Apresentada aqui é uma plataforma microscópica multifotípica para imagens de superfície ocular de rato vivo. O camundongo transgênico fluorescente permite a visualização de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nervosas e capilares dentro da superfície ocular. Sinais de segunda geração harmônica não lineares derivados de estruturas colágenas fornecem imagens sem rótulos para arquiteturas estromais.
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Artigo de método
Uma plataforma personalizada de microscopia multifotn para imagens ao vivo de córnea de rato e conjuntiva
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A análise histológica convencional e os sistemas de cultura celular são insuficientes para simular completamente a dinâmica fisiológica e patológica in vivo. A microscopia multifotônica (MPM) tornou-se uma das modalidades de imagem mais populares para estudo biomédico em níveis celulares in vivo, as vantagens incluem alta resolução, penetração de tecido profundo e fototoxicidade mínima. Projetamos uma plataforma de imagem MPM com suporte para olhos de mouse personalizado e um estágio estereotaxico para imagem de superfície ocular in vivo. O rato repórter de proteína fluorescente dupla permite a visualização de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nervosas e capilares dentro da superfície ocular. Além dos sinais de fluorescência multifotônica, a aquisição de segunda geração harmônica (SHG) permite simultaneamente a caracterização da arquitetura estromal colágena. Esta plataforma pode ser empregada para imagens intravitais com posicionamento preciso em toda a superfície ocular, incluindo córnea e conjuntiva.
Introdução
As estruturas superficiais oculares, incluindo a córnea e a conjuntiva, protegem outros tecidos oculares mais profundos de distúrbios externos. A córnea, a parte frontal transparente do olho, funciona tanto como uma lente refrativa para direcionar a luz para o olho quanto como uma barreira protetora. O epitélio corneo é a camada mais externa da córnea e consiste em camadas distintas de células superficiais, células de asa e células basais. O estroma corneal é composto de lamellae colagenosa sofisticadamente embalada embutida com ceratocitos. O endotélio corneo, uma única camada de células hexagonais planas, tem um papel importante na manutenção da transparência da cór....
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Protocolo
Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com os procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Nacional de Taiwan e do Chang Gung Memorial Hospital.
1. Configuração de microscopia multifotônica
- Construa um sistema baseado em um microscópio vertical com imersão de água 20x 1.00 NA objetivo(Figura 1A).
- Use Ti: Laser de safira (com comprimento de onda tunable) como fonte de excitação. Defina o comprimento de onda de saída a laser em 880 nm para EGFP e 940 nm para tdTomato(Figura 1A). <....
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Resultados
Usando esta plataforma de imagem ao vivo, a superfície ocular do mouse pode ser visualizada em níveis celulares. Para visualizar células individuais únicas na superfície ocular, empregamos os camundongos transgênicos fluorescentes duplos com EGFP expressos no núcleo e tdTomato expressos na membrana celular. O estroma córnea rico em colágeno foi destacado por sinais shg.
No epitélio córnea, foram visualizadas células superficiais, células de asa e células basais (Figura 2)........
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Discussão
Esta plataforma de imagem MPM personalizada com um software de controle foi usada para imagens intravitais de órgãos epiteliais de camundongos, incluindo pele10,folículo piloso10 e superfície ocular9,,10 (Figura 1A). O sistema personalizado foi usado por sua flexibilidade na alteração dos componentes ópticos para vários experimentos, desde o início do nosso projeto. Essa metodologia de .......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos o apoio do Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) e Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Software AVIZO Lite | Thermo Fisher Scientific | Versão: 2019.3.0 | |
| Filtros passa-banda | Semrock | FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40 | |
| Espelhos dicróicos | Semrock | FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36 | |
| Galvano | Thorlabs | GVS002 | |
| Jade Software de controle BIO | SouthPort Corporation | Jade BIO | |
| Cloridrato de oxibuprocaína | Sigma | O0270000 | |
| PMT | Hamamatsu | H7422A-40 | |
| BECTON DICKINSON | 427401 | ||
| Suporte de mouse estereotáxico | Step Technology Co.,Ltd | 000111 | |
| Ti: Laser de safira | Spectra-Physics | Mai-Tai Microscopia vertical DeepSee | |
| Olympus | BX51WI | ||
| Gel Vidisic | Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH | D13581 | |
| Zoletil | Virbac | VR-2831 |
Referências
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
- Hodges, R. R., Dartt, D. A.
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Reimpressões e permissões
