Uma plataforma personalizada de microscopia multifotn para imagens ao vivo de córnea de rato e conjuntiva
17 de maio de 2020
Apresentada aqui é uma plataforma microscópica multifotípica para imagens de superfície ocular de rato vivo. O camundongo transgênico fluorescente permite a visualização de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nervosas e capilares dentro da superfície ocular. Sinais de segunda geração harmônica não lineares derivados de estruturas colágenas fornecem imagens sem rótulos para arquiteturas estromais.
Este protocolo usa um microscópio multi-filtro para imagens ao vivo de toda a estrutura da superfície ocular do rato no modelo de camundongo transgênico fluorescente duplo. A combinação de uma plataforma microscópica multifotográfica personalizada e camundongos transgênicos fluorescentes duplos permite a visualização em tempo real da e estrutura da superfície ocular. Para configurar o microscópio multifotônio, selecione a imersão de água 20X, 1,00 NA objetivo e definir o laser de safira de titânio como a fonte de excitação em um microscópio vertical.
Defina o comprimento de onda de saída do laser para 880 nanômetros para EGFP e 940 nanômetros para tdTomato. Inclua dois espelhosdicâmicos para a separação de shg egfp tdTomato e use 434-17, 510-84 e 585-40 filtros de passagem de banda para separar espectralmente os sinais SHG EGFP e tdTomato. Para configurar o suporte dos olhos, depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal em um rato anestotista de 8 a 12 semanas, coloque o mouse no estágio do microscópio aquecido e insira uma sonda de monitoramento de temperatura.
Coloque o mouse em um suporte de mouse esteretaxic personalizado e insira barras de ouvido no meatus auditivo externo. Use fixação de três pontos para fixar o suporte da cabeça e aplique uma solução de cloridrato de oxybuprocaina de 0,4% oxybuprocaine e solução salina à superfície ocular. Cubra as pontas de um par de fórceps Dumont número cinco com o laço do tubo PE.
Após três minutos, realize uma retração manual das pálpebras para confirmar a saliência do globo ocular e coloque cuidadosamente um laço do tubo do suporte de PE ao longo da margem das pálpebras para expor a superfície ocular. E use o botão do suporte para estabilizar o globo ocular com os fórceps. Em seguida, cubra a superfície da córnea com um gel ocular com um índice refrativo de 1.338.
Para imagens seriais Z da superfície córnea, use uma fonte de luz de mercúrio para fotografar o campo de alvo e abrir o software do microscópio. Selecione o multiplicador de fotos apropriado e os ganhos digitais para visualizar a estrutura celular na superfície ocular e defina o primeiro e último slide para permitir a aquisição de uma pilha de imagens. Defina a resolução da imagem para 512 por 512 pixels e a etapa Z para um micrômetro.
Em seguida, clique em começar a coletar imagens seriais Z adquirindo uma imagem ao vivo com uma excitação de 880 nanômetros para a coleta de sinal SHG EGFP e uma imagem ao vivo em uma excitação de 940 nanômetros para a coleta de sinal EGFP tdTomato dentro de cada área. Ao longo da imagem, use o suporte de estágio motorizado do stepper para girar o globo ocular para permitir imagens em toda a superfície córnea. Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, carregue as imagens de série Z em Fiji e selecione o plugin de filtro 3D mediano.
Depois de remover o ruído de fundo, selecione o pacote de filtro de máscara não-har Fiji para afiar as imagens e clicar em contraste automático de brilho para otimizar automaticamente a qualidade das imagens. Após o processamento, salve as imagens como uma sequência de imagens serial e exporte a sequência de imagens para um programa de software de reconstrução 3D apropriado. Em todas as imagens de microscopia multifotúr, apresente os sinais EGFP tdTomato e SHG em pseudo verde, vermelho e ciano, respectivamente, antes de capturar as imagens da estrutura 3D por instantâneo.
A microscopia multifotônio permite a visualização de células superficiais de Asa e Basal no epitélio córnea de camundongos transgênicos fluorescentes duplos. Células únicas da camada basal podem ser mapeadas para a camada superficial, bem como células superficiais em forma hexagonal única. Como revelado pela expressão citoplasmática do sinal tdTomato, o rico sistema vesicular intracelular da proteína da membrana, incluindo o aparelho golgi e o ânticulo endoplasmático está espalhado dentro das células das asas.
Dentro do estroma colágeno, os coratesites em forma de stellate são delineados pela membrana que tem como alvo fluorescentes EGFP nesses camundongos. Os coratesites embutidos no estroma universitário são mais espaçados do que dentro das células endoteliais. Além disso, nervos finos de ramificação dentro do estroma córnea também podem ser visualizados por membrana direcionada a sinais tdTomato e moncaminhas de células endoteliais da córnea demonstram uma forma hexagonal relativamente homogênea conectada em um padrão de favo de mel.
O epitélio limbal consiste de uma a duas camadas de células epiteliais. A cepa transgênica de repórter fluorescente dupla também permite a imagem de capilares dentro da conjuntiva, facilitando a reconstrução da arquitetura 3D dos capilares delineando o endotélio vascular. Estabilizar o globo ocular com pressão moderada sem ferimentos é fundamental para a aquisição de imagens de boa qualidade, pois pressão insuficiente ou excessiva pode comprometer a qualidade da imagem.
Esta plataforma de imagem NVivo pode ser modificada para visualização de estruturas abaixo da superfície ocular e pode ser aplicada a estudos in situ de várias doenças oftálmicas.
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Visão Geral
Este artigo apresenta uma plataforma microscópica de múltiplos fótons para imagem em tempo real da superfície ocular de camundongos, utilizando um modelo de camundongo transgênico fluorescente duplo. O sistema permite a visualização em tempo real de diversas estruturas celulares na superfície ocular.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oftalmologia
- Microscopia
Contexto
- A microscopia de múltiplos fótons é uma técnica de imagem poderosa.
- Camundongos transgênicos fluorescentes permitem uma visualização aprimorada dos componentes celulares.
- Compreender a estrutura da superfície ocular é fundamental para diversas aplicações de pesquisa.
- Técnicas de imagem sem marcação podem complementar os métodos fluorescentes.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para imagem em tempo real da superfície ocular de camundongos.
- Utilizar um microscópio multiphoton personalizado para visualização aprimorada.
- Demonstrar as capacidades de camundongos transgênicos com dupla fluorescência em imagem.
Métodos Utilizados
- Configuração de um microscópio multiphoton com objetivas e ajustes a laser específicos.
- Uso de espelhos dicróicos e filtros de passagem de banda para separação de sinais.
- Imageamento em tempo real de camundongos anestesiados em uma platina aquecida do microscópio.
- Visualização em tempo real de estruturas da superfície ocular.
Resultados Principais
- Imagem bem-sucedida de núcleos celulares, membranas e fibras nervosas.
- Imagem sem marcação de arquiteturas estromais utilizando geração de segundo harmônico.
- Demonstração da eficácia da plataforma multiphotônica.
- As capacidades de visualização em tempo real foram validadas.
Conclusões
- A plataforma microscópica de múltiplos fótons é eficaz para imagem ocular.
- Ratos transgênicos com dupla fluorescência melhoram a visualização de estruturas oculares.
- Este método pode avançar a pesquisa em biologia ocular e áreas relacionadas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Esta plataforma de microscopia multiphoton permite a obtenção de imagens vitais e sem marcação de estruturas da superfície ocular de camundongos, fornecendo informações essenciais sobre a biologia da córnea e da conjuntiva para a descoberta de fármacos oftálmicos. Ao visualizar dinâmicas celulares, arquitetura estromal e redes vasculares in vivo, o método apoia a desmistificação mecanicista de alvos terapêuticos em modelos pré-clínicos de doenças oculares. A capacidade da plataforma de realizar imagens em toda a superfície ocular com posicionamento preciso aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e nos processos de desenvolvimento de ensaios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da visualização de núcleos celulares, membranas, fibras nervosas e capilares em tecido ocular vivo.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio da observação em tempo real da arquitetura estromal por geração de segundo harmônico e da dinâmica celular em repórteres fluorescentes duplos.
- Valor Preditivo: Aprimora a triagem de portfólios ao fornecer leituras quantitativas e reprodutíveis de alterações estruturais e celulares em modelos oculares relevantes para doenças.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores, permitindo a obtenção de imagens de alta resolução dos compartimentos epiteliais, estromais, endoteliais e vasculares.
- Valor Operacional: Aborda a padronização e reprodutibilidade dos ensaios por meio da aquisição precisa de cortes em Z, separação espectral de sinais de GSH e fluorescência, e posicionamento estabilizado do globo ocular.
- Valor Estratégico: Destaca a prontidão para triagem e a reutilização da plataforma ao permitir a obtenção de imagens em toda a superfície corneana e conjuntival com mínima fototoxicidade.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Discute a relevância para doenças ao permitir a reconstrução da arquitetura tridimensional dos capilares na conjuntiva e a visualização das camadas epiteliais da região limbar.
- Valor Operacional: Descreve a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, ao apoiar a imagem intravital com posicionamento preciso nas diferentes regiões da superfície ocular.
- Valor Preditivo: Aborda decisões de avanço ajustadas ao risco, fornecendo imagens do estroma sem marcação e mapeamento celular que contribuem para a compreensão mecanicista da patologia ocular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a imagem pré-clínica, apoiando a verificação de hipóteses e a redução de riscos mecanicistas na pesquisa oftálmica.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método apoia a testagem de hipóteses, a elucidação de vias e a redução de riscos biológicos ao permitir a imagem em tempo real das dinâmicas celulares e estruturais na superfície ocular.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio, a reprodutibilidade e as saídas quantitativas por meio da aquisição de imagens em série Z, separação espectral de sinais e condições de imagem estabilizadas.
- Análises: Destaca as medições, leituras ou saídas estatísticas que ajudam as equipes a comparar condições, incluindo SHG para arquitetura do colágeno e tdTomato/EGFP para localização na membrana e no núcleo.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método com a continuidade pré-clínica ou o alinhamento de biomarcadores ao permitir a reconstrução tridimensional de capilares e o mapeamento da camada epitelial em modelos relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável, e não como uma técnica de uso único, adaptável a diversos modelos de doenças oftálmicas e pontos finais de imagem.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista na biologia da superfície ocular.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio de suporte ocular personalizado, estadiamento estereotáxico e parâmetros de imagem controlados.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais assertivas sobre continuidade ou interrupção de projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em fases avançadas, mediante visualização precoce do engajamento com o alvo e da resposta tecidual.
- Impacto sobre o Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, com base em leituras quantitativas, sem marcadores e fluorescentes nos compartimentos corneano e conjuntival.
Considerações de Implementação
- Expertise científica necessária em microscopia multiphoton, anatomia ocular e manuseio de modelos transgênicos.
- Necessidades de instrumentação e infraestrutura analítica, incluindo laser de titânio-safira, espelhos dicróicos, filtros de passagem de banda, estágio motorizado e software de reconstrução 3D.
- Requisitos de padronização entre equipes para protocolos de imagem, configurações de detecção de sinal e fluxos de processamento de imagens (por exemplo, plugins do Fiji para redução de ruído e realce de contraste).
- Considerações de adaptação entre sistemas modelo, incluindo ajuste da estabilização das pálpebras, gel acoplador da superfície ocular e comprimentos de onda de excitação para diferentes marcadores fluorescentes.
- Limitações práticas apoiadas pelo material de origem: estabilizar o globo ocular com pressão moderada sem causar lesão é essencial, pois pressão insuficiente ou excessiva compromete a qualidade da imagem.
