Um modelo de rato de sobrecarga de pressão induzida remodelação moderada e disfunção sistólica em oposição à insuficiência cardíaca sistólica overt

Resumo

Descrevemos a criação de um modelo de rato de sobrecarga de pressão induzida remodelação moderada e disfunção sistólica precoce onde as vias de transdução de sinal envolvidas no início do processo de remodelação são ativadas. Este modelo animal ajudará na identificação de alvos moleculares para a aplicação de estratégias terapêuticas precoces anti-remodelação para insuficiência cardíaca.

Resumo

Em resposta a uma lesão, como infarto do miocárdio, hipertensão prolongada ou agente cardiotóxico, o coração se adapta inicialmente através da ativação de vias de transdução de sinal, para neutralizar, a curto prazo, a perda de miócitos cardíacos e ou o aumento do estresse na parede. No entanto, a ativação prolongada dessas vias torna-se prejudicial levando à iniciação e propagação da remodelagem cardíaca levando a mudanças na geometria ventricular esquerda e aumentos nos volumes ventriculares esquerdos; um fenótipo visto em pacientes com insuficiência cardíaca sistólica (HF). Aqui, descrevemos a criação de um modelo de rato de sobrecarga de pressão induzida por remodelação moderada e disfunção sistólica precoce (MOD) por banda aórtica ascendente (AAB) através de um clipe vascular com uma área interna de 2 mm². A cirurgia é realizada em 200 g de ratos Sprague-Dawley. O fenótipo MOD HF desenvolve-se 8-12 semanas após a AAB e é caracterizado não invasivamente por meio de ecocardiografia. Trabalhos anteriores sugerem a ativação de vias de transdução de sinal e a expressão genética alterada e modificação pós-translacional de proteínas no fenótipo MOD HF que imitam aquelas vistas em HF sistólico humano; portanto, tornando o fenótipo MOD HF um modelo adequado para pesquisas translacionais para identificar e testar potenciais alvos terapêuticos anti-remodelação em HF. As vantagens do fenótipo MOD HF em comparação com o fenótipo hf sistólico é que permite a identificação de alvos moleculares envolvidos no processo de remodelação precoce e a aplicação precoce de intervenções terapêuticas. A limitação do fenótipo MOD HF é que ele pode não imitar o espectro de doenças que levam ao HF sistólico em humanos. Além disso, é um fenótipo desafiador a ser criado, pois a cirurgia AAB está associada a altas taxas de mortalidade e falha com apenas 20% dos ratos operados desenvolvendo o fenótipo HF desejado.

Introdução

A insuficiência cardíaca (FF) é uma doença prevalente e está associada à alta morbidade e mortalidade¹. Os modelos de sobrecarga de pressão de roedores (PO) de HF, produzidos por bandas aórticas ascendentes ou transversais, são comumente usados para explorar mecanismos moleculares que levam ao HF e para testar potenciais novos alvos terapêuticos em HF. Eles também imitam mudanças observadas no HF humano secundário à hipertensão sistêmica prolongada ou estenose aórtica grave. Após po, a parede ventricular esquerda (LV) aumenta gradualmente em espessura, um processo conhecido como hipertrofia LV concêntrica (LVH), para compensar e adaptar-se ao aumento do estresse da parede LV. No entanto, isso está associado à ativação de uma série de vias de sinalização mal adaptáveis, que levam a desarranjos no ciclismo de cálcio e homeostase, remodelação da matriz metabólica e extracelular e alterações na expressão genética, bem como apoptose e autofagia^{aprimoradas 2,3,4,5,6}. Essas mudanças moleculares constituem o gatilho para a iniciação e propagação da remodelagem do miocárdio e transição para um fenótipo HF decompensado.

Apesar do uso de cepas de roedores inadeados e da padronização do tamanho do clipe e da técnica cirúrgica, há uma tremenda variabilidade phenotípica na estrutura da câmara lv e função nos modelos de banda aórtica^7,8,9. A variabilidade faitípica encontrada após po em rato, cepa Sprague-Dawley, é descrita em outro lugar^10,11. Desses, dois fenótipos de HF são encontrados com evidências de remodelação do miocárdio e ativação de vias de transdução de sinal levando a um estado de estresse oxidativo aumentado. Isso está associado à remodelação metabólica, à expressão genética alterada e às alterações na modificação pós-tralácida das proteínas, desempenhando um papel no processo de remodelação^10,12. O primeiro é um fenótipo de remodelação moderada e disfunção sistólica precoce (MOD) e o segundo é um fenótipo de HF sistólico sobreaberto (HFrEF).

O modelo PO de HF é vantajoso sobre o modelo de infarto do miocárdio (MI) de HF porque as tensões de parede circunferencial e merirental induzidas por PO são distribuídas de forma homogênea em todos os segmentos do miocárdio. No entanto, ambos os modelos sofrem de variabilidade na gravidade da PO^10,11 e no tamanho do infarto^13,14 juntamente com inflamação intensa e cicatrizes no local do infarto^15, bem como adesão à parede torácica e tecidos circundantes, que são observados no modelo MI de HF. Além disso, o modelo hf induzido por perfto de rato po é desafiador de criar, pois está associado a altas taxas de mortalidade e falha¹⁰, com apenas 20% dos ratos operados desenvolvendo o fenótipo MOD HF¹⁰.

O MOD é um fenótipo HF atraente e constitui uma evolução do fenótipo HFrEF tradicionalmente criado, pois permite o direcionamento precoce de vias de transdução de sinal que desempenham um papel na remodelação do miocárdio, especialmente quando se refere a perturbações na dinâmica e função mitocondrial, metabolismo miocárdico, ciclismo de cálcio e remodelação da matriz extracelular. Estes processos fisiopatológicos são altamente evidentes no fenótipo MOD HF¹¹. Neste manuscrito, descrevemos como criar os fenótipos MOD e HFrEF e abordamos armadilhas enquanto executamos o procedimento de banda aórtica ascendente (AAB). Também elaboramos sobre como melhor caracterizar pela ecocardiografia os dois fenótipos hf, MOD e HFrEF, e como diferenciá-los de outros fenótipos que não desenvolvem PO grave ou que desenvolvem po severo e remodelação concêntrica, mas sem remodelagem excêntrica significativa.

Protocolo

Todos os métodos e procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade de Tulane.

1. Ferramentas e instrumentos para criação de modelos AAB

1. Obter desinfetantes, como 70% álcool isopropílico e povidone-iodo.
2. Obtenha cetamina e xilazina para anestesia e buprenorfina para analgesia.
3. Obtenha uma almofada de aquecimento e subpad descartável de absorção pesada com as dimensões de 18 polegadas x 30 polegadas.
4. Obtenha um rolo de fio de algodão 100%, uma fita e um cortador de cabelo.
5. Obter uma placa plástica de 20 cm x 25 cm, faixa de espessura entre 3-5 mm.
6. Obtenha um iluminador de fibra óptica Z-LITE.
7. Obter um ventilador mecânico para animais de pequeno porte (por exemplo, SAR-830/AP).
8. Obtenha suturas de aper de vicryl 2-0 e 3-0 e sutura de monofilamento de nylon 3-0, almofadas de gaze estéreis e pontas de algodão extra grandes estéreis e luvas estéreis.
9. Obtenha angiocath de 16 G para intubação.
10. Compre as seguintes ferramentas cirúrgicas.
    1. Obtenha uma ligadura hemoclip de aço inoxidável Weck e clipes de ligadura de aço inoxidável.
    2. Obter uma tesoura de íris fina endurecida.
    3. Obtenha fórceps Adson.
    4. Obtenha dois fórceps graefe curvos.
    5. Obtenha um hemostats-hemostats-straight de mosquito halsted.
    6. Obtenha um suporte de agulha Mayo-Hegar.
    7. Obtenha um retrátil alm com dentes contundentes.
11. Utilize e obtenha uma autoclave e um esterilizador de bicos.

2. Procedimento cirúrgico de banda aórtica ascendente

1. Anestesiar o animal com uma injeção intraperitoneal de uma mistura de 75-100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de Xilazina.
   NOTA: Aguarde alguns minutos para que o animal esteja completamente sedado e flácido. Se a dose anestéstica não for suficiente e o animal ainda estiver se movendo na gaiola, reinje o animal com a mesma dose anestéstica depois de permitir tempo suficiente, cerca de 5-10 minutos entre as injeções subsequentes. A maioria dos animais necessita de 1-2 injeções para alcançar sedação profunda e anestesia.
2. Raspe o cabelo no local cirúrgico localizado na área torácica lateral direita sob a axila direita.
3. Estabilize o animal batendo suavemente todos os quatro membros na placa de plástico. Em seguida, realize a intubação endotraqueal com um angiocath de 16 G. Após a intubação do animal, inicie a ventilação mecânica com volumes de maré de 2 mL a 50 ciclos/min e FiO₂ de 21%. Procure o aumento simétrico na parede torácica a cada respiração.
4. Gire o animal lentamente para deitar no lado esquerdo lateral e, em seguida, dobre a cauda de forma em U e estabilize-o batendo-o suavemente na placa de plástico. Em seguida, vá em frente e desinfete a área raspada com aplicação tópica de povidone-iodo.
5. Infiltrar-se na pele no local da incisão com mistura de 50/50 em volume de 1-2% lidocaína/0,25-0,5 % bupivacaína como analgesia preventiva antes de fazer a incisão.
6. Realize uma incisão horizontal da pele direita, de 1-2 centímetros de comprimento, na área axilar direita 1 cm abaixo da axila direita. Em seguida, disseque a camada muscular torácica até atingir a caixa torácica. Faça uma toracotomia de 1 cm entre a caixa^torácica 2 e^3.
   1. Ao dissecar a camada muscular do peito, tenha cuidado e evite lesões na artéria axilar direita, que corre por baixo da axila direita.
      NOTA: A toracotomia realizada entre a^1ª e a^2ª costela traz o risco de agrupar a artéria braquicefálica direita em vez da aorta ascendente. A toracotomia entre a^3ª e a quarta costela dificulta a visualização e a banda da aorta ascendente, pois o operador estará olhando para o átrio certo.
      NOTA: Evite estender a toracotomia muito mediadamente em direção ao esterno para evitar dissecar e ferir a artéria mamária interna direita.
7. Disseque os dois lóbulos da glândula timo suavemente e empurre-os para longe do lado. Em seguida, identifique a aorta ascendente e isole-a da veia cava superior por dissecção contundente através de um fórceps graefe curvo.
   NOTA: A manipulação significativa da glândula timo a deixará inchada e dificultará a visualização da aorta ascendente.
   1. Disseque a veia cava superior da aorta com cuidado extra para evitar lesões ou ruptura da veia cava superior, que é fatal. Esta pode ser a parte mais complicada do procedimento e espera-se que aconteça de tempos em tempos mesmo nas mãos mais experientes, mas muitas vezes com iniciantes e aprendizes.
8. Levante suavemente a aorta ascendente com um fórceps graefe curvo e coloque o clipe vascular em torno da aorta ascendente.
   1. Ajuste a ferramenta de ligadura do hemoclipe vascular através de uma peça plástica pré-cortada de 7" para obter um clipe vascular da área interna desejada de 1,5 mm² ou 2 mm², dependendo do modelo HF desejado.
9. Suturar o tórax através de uma sutura de monofilamento Vicryl 2-0. Em seguida, sutura a camada muscular do peito através de uma sutura 3-0 Vicryl. Em seguida, sutura a incisão da pele através de uma sutura de monofilamento nylon 3-0.
10. Administrar uma combinação dos seguintes medicamentos após a conclusão da cirurgia por 48-72 horas para servir como analgesia no período pós-operatório: 1) Buprenorfina 0,01-0,05 mg/kg subcutâneamente a cada 8-12h, 2) Meloxicam 2 mg/kg subcutâneamente a cada 12h, e 3) Morfina 2,5 mg/kg subcutâneamente a cada 2-4h conforme necessário para dor severa.
    NOTA: Deixe o animal se recuperar em uma almofada de aquecimento sob monitoramento regular. Uma vez que o animal apareça sinais de recuperação da anestesia (capaz de respirar espontaneamente - sem evidência de ofegante ou uso de músculos acessórios por mais de dois minutos - e tiver bons reflexos, extremidades vermelhas e quentes), extubar o animal e devolvê-lo à gaiola.

3. Ecocardiografia

1. Sedao o animal com injeção intraperitoneal de 80-100 mg/kg de cetamina. Garantir sedação adequada para aquisição adequada de imagens eco de boa qualidade.
   NOTA: O uso de isoflurano como anestésico é desencorajado para seu efeito cardiodepressor, especialmente na configuração de sobrecarga de pressão severa e pode dar uma falsa impressão de dilatação lv e disfunção sistólica que resolve uma vez que o animal está fora anestésico.
   1. Tenha cuidado e administre metade ou até mesmo um terço da dose de cetamina em animais que parecem disspneicos e taquipneicos com a suspeita de que eles desenvolveram o fenótipo HFrEF.
2. Raspe o cabelo do peito, anteriormente, no animal completamente sedado.
3. Coloque o animal de costas e estabilize-o na placa de plástico.
4. Adquira eixo longo parasternal 2D e clipes de visão de eixo curto parasternal 2D ao nível do músculo papilar. Além disso, obtenha imagens do modo M a partir da visão curta do eixo parasternal ao nível do músculo papilar para medir a espessura da parede septal e posterior de LV em diastole, bem como lv extremidade-diastólica e diâmetro sistólica final.
   1. Adquira imagens ou clipes a uma freqüência cardíaca de 370 - 420 batidas por minuto para garantir uma avaliação adequada do tamanho e função de LV. A aquisição de imagens a taxas cardíacas mais baixas levará a uma falsa impressão de função LV deprimida e dilatação lv.
      NOTA: A aquisição de imagens/clipes de visualização de eixoparasternal 2D encurtados por abreviação de 2D levam a medições falsas. Para fins de controle de qualidade, certifique-se de que o ápice LV e o ângulo aorto-mitral sejam visualizados dentro do mesmo corte de plano.
   2. Adquira imagens/clipes de visualização de eixo parasternal curto 2D ao nível do músculo papilar médio. Isso servirá como referência para obter medições de LV seriais e subseqüentes confiáveis enquanto acompanha os animais ao longo do tempo durante o período de estudo.
5. Obter imagens do modo M em uma visão de eixo parasternal longo no nível da válvula aórtica para avaliar o diâmetro relativo do ártrico a esquerdo (LA) na sístole final.
   NOTA: Os animais com os fenótipos MOD e HFrEF devem apresentar evidências de dilatação la com razão LA/Ao sendo ≥1,25 e <1,5 no fenótipo MOD HF e ≥1,5 no fenótipo HFrEF¹⁰.

Resultados

A caracterização dos fenótipos de HF, que se desenvolvem de 8 a 12 semanas após a AAB, poderia ser facilmente realizada através da ecocardiografia. Imagens representativas do modo M de Sham, Semana 3 pós-AAB, MOD e hfref fenótipos são apresentadas na Figura 1A. A Figura 1B e a Figura 1C estão mostrando o tamanho do clipe vascular para a criação do fenótipo MOD HF...

Discussão

Após po relacionado à AAB em rato, o LV passa por remodelação concêntrica aumentando a espessura da parede LV, conhecida como LVH concêntrica, como um mecanismo compensatório para neutralizar o aumento do estresse da parede LV. O aumento da espessura da parede LV torna-se perceptível durante a primeira semana após a AAB e atinge sua espessura máxima em 2-3 semanas após o AAB. Durante esse período, a ativação de vias de transdução de sinal mal adaptáveis leva ao alargamento progressivo do LV com aumentos nos volumes de LV...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pinça Adson	F.S.T.	11019-12	ferramenta cirúrgica
Afastador de tórax Alm com dentes rombos	ROBOZ	RS-6510	ferramenta cirúrgica
Pinça Graefe, curvada	F.S.T.	11152-10	ferramenta cirúrgica
Halsted-Mosquito Hemostats, direto	F.S.T.	13010-12	ferramenta cirúrgica
Tesoura de íris fina endurecida, reta	Fine Science Tools FST	14090-11	ferramenta cirúrgica
hemoclip clipe de ligação de aço inoxidável tradicional	Weck	523735	ferramenta cirúrgica
Mayo-Hegar porta-agulha	FST	12004-18	ferramenta cirúrgica
ventilador mecânico	CWE inc	SAR-830 / AP	ventilador mecânico para pequenos animais
Weck aço inoxidável Hemoclip ligadura	Weck	533140	ferramenta cirúrgica