 3A), comumente conhecida como camomila alemã, amplamente utilizada para suas propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes29. Pode ser confundido com espécies relacionadas de aparência ou odor semelhantes, especialmente dos gêneros Chamaemelum, Tanacetume Crisântemo30,31,32. Entre as espécies relacionadas, Chamaemelum nobile, também conhecida como camomila romana, é uma perceptível com níveis de produção comparáveis no comércio(Figura 3B). O método demonstrado foi projetado para identificar não apenas a espécie botânica alvo M. chamomilla,mas também detectar seu parente próximo, C. nobile,com base na amplificação específica das sequências de DNA.

Este artigo explica, em detalhes, como realizar a identificação botânica de campo de M. chamomilla usando análise de curva baseada em corante intercalante e derretimento em um dispositivo portátil. O protocolo inclui a coleta de amostras botânicas do campo, extração de DNA no local e configuração de reação pcr em tempo real. Para garantir uma conclusão válida, o alvo botânico M. chamomilla e DNA genômico c. nobile botânico não-alvo, pré-extraído de materiais de referência botânica certificados, são usados como controle positivo. A especificidade deste método é demonstrada pela realização de testes de identificação de M. chamomilla e C. nobile individualmente em amostras e controles. O controle negativo não-modelo é usado para excluir resultados falsos positivos causados pela contaminação por PCR.

Protocolo

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1. Coleta de amostras

  1. Configure uma área de teste no campo com uma superfície plana e horizontal.
  2. Identifique uma planta representativa que reflita as características da maioria das plantas no campo de flores de camomila(Figura 4).
  3. Escolha uma cabeça de flor da planta representativa usando luvas estéreis.
  4. Coloque a amostra em um tubo de coleta de 2,0 mL.
  5. Repita as etapas 1.3 a 1.4 e colete um folheto (aproximadamente 0,5-0,7 cm de comprimento) da mesma planta.
    NOTA: M. flor de camomila e folha são pequenas o suficiente para sentar-se no fundo de um tubo de coleta de 2,0 mL. Para outros botânicos com maior área de superfície, um soco de papel ou uma tesoura (enxaguado em 70% de etanol antes do uso) pode ser usado para isolar amostras de tecido para testes. Quando for necessária uma amostragem múltipla, enxágue o soco de papel ou a tesoura entre o manuseio de diferentes amostras.

2. Extração de DNA

  1. Pré-aqueça a incubadora de banho seco a 95 °C.
  2. A cada tubo de coleta, adicione 100 μL da solução de extração do kit de extração de DNA da planta (listado em Tabela de Materiais). Para melhor eficiência de extração de DNA, triture a amostra de tecido na solução de extração usando um pilão tecidual.
  3. Feche o tubo. Certifique-se de que o tecido botânico esteja coberto com a solução de extração durante todo o processo de extração.
  4. Coloque os tubos de coleta em uma incubadora de banho seco pré-aquecido e incubar os tubos de coleta a 95 °C por 10 minutos.
  5. Depois de 10 minutos, tire os tubos da incubadora de banho seco.
  6. Adicione 100 μL da solução de diluição do mesmo kit de extração de DNA e misture a solução pipetando para cima e para baixo várias vezes.
  7. Repita o mesmo passo para extração de folhetos.
  8. Agite para misturar ainda mais a solução. O tecido vegetal geralmente não parece estar degradado após este tratamento. A cor líquida pode mudar e ficar nublada.
    NOTA: A solução diluída pode ser armazenada à temperatura ambiente durante a noite se não prosseguir imediatamente. Não é necessário remover os detritos celulares do tecido vegetal antes do armazenamento. O líquido nos tubos contém os modelos de DNA para amplificação pcr a jusante.

3. Configuração de reação do PCR

  1. Configure as condições de termociclismo do instrumento qPCR de acordo com as especificações do fabricante. Aplique o perfil termociclístico PCR listado na tabela1, que começa com um passo de temperatura constante para a desinaturação inicial, seguido por 25 ciclos de amplificação, e termina com rampa de temperatura para obter uma curva de fusão de alta resolução.
  2. Descongele o qPCR Master Mix e os primers(Tabela 2) à temperatura ambiente antes de usar.
  3. Planeje a reação que será carregada em cada poço: poços contendo controle positivo com espécies-alvo, controle positivo com espécies não-alvo, amostras e controle negativo(Figura 5).
    1. Neste exemplo, são utilizados dez poços – cinco para o teste alemão de identificação de camomila e os cinco restantes para o teste de identificação de camomila romana. Para cada tipo de teste de identificação de espécies, um poço contém controle positivo com DNA extraído do material de referência da espécie alvo, um bem contém controle positivo com DNA extraído de material de referência de espécies não-direcionadas, dois poços são preenchidos com amostras de DNA de flores e folhas extraídas do campo, e um poço é alocado para um controle negativo. A Tabela 3 descreve cada tipo de poço.
  4. Prepare uma mistura de mestre de reação de acordo com o manual para cada teste de identificação de espécies botânicas. Uma mistura mestra de reação típica contém mix master universal qPCR (2x), primers específicos para espécies avançadas e invertidas e água sem nuclease. A Tabela 4 lista a composição do sistema de reação.
    NOTA: Se não estiver usando imediatamente, armazene a reação qPCR master-mix em +2 °C a +8 °C em um refrigerador ou mini geladeira.
  5. Misture bem a reação master-mix por pipetação antes de usar.
  6. Coloque o cartucho qPCR de frente para cima em uma superfície plana e estável.
  7. Carregar 18 μL da reação master-mix configurada na etapa 3.4 nos poços do cartucho de acordo com os poços definidos na etapa 3.3. Para esta demonstração, adicione a mistura mestre de reação de teste de identificação de camomila alemã em poços rotulados para teste GC (GCT nos poços 1, 3, 5, 7, 9) e a reação do teste de camomila romana em poços rotulados para teste RC (RCT nos poços 2, 4, 6, 8, 10) (ver Figura 5).
  8. Transferir 2 μL de DNA amostral do supernascido dos tubos de extração de DNA e controles positivos de DNA pré-extraídos em poços de cartuchos pré-carregados com mistura mestre qPCR. Depois de adicionar cada modelo de DNA à mistura mestre qPCR, misture suavemente a solução por pipetação.
    NOTA: Evite detritos celulares flutuantes ao transferir DNA do tubo de extração de DNA. Use minicentrifuge para separar os detritos supernacantes e celulares, se necessário.
  9. Sele cuidadosamente o cartucho com filme adesivo. Coloque o cartucho na câmara de termociclismo e feche-o.
  10. Defina o instrumento qPCR para executar.

Resultados

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Seguindo o protocolo descrito na seção 1, o DNA botânico da cabeça e da folha de flores foram extraídos no sobrenante após a incubação térmica do tubo de coleta a 95 °C por 10 minutos. No presente estudo, o supernasciente mostrou uma cor amarela e esverdeada tanto para flor quanto para folha, indicando que uma variedade de compostos naturais foram liberados no sobrenante com DNA botânico(Figura 6). Embora a amplificação confiável do PCR tenha sido alcançada posteriormente em triplicado para todos os modelos de DNA extraídos em campo, a avaliação da qualidade do DNA foi realizada em laboratório como referência. A concentração do extrato de DNA da cabeça da flor, determinada pela fluorometria, variou de 3,69 a 5,36 ng/μL, enquanto a concentração de extrato de DNA da folha variou de 6,42 a 9,29 ng/μL. As razões de absorção A260/A280 e A260/A230 de extratos de DNA de flores e folhas foram medidas por espectrofotometria. No entanto, devido à sobreposição entre DNA e espectro de absorção UV fitoquímico, essas proporções não poderiam ser medidas de confiabilidade (dados não mostrados).

O corante fluorescente intercalante foi usado para monitorar a amplificação de fragmentos de alvo em tempo real. Uma vez que ambos os primers específicos M. camomila e C. nobile têm como alvo a região do espaçador transcrito interno 2 (ITS2), que tem dezenas a centenas de cópias no genoma da planta, 25 ciclos de amplificação pcr são suficientes para gerar amplicons suficientes para a identificação de espécies de camomila. Na Figura 7, o valor da tomografia para o controle positivo de M. chamomilla no teste de identificação de M. camomila foi inferior a 25 (GCP_GCT), enquanto após 25 ciclos de amplificação, a fluorescência do mesmo controle no teste de identificação de C. nobile ficou abaixo do limiar de detecção (GCP_RCT). Por outro lado, após 25 ciclos, a fluorescência para controle positivo de C. nobile no teste de identificação de M. chamomilla ficou abaixo do limiar de detecção (RCP_GCT), enquanto o valor do TC para o mesmo controle no teste de identificação de C. nobile foi inferior a 25 (RCP_RCT). A amplificação dos controles positivos de alvo e não-alvo em seus respectivos ensaios demonstram a especificidade do ensaio de identificação de M. chamomilla. Para o DNA da amostra, o extrato de DNA da cabeça de flor de campo e da folha produziu valores ct de 15,18 e 19,41 no teste de identificação de camomila M. respectivamente (Sample1(FLOWER)_GCT e Sample2(LEAF)_GCT). Ambas as amostras não foram amplificadas no teste de identificação de C. nobile (Sample1(FLOWER)_RCT e Sample2(LEAF)_RCT). Os padrões de amplificação de ambas as amostras corresponderam ao padrão de amplificação do controle positivo de M. chamomilla. Os controles negativos não foram amplificados tanto nos testes de identificação de M. chamomilla quanto em C. nobile (NC_GCT e NC_RCT), excluindo a possibilidade de falsos positivos causados pela contaminação da PCR. Para confirmar ainda mais a amplificação específica em controles e amostras positivas, frações de produto final pcr de cada poço foram executadas em gel de 2% de agarose no laboratório (Figura 8). Para o teste de identificação de M. chamomilla, ambas as amostras de campo produziram amplicons funcionando na mesma posição que o controle m. chamomilla positivo com um tamanho estimado ligeiramente acima de 100 bp (tamanho teórico 102 bp). Para o teste de identificação de C. nobile, o controle positivo da espécie não-alvo C. nobile produziu uma faixa entre 50 e 100 bp, ajustando o tamanho teórico de 65 bp. As demais faixas não apresentaram nenhum produto específico de amplificação, o que estava de acordo com a ausência de sinal fluorescente para esses poços, como observado nos testes de campo.

Após a amplificação do PCR, foi realizada uma análise da curva de fusão para avaliar as características de dissociação do DNA de dupla retração (dsDNA) durante o aquecimento. À medida que a temperatura aumentava durante o ciclo final para análise da curva de derretimento, o aumento da temperatura fez com que os amplificadores de dois fios se dissociassem. O corante fluorescente intercalante foi gradualmente liberado na solução, diminuindo a intensidade da fluorescência(Figura 9A). O ponto de inflexão da primeira curva derivada foi usado para determinar a temperatura de fusão (Tm) (Figura 9B), que depende principalmente do comprimento do fragmento de DNA e do conteúdo gc. A combinação do valor ct com a temperatura de fusão pode aumentar a especificidade da análise qPCR. No presente estudo, o pico de temperatura de fusão de M. chamomilla positivo control PCR amplicon ocorreu a 85,6 °C (GCP_GCT) e foi distinto do pico de temperatura de fusão de C. nobile controle positivo PCR amplicon a 79,1 °C (RCP_RCT). O amplicon PCR da cabeça de flor de campo e folha produziu picos de temperatura de fusão a 85,2 °C e 84,8 °C, respectivamente (Sample1(FLOWER)_GCT e Sample2(LEAF)_GCT). Para avaliar as variações de temperatura de fusão medidas pelo sistema portátil qPCR, foram coletados pontos de dados adicionais para confirmar que as temperaturas de fusão da amostra estavam sempre próximas da temperatura de fusão obtida a partir do controle positivo de M. chamomilla (dentro de 2 °C) e estavam longe da temperatura de fusão de C. nobile positive control amplicon(Figura 10). Picos de temperatura de fusão às vezes eram relatados em outros poços. No entanto, seus valores de Tomografia não eram inferiores a 25 e os picos de temperatura de fusão não estavam próximos de M. chamomilla ou C. nobile positive control (mais de 2 °C de distância).

Em resumo, o teste de identificação de camomila de campo M. pode ser interpretado com base nas regras de decisão resumidas na Tabela 5. Com todos os controles positivos testando positivo para as espécies botânicas putativas, negativo para as outras espécies, e controles negativos testando negativo, ambas as amostras de campo foram determinadas a conter M. chamomilla, mas não C. nobile. Além disso, para alinhar os resultados dos testes de campo com outras técnicas analíticas, as conclusões de campo foram confirmadas por um método de codificação de DNA previamente validado25 (dados não mostrados).

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Figura 1: Identificação morfológica de materiais botânicos. (A) Flores hibiscus rosa-sinensis, raízes curcuma longa, folhas de Malva Sylvestris, folhas rosmarinus officinalis, sementes de coriandrum sativum, raízes zingiber officinale. (B) Os flocos de cascalho petroselinum crispum e apium são difíceis de diferenciar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Identificação química de materiais botânicos. (A) Instrumento HPTLC e cromatograma HPTLC representativo. (B) Instrumento HPLC e um cromatograma HPLC representativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Matricaria chamomilla e Chamaemelum nobile em campo. (A) Matricaria chamomilla, adaptada da Wikipédia sob CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg. (B) Chamaemelum nobile, adaptado da Wikipédia sob CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Coleta de peças da planta de M. chamomilla do campo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Layout de poços de teste na demonstração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Extrato de DNA de campo em tubos de coleta. O tecido botânico permanece no tubo original e é coberto por extrato de DNA amarelado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Parcela de fluorescência mostrando o acúmulo de produtos PCR ao longo de 25 ciclos de termociclismo. M. camomila de controle positivo e controle positivo de C. nobile mostram valores de tomografia inferiores a 25 em M. chamomilla e C. nobile testes de identificação, respectivamente. As amostras de flores e folhas de campo foram amplificadas pelo teste de identificação de M. chamomilla com valores ct de 15,18 e 19,41. O resto dos poços não foram amplificados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8: Eletroforese de gel dos produtos de amplificação pcr de campo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9: Análise da temperatura de fusão. (A) O sinal de fluorescência em cada poço diminui com o aumento da temperatura. (B) A identidade dos produtos PCR foi confirmada pelo pico de temperatura de fusão na análise da curva de fusão. As amostras de flores e folhas do campo apresentam picos de 85,2 °C e 84,8 °C. Estes estão perto do pico produzido pelo controle positivo de M. chamomilla. O controle positivo de C. nobile produziu um pico de 79,1 °C, o que é diferente das outras três amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 10: Variação do pico de temperatura de fusão entre controle positivo e amostras de campo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

PalcoCicloTemperaturaHora
Temperatura constante195 °CAnos 60
Amplificação2595 °C30 anos
60 °C30 anos
Curva de fusão160 °CRampa 0.05 °C/s
95 °C

Tabela 1: condições de termociclismo qPCR para testes de identificação de M. chamomilla e C. nobile.

AnáliseNome do primerSequência 5'-3'PosiçãoRegiãoTamanho da amplicon
Matricaria recutitaZL3TCGTCGGTCGCAAGGATAAGAGAGFrenteITS2102 bp
ZL4TAAACTCAGCGGGTAGTCCCReverter
Chamaemelum nobileZL11TGTCGCACGTTGCTAGGAAGCAFrenteITS265 bp
ZL12TCGAAGCGTCATCCTAAGACAACReverter

Tabela 2: Pares de primer para testes de identificação de M. chamomilla e C. nobile.

Bem posiçãoBem nomeDescrição
1GC_PosCtrl_GC_TestControle positivo de camomila alemã sob teste gc
2GC_PosCtrl_RC_TestControle positivo de camomila alemã sob teste rc
3RC_PosCtrl_GC_TestControle positivo de camomila romana sob teste gc
4RC_PosCtrl_RC_TestControle positivo de camomila romana sob teste rc
5Field_Sample_GC_TestAmostra de tecido de folha sob teste GC
6Field_Sample_RC_TestAmostra de tecido de folha sob teste RC
7Field_Sample_GC_TestAmostra de tecido de flores sob teste GC
8Field_Sample_RC_TestAmostra de tecido de flores sob teste rc
9NegCtrl_GC_TestAmostra de controle negativa sob teste GC
10NegCtrl_RC_TestAmostra de controle negativa sob teste RC

Tabela 3: Bem tipos e descrições para testes de identificação de M. chamomilla e C. nobile.

ReagenteGC_TestRC_Test
Mix universal qPCR*10 μL10 μL
Primer ZL3 (10 μM)0,4 μLNA
Primer ZL4 (10 μM)0,4 μLNA
Primer ZL11 (10 μM)NA0,4 μL
Primer ZL12 (10 μM)NA0,4 μL
H2O (sem nuclease)7,2 μL7,2 μL
* contém Polymerase de DNA Hot Start Taq

Tabela 4: Composição de master-mix para testes de identificação de M. chamomilla e C. nobile.

Bem NomeResultado esperadoCritérios de resultado positivoCritérios de resultado negativo
Detectado / PresenteNão detectado / Ausente
GC_PosCtrl_GC_TestDetectadoCt < 25 e 84 <= Tm <= 86-
GC_PosCtrl_RC_TestNão detectado-Nenhum valor de TC dentro de 25 ciclos
RC_PosCtrl_GC_TestNão detectado-Nenhum valor de TC dentro de 25 ciclos
RC_PosCtrl_RC_TestDetectadoCt < 25 e 79 <= Tm <= 81-
Field_Sample_Leaf_GC_TestPresenteCt < 25 e 84 <= Tm <= 86Nenhum valor de TC dentro de 25 ciclos
Field_Sample_Leaf_RC_TestAusente-Nenhum valor de TC dentro de 25 ciclos
Field_Sample_Flower_GC_TestPresenteCt < 25 e 84 <= Tm <= 86Nenhum valor de TC dentro de 25 ciclos
Field_Sample_Flower_RC_TestAusente-Nenhum valor de TC dentro de 25 ciclos
NegCtrl_GC_TestNão detectado-Nenhum valor de TC dentro de 25 ciclos
NegCtrl_RC_TestNão detectado-Nenhum valor de TC dentro de 25 ciclos

Tabela 5: Regras para interpretação do resultado qPCR.

Discussão

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O design de primers e seleção de modelos são os passos cruciais para obter uma amplificação qPCR eficiente e específica. Depois de identificar um modelo adequado, o software de design primer é normalmente usado para ajudar na seleção de primers com base em variáveis de design, como comprimento do primer, temperatura de fusão e teor GC33,34. A otimização e validação podem ser realizadas nas condições experimentais esperadas do ensaio para garantir a especificidade, sensibilidade e robustez de uma reação pcr35. O design do primer sub-ideal pode resultar na formação de primer-dimer, onde as interações de primer produzem produtos não específicos36.

Os controles de modelo (NTC) utilizados neste estudo verificam tanto a contaminação do DNA quanto a presença de primer-dimers que poderiam afetar o ensaio. Os resultados não mostraram amplificação, uma boa indicação de que tanto a contaminação do DNA quanto os primer-dimers não são uma preocupação. A contaminação do DNA e os primer-dimers se manifestam em curvas de derretimento através de controles de modelo, e como picos extras em curvas de derretimento de controles positivos. Normalmente, espera-se que a curva de derretimento de um controle positivo contenha um único pico, a menos que subdomínios ricos em AT no modelo causem derretimento desigual. Picos duplos poderiam ser previstos simulando ensaios de fusão usando o software uMELT37. Neste estudo, utilizou-se o padrão-ouro de execução do produto PCR em gel de agarose para confirmar a presença de produto PCR alvo e ausência de contaminação e primer-dimers.

Um desafio considerável na análise molecular de material botânico é obter DNA de boa qualidade após o processo de extração de DNA botânico. Os materiais botânicos são comercializados e consumidos pelos compostos químicos ativos associados aos benefícios para a saúde. No processo de extração de DNA, esses compostos químicos também serão liberados na solução de extração de DNA, potencialmente causando inibição de PCR, resultando em falhas na amplificação do PCR. Vários kits de purificação de DNA vegetal usando solventes orgânicos e colunas foram desenvolvidos para remover compostos químicos derivados de botânicos38. No entanto, o capô de fumaça e a centrífuga de alta velocidade necessária para ajudar esses kits não estão disponíveis no campo.

No protocolo atual, o método simplificado de extração de DNA utiliza um kit de extração de DNA de planta comercial (ver Tabela de Materiais para detalhes). Tinha a capacidade de neutralizar substâncias inibitórias comuns para resultados reprodutíveis e produziu resultados consistentes para M. chamomilla e C. nobile. Tanto as cabeças de flores de M. camomila quanto as folhas de C. nobile renderam amplicons pcr com picos específicos de derretimento, indicando que a presença de inibidores de PCR não era uma preocupação. Para outras plantas com níveis mais elevados de inibidores de PCR, amplificar o DNA em sua extração original pode ser menos eficiente. Para reduzir a inibição e melhorar a eficiência da amplificação, com acesso a toda a planta, outras peças vegetais com menor teor de polissacarídeo e polifenóis também podem ser utilizadas para fins de identificação. Se houver acesso limitado a diferentes partes de plantas, folhas mais jovens ou pétalas dissecadas de cabeças de flores, que normalmente têm menor teor fenólico39,podem oferecer uma melhor chance de sucesso. Como as sequências de DNA são consistentes em toda a planta, qualquer parte da planta pode ser usada para confirmar a identidade da espécie. Se a amplificação do PCR ainda for subótima, o extrato original de DNA pode ser ainda mais diluído antes do PCR, ou protocolos de purificação laboratorial mais sofisticados podem ser usados.

Outro desafio para a análise da PCR são os resultados falsos positivos causados pela contaminação do DNA, que podem impactar negativamente a interpretação dos dados. Geralmente é controlado por limpeza ativa, utilizando equipamentos dedicados e restringindo o trabalho a áreas designadas. Utilizando qPCR, toda a análise de PCR pode ser realizada em um sistema fechado, o que reduz muito a chance de contaminação por amplicon PCR em um ambiente que não é bem controlado. Além disso, o DNA ambiental também não deve apresentar falso positivo devido à especificidade do ensaio, de acordo com um estudo de validação anterior40.

Há espaço para melhorias. No protocolo aqui apresentado, o corante intercalante foi usado para mostrar amplificação do fragmento de alvo em tempo real. A especificidade do método é ainda confirmada pela temperatura de fusão característica, que é distinta entre m. chamomilla e amplicons de C. nobile. Portanto, a pcr baseada em corante intercalando pode responder eficientemente à pergunta "O que é essa espécie de planta?" no campo. No entanto, além da necessidade de realizar a identificação botânica em uma única planta isolada do campo, em muitas circunstâncias, pós botânicos ou extratos no armazém também se beneficiarão de uma rápida avaliação de identidade no local. Para esses tipos de materiais, questões adicionais podem precisar ser abordadas, como "O que está nesse material?", "Ele contém a espécie botânica que estou procurando?", "Ele contém adúlteros que eu quero evitar?", e "É substituído total ou parcialmente por outras espécies botânicas que são prejudiciais?". Em vez de usar corante intercalante, diferentes sondas qPCR podem ser projetadas para direcionar amplicons de diferentes botânicos em um sistema de reação, mantendo alta especificidade e eficiência do ensaio. O desenvolvimento de qPCR baseado em teste e a utilização de um sistema qPCR portátil que oferece detecção múltipla de canais pode estender ainda mais a aplicação de testes de campo como um ensaio adequado para um ambiente mais amplo, como armazéns de materiais botânicos e centros de distribuição para responder a perguntas mais complicadas. Além disso, o uso de vários testes também permite que o usuário inclua amplificação interna em cada sistema de reação, de modo que mais informações estarão disponíveis quando a inibição do PCR for suspeita.

O protocolo aqui apresentado tem as seguintes vantagens em relação às tecnologias existentes utilizadas para o mesmo fim. Em primeiro lugar, para os métodos tradicionais de identificação morfológica e química, o procedimento e seus resultados precisam ser conduzidos e interpretados por especialistas. os testes de identificação baseados em qPCR podem ser conduzidos por pessoas com formação básica em biologia molecular e interpretados de forma mais padronizada. Em segundo lugar, em comparação com a identificação e diferenciação de espécies baseadas em qPCR normalmente realizadas em laboratório, o protocolo de identificação de campo usando um instrumento portátil não requer instrumentos com uma grande pegada, como uma centrífuga de alta velocidade, equipamento de avaliação de qualidade de DNA, cicloviário térmico com detector de fluorescência e um computador executando um software especial. Assim, a identificação de espécies baseadas em DNA pode ser realizada em qualquer ambiente sem demora. Em terceiro lugar, a busca por materiais botânicos é uma tarefa que requer uma operação global. Com avanços em serviços de nuvem e inteligência artificial, um dispositivo portátil pode potencialmente receber métodos desenvolvidos e validados por especialistas em laboratório, ser operado por não especialistas em áreas remotas e produzir certificações objetivas de terceiros. Portanto, essa opção é mais atraente do que nunca, com o trabalho remoto se tornando a tendência.

Em resumo, o protocolo aqui demonstrou identificação de campo de M. chamomilla usando um sistema portátil qPCR. A aplicação bem-sucedida desta técnica gerará resultados altamente precisos sobre identificação botânica e ajudará fabricantes e fornecedores botânicos a qualificar materiais botânicos de forma oportuna e econômica.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Certificamos que Zhengxiu Yang, Zheng Quan, Tiffany Chua, Leo Li, Yanjun Zhang, Silva Babajanian, Tricia Chua, Peter Chang, Gary Swanson, Zhengfei Lu são funcionários da Herbalife International of America, Inc. Certificamos que Francesco Buongiorno, Isabella Della Noce e Lorenzo Colombo são funcionários da Hyris Ltd. que produz o instrumento portátil qPCR usado neste artigo.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a James Shan por seus esforços na gravação de vídeo de campo. Agradecemos a Jon Byron e Matthew Semerau por seu trabalho na edição de vídeo. Agradecemos a Ansen Luo, Harry Du e Frank Deng pelo apoio na localização do campo de testes. Agradecemos a Maria Rubinsky por seus valiosos comentários sobre todo o manuscrito. Todas as pessoas reconhecidas são funcionários da Herbalife International of America, Inc.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BateriaTNE78000mAhFornece fonte de alimentação de campo
bCUBEHYRISbCUBE 2.0Cartuchos de instrumentos qPCR portáteis
(16 poços)HYRISNAConsumíveis para bCUBE
Pipeta elétricaEppendorfNAManuseio de líquido
Extract-N-AmpTM< / sup> kit de PCR de plantaSIGMAXNAP2-1KTKit de extração de DNA vegetal
Camomila alemã (Matricaria chamomilla L) materiais de referência botânica de floresAHP2264Usado como controle positivo
Mini banho secoYooningMiniH-100LPara extração de DNA
Água livre de nucleaseAMBIONAM9937reação qPCR
PrimerThermo Fisher ScientificNAqPCR reação
Materiais de referência botânicos de flor de camomila romana (Chamaemelum nobile)ChromaDexASB-00030806-005Usado como controle positivo
Reação universal de qPCR da mistura mestra doNEBM3003Ldo qPCR
de Luna

Referências

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