Captura de DNA Ambiental (eDNA) de Amostras de Água por Floculação

Resumo

O DNA ambiental (eDNA) é normalmente capturado de amostras de água usando precipitação de álcool, filtração ou floculação. Apresentado aqui é um protocolo alternativo que usa cloreto de lantânio para permitir a coleta de ácidos nucléicos dissolvidos e ligados a partículas de amostras de água contendo células eucarióticas, células procarióticas e vírus.

Resumo

A análise de DNA ambiental (eDNA) tornou-se uma abordagem amplamente utilizada para a solução de problemas no manejo de espécies. A detecção de espécies crípticas, incluindo espécies invasoras e (ou) em risco, é o objetivo, normalmente realizado testando água e sedimentos para a presença de assinaturas características de DNA. São necessários procedimentos confiáveis e eficientes para a captura de eDNA, especialmente aqueles que podem ser realizados facilmente em campo por pessoal com treinamento limitado e cientistas cidadãos. A captura de eDNA usando filtração por membrana é amplamente utilizada atualmente. Essa abordagem tem problemas inerentes que incluem a escolha do material filtrante e da porosidade, a incrustação do filtro e o tempo necessário no local para que o processo seja executado. A floculação oferece uma alternativa que pode ser facilmente implementada e aplicada a regimes de amostragem que se esforçam para cobrir amplos territórios em tempo limitado.

Introdução

Antes de meados dos anos 2000, o termo "DNA ambiental" era geralmente usado para se referir ao DNA obtido de micróbios da água e do solo, embora algum uso para a detecção de DNA humano e animal para fins de rastreamento de fontes fecais ou detecção de espécies não nativas tenha começado ^1,2,3. Atualmente, o DNA ambiental é geralmente usado para descrever o DNA de células descartadas de organismos eucarióticos, e a análise desse DNA tornou-se uma ferramenta de gerenciamento amplamente utilizada. A detecção de espécies crípticas, incluindo aquelas que são invasoras ou espécies em risco, é o objetivo, normalmente realizado testando água ou sedimentos para a presença das assinaturas de DNA características das espécies-alvo. Os estudos podem se concentrar em uma única espécie de interesse usando um ensaio de PCR específico (amostragem ativa), ou muitas espécies podem ser detectadas simultaneamente usando metabarcoding e sequenciamento massivamente paralelo.

Muitas melhorias na coleta de amostras, processamento de amostras e análise de dados associadas à pesquisa de eDNA foram feitas durante as últimas duas décadas. Os primeiros estudos empregaram precipitação de álcool para capturar DNA de amostras de água³. Embora testado e comprovado, a necessidade de analisar grandes volumes de água para aumentar a sensibilidade do ensaio torna esse método pouco atraente devido à necessidade típica de dois volumes de etanol para cada volume de amostra de água.

Estudos posteriores geralmente usaram filtração por membrana, racionalizando que o eDNA está presente em um continuum de estados de ligado celular a livremente dissolvido, mas que o DNA dissolvido está sujeito a rápida degradação e, portanto, que o DNA ligado a células representa a fração mais significativa. A otimização do material do filtro e do tamanho dos poros é amplamente discutida e debatida, assim como o(s) método(s) ideal(is) para extração de eDNA capturado do filtro ^4,5,6.

Uma terceira abordagem para a captura de eDNA é a floculação, um processo que tem sido usado há séculos para clarificar líquidos, incluindo água, cerveja e vinho. Vários estudos têm utilizado a floculação para capturar vírus de fontes de água natural ou potável 7,8,9,10,11. Esses estudos normalmente usaram leite desnatado pré-floculado ou cloreto de ferro como agentes de captura. Os métodos de cloreto de ferro geralmente resultam em problemas moleculares de análise a jusante devido à inibição da reação de PCR^12,13. Os métodos que utilizam leite desnatado pré-floculado requerem o preparo prévio do floculante, controle de pH e, até o momento, têm sido aplicados apenas na captura do vírus ^7,8,9.

Recentemente, a captura por floculação de bactérias e vírus com base no uso de cloreto de lantânio (III) tem sido estudada 12,13,14,15. Os autores demonstraram que patógenos viáveis podem ser coletados por este método, pois a ligação do cloreto de lantânio foi eficaz em baixa concentração (0,2 mM). Além disso, a floculação do lantânio é reversível por quelação em condições amenas, em contraste com a do cloreto de ferro.

Assim, a floculação usando cloreto de lantânio para capturar partículas biológicas é atraente, uma vez que apenas uma pequena quantidade de agente floculante concentrado adicionado é necessária, nenhum controle rigoroso de pH é necessário e os volumes das amostras são escaláveis de mililitros a galões. Quando aplicado à captura de eDNA, o DNA celular, subcelular (mitocôndrias e cloroplastos) e dissolvido são prontamente recuperados. Bactérias e vírus são coletados simultaneamente, permitindo testes de patógenos e (ou) estudos ecológicos adicionais a partir de uma única amostra de água. É apresentado um protocolo de floculação usando cloreto de lantânio que permite a coleta de ácidos nucléicos dissolvidos e ligados a partículas de amostras de água.

Protocolo

1. Descontaminação do equipamento e preparação do reagente de floculação

1. Lave bem todas as garrafas, tubos e outros equipamentos usados anteriormente com detergente para lavar louça e água quente.
2. Pulverize todas as garrafas, tubos e outros equipamentos usados anteriormente com solução de ácido cítrico a 6% para remover depósitos minerais, deixe descansar por 20 minutos e enxágue com água da torneira.
3. Adicione uma solução de alvejante doméstico diluído a 10 vezes (concentração final de hipoclorito de sódio de 0,5-0,6%) a todas as garrafas (aproximadamente 10% do volume do recipiente), agite, deixe repousar por pelo menos 1 h, escorra e enxágue com água da torneira até que não haja vestígios de alvejante. Em seguida, enxágue uma vez com água deionizada.
4. Seque todas as garrafas.
5. Coloque todos os frascos e tampas de coleta em um armário de segurança biológica e irradie usando lâmpadas germicidas ultravioleta por 2 h, girando cada frasco e tampa um quarto de volta a cada meia hora.
6. Coloque as tampas nas garrafas e aperte frouxamente. Pese cada garrafa e registre seu peso vazio na garrafa.
7. Prepare uma solução 100 mM de cloreto de lantânio (III) heptahidratado dissolvendo 3,71 g em 100 mL de água deionizada. Para minimizar a exposição do produto químico ao ar, como o cloreto de lantânio é higroscópico, feche o frasco com fita adesiva entre os usos.
   CUIDADO: O cloreto de lantânio carrega a(s) palavra(s) de advertência de advertência de sinalização. H315 causa irritação na pele. H319 provoca irritação ocular grave. H335 pode causar irritação respiratória. Use equipamento de proteção individual. Consulte o SDS do material para obter mais informações.
8. Preparar uma solução 1 M de bicarbonato de sódio dissolvendo 84,01 g de bicarbonato de sódio em 1 L de água desionizada. Filtre, esterilize e armazene em temperatura ambiente.

2. Coleta de amostras e floculação

1. Colete amostras de cada local mais um campo em branco (uma amostra contendo água potável envasada no local para controlar a contaminação) enchendo garrafas de tamanho apropriado. Ajustar o número de amostras colhidas de acordo com a concepção experimental e a finalidade prevista. Não encha demais as garrafas além do ombro da garrafa para permitir a expansão se as amostras forem congeladas.
2. Registre metadados pertinentes, incluindo data, hora e localização GPS. Rotule os recipientes de amostra.
3. Adicionar solução de bicarbonato de sódio 1 M a cada amostra e campo em branco. Adicione 10 mL por amostra de 500 mL.
4. Tampe as garrafas e misture.
5. Adicione 100 mM de cloreto de lantânio a cada amostra e campo em branco. Adicione 1 mL por amostra de 500 mL.
6. Tampe e misture bem. Use fita isolante para prender a tampa.
7. Armazenar em gelo até retornar ao laboratório de campo, então as amostras podem ser armazenadas durante a noite refrigeradas e em pé para permitir que os flocos se depositem no fundo do recipiente ou congeladas a -20 ° C para envio a um segundo laboratório para processamento posterior. As amostras devem ser congeladas em pé para permitir a expansão do líquido e evitar a ruptura do recipiente.

3. Processamento de flocos

1. Descongele as amostras congeladas à temperatura ambiente em um refrigerador ou mova as amostras que não foram congeladas para uma área de bancada adequada que inclua uma bomba periestática e uma configuração de tubulação para aspiração de sobrenadantes de amostra. Certifique-se de que a tubulação que passa pela bomba peristáltica descarregue em um balde grande no chão. A entrada deve ser equipada com um canudo de plástico limpo para controlar a ingestão.
2. Use a bomba peristáltica para remover o sobrenadante usando o canudo para direcionar a sucção primeiro logo abaixo da superfície do líquido e movendo a entrada do canudo para baixo com o nível do líquido. Remova o resto do sobrenadante movendo cuidadosamente a entrada para descansar no pontil (covinha elevada no fundo da garrafa). Isso permite a remoção máxima de líquido enquanto os flocos se acumulam ao redor da periferia (veja a Figura 1).

Figura 1: Coleção de flocos assentados na unidade de gravidade. Os flocos contendo material celular e eDNA são depositados no fundo do frasco de amostra e estão prontos para serem recuperados após a remoção do sobrenadante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Colocar uma palheta limpa e repetir a remoção do sobrenadante para cada amostra.
4. Use uma pipeta limpa de 20 mL e um controlador de pipeta para transferir a suspensão de flocos completamente para um tubo de centrífuga de 50 mL. Use enxágues com água deionizada de baixo volume (aproximadamente 5 mL) para garantir que quaisquer flocos residuais sejam recuperados do sample frasco.
5. Ajuste todos os tubos de 50 mL para volumes iguais com água deionizada e colete os flocos por centrifugação a 2.500 x g por 20 min.
6. Despeje o sobrenadante e deixe os tubos invertidos em uma toalha de papel limpa para escorrer.
7. Ressuspenda os flocos em 1 mL de EDTA 0,5 M, pH 8,0 por mistura de vórtice e, em seguida, adicione 4 mL de solução 1x TE, pH 8,0 e misture novamente. Transfira os flocos ressuspensos para um tubo de centrífuga cônico de 15 mL, adicione 50 μL de poliacrilamida linear a 10% e vórtice. Adicione 5 mL de isopropanol 100%, misture e deixe repousar no gelo por 20 min.
8. Centrifugue a 6.000 x g por 20 min para coletar DNA e partículas celulares. Despeje os sobrenadantes e deixe repousar invertidos em toalhas de papel limpas para escorrer. Deixe secar um pouco, mas não seque demais.
9. Inicie o processo de extração de DNA de flocos usando um kit comercial que emprega batimento de esferas e ligação de coluna de rotação com capacidade de 25 μg.
   1. Primeiro, ressuspenda os flocos em 800 μL do tampão de lise fornecido com o kit e transfira completamente a suspensão para um tubo de batimento de cordão. O talão venceu a suspensão de flocos em curtos períodos com resfriamento entre eles. Os homogeneizados podem ser armazenados congelados neste momento ou continuar com o protocolo do kit.
   2. Eluir o DNA da coluna de rotação primeiro com 100 μL e, em seguida, reciclar o eluído através do tubo de rotação.
   3. Finalmente, eluir o DNA residual da coluna com uma alíquota adicional de 100 μL de tampão de eluição para perfazer um volume total de 200 μL. Isso maximiza a recuperação.
10. Coletar, preparar e analisar o eDNA para demonstrar o desempenho deste protocolo e seu desempenho em relação ao método de filtragem amplamente utilizado.
    1. Prepare reações que contenham 1x master mix de qPCR, 25 μg/mL de trombina bovina ^14,16, 0,4 μM de primers direto e reverso e 2 μL de molde (1% de DNA de amostra recuperado). Construa curvas padrão usando diluições seriais de amplicons de PCR purificados e quantificados gerados usando DNA de voucher. Alternativamente, os alvos podem ser sintetizados comercialmente.
    2. Utilizar um método de quantificação comparativa se não existir uma norma disponível. Para este exemplo, realizar termociclagem usando condições de reação de 95 °C por 10 min, seguidas de 40 ciclos de 95 °C por 10 s, 57 °C por 30 s e 72 °C por 30 s, embora essas condições devam ser ajustadas para outros ensaios. Analise os dados usando o software do fabricante.

Resultados

Oito amostras de água de 500 mL (450 mL cada) retiradas de um aquário que abriga duas tartarugas-pintadas (Chrysemys picta picta) foram usadas para preparar o eDNA usando o protocolo descrito. Outras oito amostras de água de 500 mL foram filtradas em filtros de fibra de vidro de 47 mm de porosidade de 1,5 μm sem aglutinante e o eDNA foi extraído usando o mesmo método de extração usado para o protocolo de floculação. O DNA preparado usando ambos os métodos foi analisado usando PCR quantitativo que tem como alvo a...

Discussão

Embora essa técnica seja simples, algumas etapas são essenciais para o sucesso. A coleta e transferência dos flocos devem ser feitas completamente para não perder DNA. O material residual deve ser recolhido por meio de enxágues estratégicos. O protocolo descrito utiliza um kit comercial de extração de DNA para o processamento final de material floculado. Outros métodos de extração podem ter um desempenho semelhante ou superior, mas as modificações desta parte do protocolo não foram exaus...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,5M EDTA, pH 8,0	Disponível em várias fontes
1 x TE Buffer, pH 8,0	Disponível em várias fontes
Tubos de centrífuga cônicos de 15 ml	uso
16 oz.	Reutilizáveis com limpeza e descontaminação
Tampa de polipropileno 38/400 com sensível à pressão Forro	Deixe as tampas soltas até o uso. Tampe firmemente para selar o revestimento sensível à pressão.
Tubos de Centrífuga Cônicos de 50 mL Uso
Solução de Ácido Cítrico a 6%	Use para remover depósitos minerais de frascos de amostra reutilizáveis.
Kit de Micróbios Fecais/Solo	Use resina ou coluna
lantânio (III) cloreto heptahidratado	100 mM Solução de estoque
Bomba DC peristáltica	Qualquer bomba peristáltica serve, ou pode ser sifonada
	10% poliacrilamida linear
	de Sódio1 M, filtro esterilizado e armazenado em temperatura

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