Relatamos um protocolo para a produção de uma membrana lipídica híbrida na interface água/ar dopando a bicamada lipídica com moléculas de cobre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butil-29H,31H-phthalocyanine (CuPc). A membrana lipídica híbrida resultante tem uma estrutura de sanduíche lipídida/CuPc/lipídio. Este protocolo também pode ser aplicado à formação de outros nanomateriais funcionais.
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Artigo de método
Auto-montagem de membranas lipídicas híbridas dopadas com moléculas orgânicas hidrofóbicas na interface água/ar
Neste artigo
Resumo
Resumo
Devido às suas propriedades únicas, incluindo uma espessura ultrathin (3-4 nm), resistividade ultra-alta, fluidez e capacidade de auto-montagem, bicamadas lipídicas podem ser facilmente funcionais e têm sido usadas em várias aplicações, como bio-sensores e bio-dispositivos. Neste estudo, introduzimos uma molécula orgânica planar: cobre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butil-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) para dopar membranas lipídicas. A membrana híbrida CuPc/lipídica se forma na interface água/ar por auto-montagem. Nesta membrana, as moléculas de CuPc hidrofóbicas estão localizadas entre as caudas hidrofóbicas de moléculas lipídicas, formando uma estrutura de sanduíche lipídico/CuPc/lipídio. Curiosamente, um bicamador lipídado híbrido estável no ar pode ser prontamente formado transferindo a membrana híbrida para um substrato Si. Relatamos um método simples para incorporar nanomateriais em um sistema de bicamadas lipídicas, o que representa uma nova metodologia para a fabricação de biosensores e biodispositivos.
Introdução
Como estruturas essenciais das membranas celulares, o interior das células são separados do exterior por um sistema lipídetivo bicamada. Este sistema consiste em fosfolipídios anfífilicos, que são compostos por ésterso fosfórico hidrofílico "cabeças" e ácidos graxos hidrofóbicos "caudas". Devido à notável fluidez e capacidade de auto-montagem de bicamadas lipídicas em ambiente aquoso1,2, bicamadas lipídicas artificiais podem ser formadas usando métodos simples3,4. Vários tipos de proteínas de membrana, como canais de íons, receptores de membrana e enzimas, foram incorporadas na bicamada lipídica artificial para imitar e estudar as funções das membranas celulares5,6. Mais recentemente, bicamadas lipídicas foram dopadas com nanomateriais (por exemplo, nanopartículas metálicas, grafeno e nanotubos de carbono) para formar membranas híbridas funcionais7,8,9,10,11,12,13. Um método amplamente utilizado para a formação dessas membranas híbridas envolve a formação de vesículas lipídicas dopadas, que contêm materiais hidrofóbicos, como nanotuculas Au-nanopartículasmodificadas 7 ou nanotubos de carbono11,e as vesículas resultantes são então fundidas em bicamadas lipídicas apoiadas por planares. No entanto, essa abordagem é complexa e demorada, o que limita o uso potencial dessas membranas híbridas.
Neste trabalho, as membranas lipídicas foram dopadas com moléculas orgânicas para produzir membranas lipídicas híbridas que se formaram na interface água/ar por auto-montagem. Este protocolo envolve três etapas: preparação da solução mista, formação de uma membrana híbrida na interface água/ar e transferência da membrana para um substrato Si. Comparado com outros métodos relatados anteriormente, o método descrito aqui é mais simples e não requer instrumentação sofisticada. Usando este método, membranas lipídicas híbridas estáveis no ar com uma área maior podem ser formadas em um tempo menor. O nanomaterial utilizado neste estudo é uma molécula orgânica semicondutora, cobre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butil-29H,31H-phthalocyanine (CuPc), que é amplamente utilizado em uma série de aplicações, incluindo células solares, fotodetetores, sensores de gás e catálise14,15. CuPc, uma pequena molécula orgânica com uma estrutura planar, tem uma alta afinidade com as "caudas" da dupla de fosfolipídios com suas características hidrofóbicas. Outros grupos relataram que as moléculas de CuPc podem se auto-montar em superfícies de cristal único com a formação de estruturas altamente ordenadas16,17. Portanto, é altamente possível que as moléculas de CuPc possam ser incorporadas aos bicamadas lipídicos através da auto-montagem.
Fornecemos uma descrição detalhada dos procedimentos utilizados para formar membranas e fornecemos algumas sugestões para implementar suavemente este procedimento. Além disso, apresentamos alguns resultados apresentá-inativos das membranas lipídicas híbridas e discutimos possíveis aplicações desse método.
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Protocolo
1. Preparação de uma solução híbrida
- Lave quatro frascos de vidro descartáveis de 4 mL e tampas de parafuso (com selos revestidos de PTFE) em um banho ultrassônico por 10 min em água destilada (purificada com um sistema de filtragem), seguida por etanol e clorofórmio, respectivamente. Seque os frascos de vidro e as tampas em um fluxo de gás nitrogênio.
- Em um porta-luvas anaeróbica, prepare uma solução de estoque cupc (10 mg/mL) em um frasco de vidro lavado dissolvendo CuPc em pó em clorofórmio.
- Filtre a solução CuPc através de uma membrana de politetrafluoroetileno de 0,2 μm (PTFE).
- Armazene a solução filtrada em um frasco de vidro lavado cheio de nitrogênio e sele o frasco com parafilme.
- Pegue a solução de clorofórmio de 1,2 mg/mL adquirida e deixe aquecer até a temperatura ambiente.
- Mexa a solução DPhPC usando uma batedeira de vórtice a 2300 rpm por 10 s.
- Enxágüe uma micro-seringa de vidro com clorofórmio por 5 vezes.
- Transfira 200 μL da solução de clorofóide DPhPC em um frasco de vidro pré-lavado usando a seringa lavada. Evaporar o solvente no frasco com um fluxo suave de nitrogênio.
- Enxágüe uma micro-seringa de vidro 5 vezes com clorofórmio.
- Adicione 202,6 μL de clorofórmio ao frasco de vidro com DPhPC usando a seringa limpa.
- Adicione 47,4 μL de solução de CuPc filtrada de 10 mg/mL na solução DPhPC. A relação molar de DPhPC para CuPc deve ser de 10:1.
- Enxágüe a micro-seringa de vidro 5 vezes com clorofórmio.
- Adicione 250 μL de hexano à solução usando a seringa. A concentração final da solução deve ser de 10 mg/mL.
- Misture a solução preparada usando um misturador de vórtice a 2300 rpm por 10 s.
- Filtre a solução CuPc através de uma membrana de politetrafluoroetileno de 0,2 μm (PTFE).
- Sele o frasco de vidro com parafilm. Coloque-o em um saco selado recheado com nitrogênio e coloque o saco selado em um congelador a -20 °C.
NOTA: Após a etapa 1.13, o DPhPC e o CuPc foram dissolvidos em solvente misto, composto por clorofórmio e hexano (razão de volume de 1:1). Além disso, a razão molar de DPhPC para CuPc não se limita a 10:1. Com uma concentração constante de lipídios (10 mg/mL), diferentes razões molares podem ser usadas. De acordo com resultados experimentais anteriores, uma faixa de 10:1 a 3:1 é preferível para formar uma membrana lipídica híbrida de alta qualidade.
2. Formação de uma membrana híbrida na interface água/ar
- Corte substratos Si (3 cm x 3 cm) de um wafer Si.
- Limpe os substratos si de 3 cm x 3 cm em um banho ultrassônico por 10 minutos em água purificada, seguido de etanol e depois clorofórmio. Trate o substrato Si com um plasma O2 por 5 minutos para remover materiais orgânicos adsorvidos da superfície e melhorar a hidrofilicidade.
- Lave um béquer de Teflon com diâmetro interno de 7,5 cm com água purificada fluindo por 3 min.
- Coloque o substrato Si limpo no béquer PTFE lavado. O substrato é inclinado em um ângulo de 30° para a horizontal.
- Despeje uma quantidade suficiente de água purificada no béquer Teflon até que todo o substrato Si esteja submerso.
- Pegue a solução híbrida preparada do congelador e deixe aquecer até a temperatura ambiente.
- Mexa a solução híbrida usando um misturador de vórtice a 2300 rpm por 15 s.
- Enxágüe uma micro-seringa de vidro (50 μL) 5 vezes com clorofórmio.
- Solte 3-5 μL da solução híbrida na superfície da água usando a seringa para formar uma membrana lipídica híbrida flutuante.
NOTA: Quando a solução é descartada, é importante segurar a gota perto (menos de 1 cm) da superfície da água. Deve-se notar também que uma membrana híbrida de camada única não é visível a olho nu, mas a membrana híbrida de várias camadas aparece como uma película fina e de cor azul. Para transferir a membrana híbrida de várias camadas para o substrato Si, é importante deixar a solução mista o mais próxima possível do substrato Si.
3. Transferir a membrana para um substrato Si
- Após a evaporação do solvente orgânico (levará menos de 2 segundos), baixe o nível de água a uma taxa de 3 mm/min bombeando a água através de um tubo de borracha que é conduzido por uma bomba peristáltica, para transferir a membrana híbrida flutuante para o substrato Si.
- Após o processo de transferência ser concluído (cerca de 5 minutos), coloque o substrato Si em um limpador de sala de limpeza e permita que toda a água residual evapore.
NOTA: Baixar o nível da água a uma taxa tão baixa serve para minimizar a turbulência da água e proteger a membrana.
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Resultados
A membrana como formada tem uma cor azul claro uniforme devido à presença de moléculas de CuPc. A área da membrana colorida é normalmente vários centímetros quadrados. Na Figura 1A e Figura 1B,mostramos uma imagem microscópica e uma imagem de microscópio de força atômica (AFM) (incluindo um perfil de altura) da membrana lipídica híbrida em um substrato Si. Na imagem AFM, a membrana no canto superior esquerdo é grossa, com espessura de 79,4 nm e que no canto infe...
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Discussão
Na solução precursora da membrana híbrida, um solvente orgânico misto (clorofórmio e hexano) em vez de clorofórmio puro é usado para dissolver lipídios e CuPc. Se o clorofórmio puro for usado, a densidade da solução precursora seria maior que a água. Portanto, é altamente provável que a solução afundaria no fundo da água em vez de se espalhar na superfície da água. Adicionar hexano, um solvente de baixa densidade, à solução precursora, garante que a solução flutuará sobre a superfície da água e formará uma membrana híbri...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo programa CREST da Agência de Ciência e Tecnologia do Japão (JPMJCR14F3) e pela Grant in-Aids da Japan Society for the Promotion of Science (19H00846 e 18K14120). Este trabalho foi realizado parcialmente no Laboratório de Nanoeletrônica e Spintronics, Instituto de Pesquisa de Comunicação Elétrica da Universidade de Tohoku.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Clorofórmio | Wako Produtos Químicos | 033-08631 | |
| CuPc | Sigma-Aldrich | 423165 | |
| DPhPc | Avanti Polar Lipids | 850356C | |
| Frascos de vidro com tampa de rosca | Nichiden-Rike Glass Co., Ltd | 6-29801 | |
| Hexane | Wako Produtos Químicos | 084-03421 | |
| Filtros de membrana | Merck Millipore Ltd. | ||
| Micro-seringa | Hamilton | 80530 | |
| Bomba peristáltica | Tokyo Rikakikai Co., Ltd. | ||
| misturador de vórtice | Scientific Industries, Inc. | SI-0286 |
Referências
- Israelachvili, J. N., Mitchell, D. J., Ninham, B. W. Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 470 (2), 185-201 (1977).
- Venable, R. M., Zhang, Y., Hardy, B. J., Pastor, R. W. Molecular dynamics simulations of a lipid bilayer and of hexadecane: an investigation of membrane fluidity. Science. 262 (5131), 223-226 (1993).
- Ide, T., Ichikawa, T. A novel method for artificial lipid-bilayer formation. Biosensors and Bioelectronics. 21 (4), 672-677 (2005).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
- Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
- Demarche, S., Sugihara, K., Zambelli, T., Tiefenauer, L., Voros, J. Techniques for recording reconstituted ion channels. Analyst. 136 (6), 1077-1089 (2011).
- Sakaguchi, N., Kimura, Y., Hirano-Iwata, A., Ogino, T. Fabrication of Au-nanoparticle-embedded lipid bilayer membranes supported on solid substrates. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (17), 4474-4481 (2017).
- Schulz, M., Olubummo, A., Binder, W. H. Beyond the lipid bilayer: interaction of polymers and nanoparticles with membranes. Soft Matter. 8 (18), 4849-4864 (2012).
- Wang, J., Wei, Y., Shi, X., Gao, H. Cellular entry of graphene nanosheets: the role of thickness, oxidation and surface adsorption. RSC Advances. 3 (36), 15776-15782 (2013).
- Vögele, M., Köfinger, J., Hummer, G. Molecular dynamics simulations of carbon nanotube porins in lipid bilayers. Faraday Discussions. 209, 341-358 (2018).
- Kanomata, K., Deguchi, T., Ma, T., Haseyama, T., Miura, M., Yamaura, D., Tadaki, D., Niwano, M., Hirano-Iwata, A., Hirose, F. Photomodulation of electrical conductivity of a PCBM-doped free-standing lipid bilayer in buffer solution. Journal of Electroanalytical Chemistry. 832, 55-58 (2019).
- Barnoud, J., Rossi, G., Monticelli, L. Lipid Membranes as Solvents for Carbon Nanoparticles. Physical Review Letters. 112, 068102(2014).
- Dichello, G. A., et al. Preparation of liposomes containing small gold nanoparticles using electrostatic interactions. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 105, 55-63 (2017).
- Sullivan, P., Heutz, S., Schultes, S. M., Jones, T. S. Influence of codeposition on the performance of CuPc−C60 heterojunction photovoltaic devices. Applied Physics Letters. 84 (7), 1210-1212 (2004).
- Miyata, T., Kawaguchi, S., Ishii, M., Minami, T. High sensitivity chlorine gas sensors using Cu−phthalocyanine thin films. Thin Solid Films. 425 (1-2), 255-259 (2003).
- Barrena, E., de Oteyza, D. G., Dosch, H., Wakayama, Y. 2D supramolecular self-assembly of binary organic monolayers. ChemPhysChem. 8 (13), 1915-1918 (2007).
- Xiao, K., et al. Surface-induced orientation control of CuPc molecules for the epitaxial growth of highly ordered organic crystals on graphene. Journal of the American Chemical Society. 135 (9), 3680-3687 (2013).
- Feng, X., Ma, T., Yamaura, D., Tadaki, D., Hirano-Iwata, A. Formation and characterization of air-stable lipid bilayer membranes incorporated with phthalocyanine molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6515-6520 (2019).
- Wu, Y., He, K., Ludtke, S. J., Huang, H. W. X-ray diffraction study of lipid bilayer membranes interacting with amphiphilic helical peptides: diphytanoyl phosphatidylcholine with alamethicin at low concentrations. Biophysical Journal. 68 (6), 2361-2369 (1995).
- Zaitseva, S. V., Bettini, S., Valli, L., Kolker, A. M., Borovkov, N. Y. Atypical film-forming behavior of soluble tetra-3-nitro-substituted copper phthalocyanine. ChemPhysChem. 20 (3), 422-428 (2019).
- Ghani, F., Gojzewski, H., Riegler, H. Nucleation and growth of copper phthalocyanine aggregates deposited from solution on planar surfaces. Applied Surface Science. 351, 969-976 (2015).
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Reimpressões e permissões
