Artigo de método

Conjugados BODIPY convencionais para microscopia de super-resolução de células vivas e rastreamento de moléculas únicas

DOI:

10.3791/60950

⸱

8 de junho de 2020

 ,  ,  , 
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), 2Middlebury College

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Conjugados BODIPY convencionais podem ser usados para microscopia de localização de moléculas únicas de células vivas (SMLM) através da exploração de seus dimers de estado terrestre transitoriamente formados. Apresentamos um protocolo SMLM otimizado para rastrear e resolver lipídios neutros subcelulares e ácidos graxos em células de mamíferos vivos e leveduras na escala de comprimento nanoscópico.

Resumo

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As técnicas de microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM) superam o limite de difração óptica da microscopia convencional de fluorescência e podem resolver estruturas intracelulares e a dinâmica das biomoléculas com precisão de ~20 nm. Um pré-requisito para SMLM são fluoroforos que transitam de um estado escuro para um fluorescente, a fim de evitar a sobreposição espátula-temporal de suas funções de spread de ponto em cada um dos milhares de quadros de aquisição de dados. BodipYs são corantes bem estabelecidos com numerosos conjugados usados na microscopia convencional. A formação transitória de dimers de estado terrestre BODIPY de mudança vermelha (DII) resulta em emissão de molécula única brilhante permitindo microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM). Aqui apresentamos um protocolo simples, mas versátil para SMLM com conjugados BODIPY convencionais em leveduras vivas e células de mamíferos. Este procedimento pode ser usado para adquirir imagens de super-resolução e para rastrear estados bodipy-DII únicos para extrair informações espáteris-temporais de conjugados BODIPY. Aplicamos este procedimento para resolver gotículas lipídicas (LDs), ácidos graxos e lisosomos em leveduras vivas e células mamíferas na escala de comprimento nanoscópico. Além disso, demonstramos a capacidade de imagem multicolorido com corantes BODIPY quando usados em conjunto com outras sondas fluorescentes. Nossos resultados representativos mostram a distribuição espacial diferencial e a mobilidade dos ácidos graxos BODIPY e lipídios neutros na levedura sob condições alimentadas e jejuadas. Este protocolo otimizado para SMLM pode ser usado com centenas de conjugados BODIPY disponíveis comercialmente e é um recurso útil para estudar processos biológicos na nanoescala muito além das aplicações deste trabalho.

Introdução

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Técnicas de microscopia de localização de molécula única (SMLM), como microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) e microscopia de localização ativada por foto (PALM) surgiram como métodos para gerar imagens de super-resolução com informações além do limite de difração óptica da Abbe1,,2 e para o rastreamento da dinâmica de biomoléculas únicas3,,4. Um dos requisitos para sondas compatíveis com SMLM é a capacidade de controlar o número de fluoroforos ativos a qualquer momento para evitar a sobreposição espacial de suas funções de propagação d....

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Protocolo

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NOTA: Para clonagem de levedura e marcação endógena, consulte nossa publicação recente10.

1. Preparação de amostras de células de levedura para imagem

  1. Prepare uma cultura líquida durante a noite de uma cepa de levedura w303. Usando uma vara de madeira estéril, localmente uma pequena quantidade de células de levedura de uma placa de ágar contendo extrato de levedura -peptone-dextrose em um tubo de cultura com ~2 mL de meio sintético de dextrose completa (SCD). Incubar o tubo durante a noite em uma incubadora de agitação a 270 rpm e 30 °C.
  2. Realize uma diluição de 1:50 manhã das células em SCD. Conti....

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Resultados

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Aqui, apresentamos um procedimento otimizado de preparação amostral, aquisição de dados e análise para SMLM utilizando conjugados BODIPY com base no protocolo acima(Figura 1A). Para demonstrar um exemplo do fluxo de trabalho para aquisição e análise de dados SMLM, empregamos BODIPY (493/503) em leveduras para resolver LDs abaixo do limite de difração óptica(Figura 1B-F). Exemplos dos diferentes modos de imagem multicoloridos do BODIPY em conjunt.......

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Discussão

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Neste protocolo, demonstramos como conjugados BODIPY convencionais podem ser usados para obter imagens SMLM com uma ordem de melhoria de magnitude na resolução espacial. Este método baseia-se na exploração de estados DII previamente relatados de corantes BODIPY convencionais, que se formam transitoriamente através de encontros bi-moleculares. Esses estados podem ser especificamente animados e detectados com comprimentos de onda com mudanças vermelhas e são esparsos e de curta duração suficiente para SMLM. Ao a.......

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Divulgações

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Os autores não declaram interesses concorrentes.

Agradecimentos

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A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o prêmio número R21GM127965.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BODIPY C12ThermoFisherD3822Análogo de ácido graxo verde
BODIPY C12 VermelhoThermoFisherD3835Análogo de ácido graxo vermelho
BODIPY (493/503)ThermoFisherD3922Marcador lipídico neutro
Concanavalina ASigma-AldrichC2010Imobilização celular na superfície do vidro
Mistura de gota completa sem base de nitrogênioAminoácidos biológicos dos E.U.D9515para SCD
DextroseSigma-AldrichG7021Fonte do carbono para SCD
Oito poçosCellvisC8-1.58-NChambered Coverglasses
Eight Well, Lb-Tek IISigma-AldrichChambered Coverglasses
ET525/50ChromaFiltro passa-banda
ET595/50ChromaFiltro passa-banda
ET610 / 75Filtro passa-bandacroma
Soro bovino fetal (FBS)Soro26140079
Gibco FF652Divisor de feixeSemrock
FF731 / 137Filtro passa-bandaSemrock
FluoroBrite DMEMThermoFisherA1896701Meio
de cultura celularHal4000Zhuang Lab, UniversidadeSoftware de aquisição
de dados Ixon89Ultra DU-897UAndorEMCCD câmera para detecção de fótons
Laser 405, 488, 561, 640 nmCW-OBISLasers para excitação
Insight3Zhuang Lab, Harvard UniversitySoftware de localização de molécula única
L-GlutaminaGibco25030-081Aminoácido necessário para a
solução de imagem de células vivasde cultura de células ThermoFisherA14291DJTampão de imagem
Lysotracker GreenThermoFisherL7526Marcador de lisossomo baseado em Bodipy
Células ATCC U2OS de mamíferos (Manassas, VA)Dr. Jochen Mueller (Universidade de Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.ANikonImersão em óleo objetivo
Penicilina estreptomicinaGibco15140-122Antibióticos
Piruvato de SódioGibco11360-070Suplemento para cultura de células
T562lpxrDivisor de feixecromado
Tripsina-EDTAGibco15400-054Dissociação da célula aderente
W303 MATa cepaHorizon-DharmaconYSC1058Cepa de levedura parental
Base de nitrogênio de leveduraSigma-AldrichY1250Base de nitrogênio sem aminoácidos
zt405/488/561/640rdcChromaQuadband espelho dicróico
de Harvard

Referências

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  1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.

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