O objetivo deste protocolo é analisar a divisão celular em tecido intacto por microscopia celular viva e fixa usando espermatocitos meióticos drosophila. O protocolo demonstra como isolar testículos inteiros e intactos das larvas de Drosophila e pupas primitivas, e como processá-los e montá-los para microscopia.
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Artigo de método
Preparação de Drosophila Larval e Pupal Testes para Análise de Divisão Celular em Tecido Vivo e Intacto
Neste artigo
Resumo
Resumo
A análise experimental das células que se dividem em tecidos e órgãos vivos e intactos é essencial para nossa compreensão de como a divisão celular se integra com o desenvolvimento, homeostase tecidual e processos de doenças. Os espermatocitos drosophila submetidos a meiose são ideais para esta análise porque (1) testículos de Drosophila inteiros contendo espermatocitos são relativamente fáceis de preparar para a microscopia, (2) o tamanho grande dos espermatocitos os torna adequados para imagens de alta resolução, e (3) poderosas ferramentas genéticas drosophila podem ser integradas com análise viva. Aqui, apresentamos um protocolo facilmente acessível para a preparação de testículos inteiros de larvas de Drosophila terceira instar e pupas precoces. Descrevemos como identificar espermatocitos meióticos em testículos inteiros preparados e como imaginá-los vivendo por microscopia de lapso de tempo. Também são fornecidos protocolos de fixação e imunocoloração de testículos inteiros. O uso de testículos larvais tem várias vantagens sobre os protocolos disponíveis que usam testículos adultos para análise de espermatocitos. Mais importante, os testículos larvais são menores e menos cheios de células do que testículos adultos, e isso facilita muito a imagem de alta resolução de espermatocitos. Para demonstrar essas vantagens e as aplicações dos protocolos, apresentamos resultados mostrando a redistribuição do retículo endoplasmático em relação aos microtúbulos do fuso durante a divisão celular em um único espermatocito, imagem por microscopia confocal de lapso de tempo. Os protocolos podem ser combinados com a expressão de qualquer número de proteínas ou marcadores de organela fluorescentemente marcados, bem como mutações genéticas e outras ferramentas genéticas, tornando esta abordagem especialmente poderosa para a análise de mecanismos de divisão celular no contexto fisiológico de tecidos e órgãos inteiros.
Introdução
A divisão celular é frequentemente estudada usando linhas celulares cultivadas na cultura1. Embora tenhamos adquirido uma riqueza de insights inestimáveis e compreensão de mecanismos fundamentais a partir desses estudos2, as células cultivadas na cultura não podem recapitular totalmente a fisiologia da divisão celular como ocorre em tecido vivo intacto. Por exemplo, em tecidos e órgãos intactos, as células devem se dividir no lugar certo e no momento certo para que as células prole estejam adequadamente situadas dentro do tecido, para que possam se submeter a programas de diferenciação ou funcionais adequados, e para que....
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Protocolo
1. Prepare animais, ferramentas e mídia para dissecação
- Cruze moscas machos e fêmeas para obter a descendência do genótipo desejado. Marcadores transgênicos úteis para identificação e estadiamento de espermatocitos meióticos incluem gfp-tubulina para rotular o fuso meiótico e rfp-histona 2A para rotular cromossomos8. Use de cinco a dez fêmeas por cruz e mantenha cruzes em alimentos de mosca padrão em frascos em uma incubadora de 25 °C até que as larvas instar terceiros comecem a rastejar pelos lados do frasco (4-5 dias). Pupas brancas começarão a se formar um dia depois.
- Obtenha dois pares de fórceps retos com pontas finas. ....
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Resultados
Quando este protocolo for executado com sucesso, os testículos permanecerão totalmente intactos para a imagem por microscopia confocal ou outros métodos de microscopia de fluorescência. Como visto na Figura 3A,a organização celular dos testículos é preservada, e a progressão da diferenciação celular de uma extremidade do testículo para a outra, incluindo espermatogonia, espermatocitos e espermatides haplóides é visível. GFP-tubbulin é um marcador útil para identificar espermatocitos divisóri.......
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Discussão
Descrevemos um protocolo para a preparação de testículos de Drosophila larval ou pupal precoce, otimizados para imagens ao vivo de longo prazo da divisão celular de espermatocitos. Este é um poderoso método de análise da divisão celular no contexto fisiológico do tecido intacto. O poder deste método é ainda mais expandido quando combinado com ferramentas genéticas de Drosophila, como mutações genéticas específicas, supressão mediada por RNAi específica do tecido, e marcadores de proteína e organela fluo.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por fundos iniciais do Departamento de Defesa para J.T.S.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sonda de Dissecação de 5" | Fisher | 08-965-A | |
| 5.75" Pasteur de Vidro Pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Albumina de Soro Bovino (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 Fórceps | Ferramentas de Ciência Fina | 11252-20 | Forceptos retos com pontas finas |
| Lâminas de Microscópio Fosco | Fisher | 12-544-2 | Lâminas para montagem de tecido fixo, com superfície de escrita fosca |
| Óleo de halocarbono 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | SAR946077410 | Placa de cultura de tecidos permeável |
| a gás Vidro de cobertura de microscópio | Fisher | 12-541-B | 22 mm x 22 mm, #1.5 lamínula de vidro |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | Alfinetes de insetos usados para fazer ferramenta de bisturi |
| Suporte de pino niquelado | de ciência fina | 26018-17 | |
| Solução de paraformaldeído 32%, | microscopia eletrônica | 15714 | |
| Plana de lâminas de microscópio de borda chanfrada | Fisher | 12-549-5 | Lâminas usadas para dissecações |
| Placas de ponto PYREX | Fisher | 13-748B | Prato |
| de dissecação de vidro de 9 poçosDrosophila médio | Fisher | 21720-024 | |
| Filtro de Seringa, 0.22 µ m | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Meio de montagem de microscopia |
Referências
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).
- Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (....
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Reimpressões e permissões
