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Artigo de método

Conjugados BODIPY convencionais para microscopia de super-resolução de células vivas e rastreamento de moléculas únicas

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DOI:

10.3791/60950

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8 de junho de 2020

 ,  ,  , 
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), 2Middlebury College

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Conjugados BODIPY convencionais podem ser usados para microscopia de localização de moléculas únicas de células vivas (SMLM) através da exploração de seus dimers de estado terrestre transitoriamente formados. Apresentamos um protocolo SMLM otimizado para rastrear e resolver lipídios neutros subcelulares e ácidos graxos em células de mamíferos vivos e leveduras na escala de comprimento nanoscópico.

Resumo

As técnicas de microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM) superam o limite de difração óptica da microscopia convencional de fluorescência e podem resolver estruturas intracelulares e a dinâmica das biomoléculas com precisão de ~20 nm. Um pré-requisito para SMLM são fluoroforos que transitam de um estado escuro para um fluorescente, a fim de evitar a sobreposição espátula-temporal de suas funções de spread de ponto em cada um dos milhares de quadros de aquisição de dados. BodipYs são corantes bem estabelecidos com numerosos conjugados usados na microscopia convencional. A formação transitória de dimers de estado terrestre BODIPY de mudança vermelha (DII) resulta em emissão de molécula única brilhante permitindo microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM). Aqui apresentamos um protocolo simples, mas versátil para SMLM com conjugados BODIPY convencionais em leveduras vivas e células de mamíferos. Este procedimento pode ser usado para adquirir imagens de super-resolução e para rastrear estados bodipy-DII únicos para extrair informações espáteris-temporais de conjugados BODIPY. Aplicamos este procedimento para resolver gotículas lipídicas (LDs), ácidos graxos e lisosomos em leveduras vivas e células mamíferas na escala de comprimento nanoscópico. Além disso, demonstramos a capacidade de imagem multicolorido com corantes BODIPY quando usados em conjunto com outras sondas fluorescentes. Nossos resultados representativos mostram a distribuição espacial diferencial e a mobilidade dos ácidos graxos BODIPY e lipídios neutros na levedura sob condições alimentadas e jejuadas. Este protocolo otimizado para SMLM pode ser usado com centenas de conjugados BODIPY disponíveis comercialmente e é um recurso útil para estudar processos biológicos na nanoescala muito além das aplicações deste trabalho.

Introdução

Técnicas de microscopia de localização de molécula única (SMLM), como microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) e microscopia de localização ativada por foto (PALM) surgiram como métodos para gerar imagens de super-resolução com informações além do limite de difração óptica da Abbe1,,2 e para o rastreamento da dinâmica de biomoléculas únicas3,,4. Um dos requisitos para sondas compatíveis com SMLM é a capacidade de controlar o número de fluoroforos ativos a qualquer momento para evitar a sobreposição espacial de suas funções de propagação de ponto (PSF). Em cada um dos milhares de quadros de aquisição de dados, a localização de cada fluoroforos fluorescentes é então determinada com precisão de ~20 nm, encaixando sua função de propagação de ponto correspondente. Tradicionalmente, o piscar on-off de fluoroforos tem sido controlado através de fotostocásticas1,,2,5 ou quimicamente induzido piscando6. Outras abordagens incluem a ativação induzida de fluorogens sobre a ligação transitória a uma proteína ativante de fluorogen7,8 e a vinculação programável de oligômeros de DNA rotulados em fluorescência de reflexão interna total (TIRF) ou excitação de folha de luz9. Recentemente, relatamos uma nova e versátil estratégia de rotulagem para o SMLM10, na qual os estados diméricos de mudança vermelha (DII)anteriormente relatados de boro di-pirometano convencional (BODIPY) conjugados11,,12,13 estão se formando transitoriamente e tornam-se especificamente animados e detectados com comprimentos de onda de mudança vermelha.

BODIPYs são corantes amplamente utilizados com centenas de variantes que rotulam especificamente compartimentos subcelulares e biomoléculas14,,15,,16. Devido à sua facilidade de uso e aplicabilidade em células vivas, as variantes BODIPY estão comercialmente disponíveis para microscopia de fluorescência convencional. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado e otimizado sobre como as centenas de conjugados BODIPY disponíveis comercialmente podem ser usados para SMLM de células vivas. Ao ajustar a concentração de monômeros BODIPY e otimizando os poderes de laser de excitação, os parâmetros de análise de imagens e dados, imagens de super-resolução de alta qualidade e dados de rastreamento de moléculas únicas são obtidos em células vivas. Quando utilizados em baixa concentração (25-100 nM), os conjugados BODIPY podem ser usados simultaneamente para SMLM no canal de mudança vermelha e para microscopia de fluorescência convencional correlativa no canal de emissão convencional. Os dados de molécula única obtidos podem ser analisados para quantificar a organização espacial de estruturas imóveis e extrair os estados difusivos de moléculas em células vivas17. A disponibilidade de sondas BODIPY em formas verde e vermelha permite imagens multicoloridos quando usadas na combinação certa com outros fluoroforos compatíveis.

Neste relatório, fornecemos um protocolo otimizado para aquisição e análise de dados SMLM de células vivas usando BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 vermelho e verde-lysotracker em múltiplas cores. Resolvemos ácidos graxos e lipídios neutros em leveduras vivas e células mamíferas com resolução de ~30 nm. Demonstramos ainda que as células de levedura regulam a distribuição espacial de ácidos graxos adicionados externamente, dependendo de seu estado metabólico. Descobrimos que os ácidos graxos BODIPY (FA) adicionados localizam-se ao ânticulo endoplasmático (ER) e gotículas lipídicas (LDs) sob condições alimentadas, enquanto bodipy-FAs formam aglomerados não-LD na membrana plasmática após o jejum. Estendemos ainda mais a aplicação dessa técnica a líssomos de imagem e LDs em células de mamíferos vivos. Nosso protocolo otimizado para SMLM usando conjugados BODIPY convencionais pode ser um recurso útil para estudar processos biológicos na nanoescala com a miríade de conjugados BODIPY disponíveis.

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Protocolo

NOTA: Para clonagem de levedura e marcação endógena, consulte nossa publicação recente10.

1. Preparação de amostras de células de levedura para imagem

  1. Prepare uma cultura líquida durante a noite de uma cepa de levedura w303. Usando uma vara de madeira estéril, localmente uma pequena quantidade de células de levedura de uma placa de ágar contendo extrato de levedura -peptone-dextrose em um tubo de cultura com ~2 mL de meio sintético de dextrose completa (SCD). Incubar o tubo durante a noite em uma incubadora de agitação a 270 rpm e 30 °C.
  2. Realize uma diluição de 1:50 manhã das células em SCD. Continue a cultivar as células diluídas por 4h a 30 °C em uma incubadora de agitação de 270 rpm, permitindo que as células cresçam em fase exponencial e alcancem uma densidade óptica (OD) de ~0,6.
    NOTA: O procedimento pode variar aqui dependendo do estado metabólico que está sendo estudado. Os conjugados BODIPY não requerem células na fase de crescimento exponencial. No entanto, fique ciente da autofluorescência de células mortas durante a fase estacionária, pois pode causar um sinal de fundo muito forte para analisar emissores BODIPY-DII únicos.
  3. Para estudar células de jejum, cresça a cultura da levedura por 2 dias sem troca de mídia.
  4. A ~30 minutos antes de emplacamento das células, incubar um vidro de cobertura com 80 μL de 0,8 mg/mL estéril Concanavalin A (ConA) em H2O desionizado à temperatura ambiente. Depois de 30 min, lave a tampa três vezes com H2O desionizado.
  5. Em ~30 minutos antes da imagem, pipete as células na tampa de câmara, com o volume correto de SCD fresco para alcançar uma densidade óptica de ~0,12 (tipicamente cultura de levedura de 60 μL em OD ~0,6 em 240 μL SCD). Deixe as células se estabelecerem e aderirem à superfície do por 30 minutos.
  6. Adicione o conjugado BODIPY desejado diretamente ao vidro de cobertura câmara em uma concentração final de ~100 nM.
    NOTA: Um experimento de otimização de concentração BODIPY pode ser necessário dependendo da densidade local da BODIPYs em um determinado compartimento celular.

2. Preparação de células mamíferas para imagem SMLM

  1. Mantenha as células U2OS mâmicas em DMEM não fluorescentes com soro bovino fetal de 10%, glutamina de 4 mM, piruvato de sódio de 1 mM e 1% antibióticos de penicilina-estreptomicina em um frasco T25.
    NOTA: As células também podem ser mantidas no DMEM com soro bovino fetal de 10% e 1% de antibióticos de penicilina-estreptomicina, no entanto, o meio precisa ser trocado antes da imagem com uma solução não autofluorescente.
  2. Divida as células a 70-80% de confluência 1:5 em um único poço de uma placa de 8 poços. Cultue as células na placa de 8 poços por 12 a 24 horas antes da imagem.
  3. Adicione BODIPY-C12, LysoTracker Green ou qualquer outro conjugado BODIPY em uma concentração final de 100 nM (soluções de estoque em sulfóxido de dimetil [DMSO]) 10 minutos antes da imagem. Este tempo pode variar de acordo com o experimento desejado.
    NOTA: A imagem pode ser realizada à temperatura ambiente (23 °C) usando uma solução de imagem de células vivas. No entanto, a imagem a 37 °C e 5% de CO2 com DMEM não fluorescente misturada com soro bovino fetal de 10%, 4 mM de glutamina, piruvato de sódio de 1 mM e 1% antibióticos de penicilina-estreptomicina é preferível manter as células mais próximas das condições fisiológicas e tirar conclusões biológicas.

3. Preparação do equipamento

  1. Monte os conjuntos de filtros apropriados no caminho de emissão com base na cor de emissão do BODIPY que está sendo utilizado.
    NOTA: Um espelho dicroico de banda quádrupla (zt/405/488/561/640rdc) separa pela primeira vez a excitação da luz de emissão. A emissão verde (525 nm) e a emissão vermelha (595 nm) são então divididas por um divisor de feixe de passagem longa dicroico (T562lpxr), seguido pelos filtros de passe de banda ET525/50 no canal verde e ET 595/50 no canal vermelho. Os dois canais são então projetados para diferentes áreas do mesmo chip de câmera. Da mesma forma, a emissão vermelha (595 nm) e a emissão de vermelho distante são primeiramente divididas por um divisor de feixe de passagem longadicróica (FF652-Di01) seguido pelos filtros de passe de banda ET 610/75 no vermelho e FF731/137 no canal vermelho.
  2. Ligue o microscópio, o estágio do microscópio, os lasers (488 nm, 561 nm) e a câmera. Aqui são utilizados um microscópio invertido com um sistema de foco perfeito e uma câmera EMCCD refrigerado a -68 °C.
  3. Adicione uma gota de óleo de imersão no objetivo do microscópio.
  4. Abra o software Hal4000 (veja a Tabela de Materiais)que controla a luz LED para imagens de campo brilhante, poderes a laser, persianas a laser e configurações de câmera para imagens. Defina o ganho emccd para 30 e a temperatura da câmera para -68 °C. Prepare a câmera e o software correspondente para gravar filmes a 20 Hz.
    NOTA: Esta técnica se aplica a qualquer microscópio de campo largo capaz de microscopia de localização ativada por foto (PALM) e imagens de microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM). O software correspondente pode variar.
  5. Ligue o aquecedor do estágio do microscópio e coloque-o a uma temperatura de 37 °C e a um nível de CO2 de 5%. Ajuste a coleira de correção objetiva em conformidade.
  6. Monte a amostra no estágio do microscópio e concentre-se até que o sistema de foco se envolva. Mova o estágio usando o controlador de palco até que as células saudáveis apareçam no campo de visão.
    NOTA: Para imagens com células de leveduras à temperatura ambiente, não há necessidade de ligar o aquecedor ou o controle de CO2.
  7. Ligue os lasers apropriados para a excitação de monômeros, bem como dimers. Para verde BODIPY ou verde LysoTracker, usamos um laser de 561 nm para excitar os estados DII para SMLM e um laser de 488 nm para excitar monômeros para fluorescência convencional.
    NOTA: Para vermelho BODIPY, use um laser de 640 nm para excitar os estados DII para SMLM e um laser de 561 nm para excitar os monômeros para fluorescência convencional. Para o vermelho BODIPY, ajuste os poderes laser de 561 nm e 640 nm para visualizar fluorescência a granel no canal vermelho e uma única molécula estoura no canal vermelho. A potência típica para 561 nm é ~0,06 W/cm2 e ~5 kW/cm2 para 640 nm. Para o verde BODIPY, espere também ver fluorescência convencional no canal de emissão verde abaixo de 561 nm excitação. Para o vermelho BODIPY, espere ver fluorescência convencional no canal vermelho sob excitação de 640 nm. Este sinal surge da emissão anti-Stokes, que se torna útil para imagens de co-localização monômeros/dimer com excitação a laser contínua.

4. Aquisição de dados

  1. Carregue sequências de obturadores laser para a excitação de monômeros, bem como dimers.
    NOTA: Normalmente usamos nove quadros de excitação de molécula única a 561 nm seguidos por um quadro de excitação convencional a 488 nm. Isso oferece um sinal de fluorescência convencional mais brilhante e evita o vazamento de outro fluoróforo excitável de 488 nm, como a proteína fluorescente verde (GFP) no canal vermelho de detecção de molécula única em aplicações de imagem multicolorida. Alternativamente, ligue o laser de 561 nm continuamente e conte com a emissão anti-Stokes para imagens convencionais no canal de comprimento de onda mais curto.
  2. Sintonize os poderes de laser de tal forma que explosões de fluorescência de molécula única são detectadas no canal de emissão deslocada para vermelho sob excitação de 561 nm, e a fluorescência convencional aparece no canal de emissão verde com excitação de 488 nm. As potências laser típicas do laser de 561 nm serão em torno de 0,8-1 kW/cm2 para SMLM, e 0,035-0,07 W/cm2 para o laser de 488 nm no modo convencional de imagem de fluorescência.
  3. Escolha uma pasta de destino para filmes e grave de 5.000 a 20.000 quadros de aquisição para coletar localizações suficientes para reconstruir imagens de super resolução.
  4. Mova-se para diferentes campos de visão e repita os passos acima para coletar dados de mais células.

5. Análise de dados e rastreamento de molécula única

  1. Carregue o filme em um software de análise SMLM.
    NOTA: Qualquer software18 pode ser usado. Usamos insight (ver a Tabela de Materiais) e validamos os resultados usando o plugin ThunderSTORM19 para imageJ (Fiji).
  2. Visualmente tela o filme e ajustar configurações de contraste de modo que a fluorescência de molécula única piscando é visível. Se necessário, restringir a região ou a faixa de quadros para análise de dados SMLM se partes da amostra estiverem continuamente fluorescentes.
  3. Defina parâmetros de identificação de molécula única para encaixe com PSFs gaussianos 2D (ROI: 7 x 7 pixels com tamanho de pixel de 160 nm, largura 260-650 nm, altura > 50 fótons). Visualmente tela através de alguns quadros de exemplo para verificar os parâmetros de identificação e detectar de forma confiável as distintas rajadas de fluorescência de molécula única (ver Figura 1C).
    NOTA: Certos parâmetros de identificação, como altura e largura, podem ser ligeiramente ajustados para otimizar o reconhecimento de sinais de fluorescência de molécula única visualmente percebidos.
  4. Realize a análise de imagem SMLM com os parâmetros de identificação otimizados e, em seguida, torne cada molécula como um gaussiano 2D cuja largura é ponderada pela raiz quadrada inversa do número detectado de fótons.
  5. Avalie a qualidade dos dados. Use faixas de quadros restritas para observar distribuições de moléculas únicas em instâncias mais específicas no tempo. Isso pode explicar a movimentação de organelas durante a aquisição de dados.
  6. Para analisar melhor a distribuição espacial e a dinâmica das distribuições das moléculas, exporte a lista de moléculas obtidas contendo as coordenadas, quadros de aparência, fótons, larguras e alturas das localizações. Importe a lista de moléculas em procedimentos personalizados de análise por escrito.
  7. Para a obtenção de informações espaciais da distribuição de molécula única, calcule a função de distribuição radial ρ(r), que representa a densidade das localizações em função da distância radial20. Para obter ρ(r), calcular distâncias únicas em pares de todas as localizações, construir o histograma com caixas centradas em ri com altura H(ri) e com uma largura dr e dividir por 2πri*dr; (ρ(ri) = H(ri)/π(ri+dr)2-ri2). A função de distribuição radial pode então ser usada para quantificar e comparar o grau de agrupamento, bem como o tamanho característico dos clusters.
  8. Para obter informações dinâmicas sobre a difusão de moléculas, vincule localizações que aparecem, por exemplo, dentro de 3 pixels (0,48 μm) em quadros consecutivos de aquisição de dados para criar traços de molécula única.
    NOTA: A distância de ligação dependerá da difusão de moléculas e da densidade das localizações. A distância máxima de ligação pode ser estimada analisando a densidade de localizações em cada quadro21,22. A densidade média foi determinada em 0,043 localizações por μm2; assim, um raio de 0,48 μm estava dentro de uma densidade baixa o suficiente para garantir que diferentes moléculas não estivessem ligadas juntas.
  9. Média dos deslocamentos para diferentes tempos de lag Δt de múltiplos traços com duração mínima de três tempos de atraso para criar um deslocamento médio quadrado (MSD) vs. Δt plot. Ajuste a curva MSD vs. Δt com a equação MSD = 4DΔt + σ2 para calcular o coeficiente de difusão média D3.

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Resultados

Aqui, apresentamos um procedimento otimizado de preparação amostral, aquisição de dados e análise para SMLM utilizando conjugados BODIPY com base no protocolo acima(Figura 1A). Para demonstrar um exemplo do fluxo de trabalho para aquisição e análise de dados SMLM, empregamos BODIPY (493/503) em leveduras para resolver LDs abaixo do limite de difração óptica(Figura 1B-F). Exemplos dos diferentes modos de imagem multicoloridos do BODIPY em conjunt...

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Discussão

Neste protocolo, demonstramos como conjugados BODIPY convencionais podem ser usados para obter imagens SMLM com uma ordem de melhoria de magnitude na resolução espacial. Este método baseia-se na exploração de estados DII previamente relatados de corantes BODIPY convencionais, que se formam transitoriamente através de encontros bi-moleculares. Esses estados podem ser especificamente animados e detectados com comprimentos de onda com mudanças vermelhas e são esparsos e de curta duração suficiente para SMLM. Ao a...

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Divulgações

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Agradecimentos

A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o prêmio número R21GM127965.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BODIPY C12ThermoFisherD3822Análogo de ácido graxo verde
BODIPY C12 VermelhoThermoFisherD3835Análogo de ácido graxo vermelho
BODIPY (493/503)ThermoFisherD3922Marcador lipídico neutro
Concanavalina ASigma-AldrichC2010Imobilização celular na superfície do vidro
Mistura de gota completa sem base de nitrogênioAminoácidos biológicos dos E.U.D9515para SCD
DextroseSigma-AldrichG7021Fonte do carbono para SCD
Oito poçosCellvisC8-1.58-NChambered Coverglasses
Eight Well, Lb-Tek IISigma-AldrichChambered Coverglasses
ET525/50ChromaFiltro passa-banda
ET595/50ChromaFiltro passa-banda
ET610 / 75Filtro passa-bandacroma
Soro bovino fetal (FBS)Soro26140079
Gibco FF652Divisor de feixeSemrock
FF731 / 137Filtro passa-bandaSemrock
FluoroBrite DMEMThermoFisherA1896701Meio
de cultura celularHal4000Zhuang Lab, UniversidadeSoftware de aquisição
de dados Ixon89Ultra DU-897UAndorEMCCD câmera para detecção de fótons
Laser 405, 488, 561, 640 nmCW-OBISLasers para excitação
Insight3Zhuang Lab, Harvard UniversitySoftware de localização de molécula única
L-GlutaminaGibco25030-081Aminoácido necessário para a
solução de imagem de células vivasde cultura de células ThermoFisherA14291DJTampão de imagem
Lysotracker GreenThermoFisherL7526Marcador de lisossomo baseado em Bodipy
Células ATCC U2OS de mamíferos (Manassas, VA)Dr. Jochen Mueller (Universidade de Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.ANikonImersão em óleo objetivo
Penicilina estreptomicinaGibco15140-122Antibióticos
Piruvato de SódioGibco11360-070Suplemento para cultura de células
T562lpxrDivisor de feixecromado
Tripsina-EDTAGibco15400-054Dissociação da célula aderente
W303 MATa cepaHorizon-DharmaconYSC1058Cepa de levedura parental
Base de nitrogênio de leveduraSigma-AldrichY1250Base de nitrogênio sem aminoácidos
zt405/488/561/640rdcChromaQuadband espelho dicróico
de Harvard

Referências

  1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  3. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
  4. Wu, C. -Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), New York, N.Y. 4077(2015).
  5. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), International Ed. in English 6172-6176 (2008).
  6. Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
  7. Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
  8. Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
  9. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  10. Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  11. Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
  12. Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
  13. Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
  14. Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
  15. Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
  16. Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
  17. Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
  18. Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
  19. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), Oxford, England. 2389-2390 (2014).
  20. Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
  21. Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  22. Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
  23. Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
  24. Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
  25. Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
  26. Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348(2015).
  27. Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).

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Reimpressões e permissões

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Microscopia de Localização de Molécula ÚnicaImagem de Gotículas LipídicasRastreamento de Ácidos GraxosImagem de Células VivasMicroscopia de FluorescênciaOtimização da Potência do LaserBODIPY-C12
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