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Artigo de método

Eliminação de neurônios serotoninérgicos por injeção estereotáxica de 5,7-dihidroxitriptamina nos núcleos dorsais da rafe de camundongos

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DOI:

10.3791/60968

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1 de maio de 2020

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1Institute for Regenerative Medicine, Shanghai East Hospital, Frontier Science Center for Stem Cell Research, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2Department of Ophthalmology, Shanghai Tenth People's Hospital Affiliated to Tongji University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um modelo de camundongo lesionado com núcleo dorsal da rafe (DRN) (taxa de sobrevivência de >90% em camundongos experimentais) com perda estável de neurônios serotoninérgicos da rafe dorsal por injeção estereotáxica de 5,7-dihidroxitriptamina no DRN usando uma abordagem angular para prevenir lesões no seio sagital superior.

Resumo

A injeção estereotáxica tem sido amplamente utilizada para entrega direta de compostos ou vírus a áreas cerebrais específicas em roedores. O direcionamento direto de neurônios serotoninérgicos no núcleo dorsal da rafe (DRN) pode causar sangramento excessivo e morte do animal, devido à sua localização abaixo do seio sagital superior (SSS). Este protocolo descreve a geração de um modelo de camundongo com lesão de neurônio serotoninérgico DRN (taxa de sobrevivência de >90%) com perda estável de >70% de células positivas para 5-HT no DRN. A lesão é induzida por injeção estereotáxica de uma neurotoxina serotoninérgica seletiva 5,7-dihidroxitriptamina (5,7-DHT) no NRD usando uma abordagem angular (30° na direção anterior/posterior) para evitar lesão no SSS. Camundongos com lesão de neurônios serotoninérgicos DRN apresentam alterações de comportamento associadas à ansiedade, o que ajuda a confirmar o sucesso da cirurgia de lesão DRN. Este método é usado aqui para lesões DRN, mas também pode ser usado para outras injeções estereotáxicas que requerem injeções angulares para evitar estruturas da linha média. Este modelo de camundongo com lesão de neurônio serotoninérgico DRN fornece uma ferramenta valiosa para entender o papel dos neurônios serotoninérgicos na patogênese de transtornos psiquiátricos, como transtorno de ansiedade generalizada e transtorno depressivo maior.

Introdução

A serotonina, ou 5-hidroxitriptamina (5-HT), é um importante neurotransmissor produzido principalmente nos intestinos e no cérebro e afeta uma variedade de funções psicológicas. No sistema nervoso central (SNC), o sistema serotoninérgico desempenha um papel central na regulação do humor e do comportamento social, sono e vigília, apetite, memória e desejo sexual. No SNC, a serotonina é sintetizada por neurônios serotoninérgicos, que podem ser separados nos dois grupos a seguir: o grupo rostral, que possui projeções ascendentes que inervam praticamente todo o cérebro; e o grupo caudal, que se projeta principalmente para a medula espinhal1. O grupo rostral, que contém cerca de 85% dos neurônios serotoninérgicos no cérebro, é composto pelo núcleo linear caudal, núcleo mediano da rafe e DRN, no qual está localizada a maior população de neurônios serotoninérgicos no cérebro.

Acredita-se que a desregulação do sistema serotoninérgico esteja ligada à patogênese do transtorno depressivo maior (TDM) e dos transtornos de ansiedade generalizada (TAG)2. Isso se deve ao fato de que os inibidores seletivos da recaptação da serotonina (ISRSs) são um tratamento farmacológico eficaz para esses transtornos psiquiátricos 3,4. Além disso, evidências acumulativas sugerem que a mania5 e o comportamento suicida6 podem estar associados a níveis mais baixos de funcionamento da serotonina no NRD. Também foi relatado que Pet1-Cre; Camundongos Lmx1bflox / flox e camundongos hTM-DTAiPet1 (modelos genéticos de camundongos sem a maioria dos neurônios serotoninérgicos centrais do estágio embrionário tardio7 e da idade adulta8, respectivamente) exibem memória de medo contextual aprimorada. No entanto, apesar de extensas pesquisas, o envolvimento exato dos neurônios serotoninérgicos DRN nesses transtornos psiquiátricos ainda precisa ser elucidado.

A fim de explorar os mecanismos pelos quais os neurônios serotoninérgicos DRN regulam a patogênese dos distúrbios psiquiátricos associados à serotonina, modelos animais foram gerados. Ferramentas optogenéticas têm sido aplicadas para inibir neurônios serotoninérgicos em DRN de ratos, e esses animais exibem comportamentos semelhantes à ansiedadeaumentados 9. No entanto, a optogenética tem limitações. Por exemplo, um dispositivo de entrega de luz deve ser implantado na região alvo no fundo do cérebro, e o tecido circundante pode ser ferido durante a cirurgia de implantação ou pelo calor emitido pelo dispositivo de luz. Mesmo que a alteração da temperatura não cause danos detectáveis ao tecido cerebral, ela ainda pode induzir efeitos fisiológicos e comportamentais notáveis10.

A manipulação farmacológica pode ser uma abordagem mais fácil para criar modelos animais com lesão de neurônios serotoninérgicos DRN. Alguns grupos geraram ratos com lesão de neurônios serotoninérgicos DRN por microinjeção estereotáxica de neurotoxina serotonina 5,7-DHT no DRN. No entanto, esses modelos de ratos exibem diferentes alterações comportamentais, como comportamento ansiolítico11, aumento do comportamento semelhante à ansiedade12 e memória de objeto prejudicada13. Apesar de muitos estudos em ratos, poucos estudos foram realizados sobre as influências do 5,7-DHT em camundongos. Um grupo relatou mortalidade excessiva (>50%) e depleção limitada de serotonina em camundongos experimentais que receberam microinjeções estereotáxicas de 5,7-DHT no DRN14. Outro grupo relatou que o estresse leve crônico imprevisível (UCMS) pode induzir alteração significativa da latência de ataque em camundongos com lesão de DRN induzido por 5,7-DHT. No entanto, nenhum resultado histológico foi fornecido para confirmar a perda exata de neurônios serotoninérgicos no DRN15. A injeção estereotáxica no NRD usando procedimentos padrão pode levar a sangramento maciço e alta mortalidade em camundongos, dado o fato de que a localização anatômica do NRD está abaixo do SSS16.

Este protocolo descreve o protocolo para gerar um modelo de camundongo com lesão de neurônios serotoninérgicos DRN (taxa de sobrevivência de >90% dos camundongos experimentais) com perda estável de neurônios serotoninérgicos DRN por injeção estereotáxica de 5,7-DHT. A injeção no DRN usa uma abordagem angular para evitar a lesão ao SSS. Esta cirurgia causa consistentemente >70% de perda de neurônio serotoninérgico no NRD de camundongos e produz alterações comportamentais associadas à ansiedade. O protocolo utilizado aqui é para induzir lesões de NRD, mas também pode ser útil para pesquisadores que desejam realizar injeções estereotáxicas em outras estruturas da linha média. Além disso, este modelo de camundongo com lesão de neurônio serotoninérgico DRN fornece uma ferramenta valiosa para entender o papel dos neurônios serotoninérgicos em transtornos psiquiátricos (ou seja, TDM e TAG) e avaliar potenciais agentes neuroprotetores ou estratégias terapêuticas para essas condições.

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Protocolo

Todas as intervenções cirúrgicas e procedimentos de cuidados com animais foram aprovados pelo Comitê Animal da Escola de Ciências da Vida e Tecnologia da Universidade de Tongji, Xangai, China.

1. Alojamento dos animais

  1. Manter camundongos C57BL/6NCrl machos (10 semanas de idade, 25 g, n = 21) em condições padrão (temperatura de 24 °C; 55% de umidade) sob um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h.
  2. Forneça comida e água ad libitum.
    NOTA: Aqui, três dos mouses são usados para confirmar a trilha da agulha.

2. Preparação de reagentes

NOTA: Todas as etapas de preparação do medicamento devem ser realizadas em uma capela de fluxo laminar para evitar contaminação. Todas as soluções preparadas são armazenadas em um freezer a -80 °C. Recomenda-se usar uma alíquota de cada vez, descongelar completamente, misturar bem antes de usar, descartar as sobras no tubo e evitar o congelamento e descongelamento repetidos.

  1. Dissolva 0,25 g de cloridrato de desipramina em 100 mL de solução salina a 0,9% para obter uma solução de 2,5 mg / mL. Esterilize a solução usando um filtro de seringa com membrana PES hidrofílica de tamanho de poro de 0,22 μm. Em seguida, alíquota da solução (1,8 mL/tubo) em tubos de microcentrífuga (EP) de 2 mL. Rotule, date e armazene em um freezer a -80 ° C imediatamente. A dosagem recomendada para uso animal é de 25 mg/kg.
  2. Dissolva 5 mg de 5,7-DHT em 1,67 mL de solução salina a 0,9% contendo ácido ascórbico a 0,1% para obter uma solução de 3 μg / μL. Vortex suavemente para misturar, esterilizar a solução usando um filtro de seringa (tamanho de poro de 0,22 μm) e alíquota da solução (10 μL / tubo) em tubos EP de 0,5 mL. Rotule, date e congele a -80 °C imediatamente. A dosagem recomendada para uso animal é de 2 μL / camundongo.
  3. Dissolva o cetoprofeno (analgésico) seguindo o método descrito anteriormente17. Dissolva 250 mg de cetoprofeno em 15 mL de água e 1 mL de NaOH 1 M, ajuste o pH para 7,3 e complete o volume final para 125 mL, o que resultará em uma concentração final de 2 mg / mL. Esterilizar a solução com um filtro de seringa de 0,22 μm e alíquota da solução (0,4 ml/tubo) em tubos EP de 1,5 ml. Rotule, date e congele a -80 °C até o uso. A dosagem recomendada para uso animal é de 5 mg / kg.

3. Preparação de instrumentos e mouses

  1. Prepare um pacote cirúrgico (contendo bisturi, par de pinças de tecido, tesoura, porta-agulha, suturas 3-0, brincos e aplicador de brinco) previamente esterilizado em autoclaves de alta temperatura. Coloque etanol 75%, iodopovidona, peróxido de hidrogênio a 3%, solução veicular (ácido ascórbico 0,1% em solução salina 0,9%), um cotonete, pomada ocular de ofloxacina e uma gaiola de recuperação de camundongo em cima de uma almofada de aquecimento, usando uma seringa Hamilton com uma agulha de 32 G e seringa de 1 cc.
  2. h antes da injeção de 5,7-DHT, pesar e registrar o peso corporal dos camundongos e, em seguida, submetê-los a injeções intraperitoneais (i.p.) de desipramina (2,5 mg / mL, 10 μL / g de peso).
    NOTA: O objetivo da administração de desipramina 1 h antes da injeção de 5,7-DHT é prevenir a perda de células catacolaminérgicas18.
  3. Anestesiar camundongos usando anestesia inalatória com isoflurano (3% durante a indução, 1,5% durante a manutenção, vazão = 2 L/min). Administre cetoprofeno (2 mg / mL, 2,5 μL / g de peso) por injeção subcutânea (s.c.). Confirme a profundidade adequada da anestesia pela ausência de resposta de pinçamento da cauda.

4. Injeção estereotáxica

  1. Coloque o mouse anestesiado na plataforma estereotáxica e, em seguida, fixe sua cabeça com as barras auriculares e a barra incisiva do aparelho estereotáxico.
  2. Raspe a cabeça do rato e limpe o couro cabeludo exposto com uma esfoliação de etanol a 75% seguida de uma esfoliação de iodopovidona.
  3. Aplique pomada de lidocaína no couro cabeludo usando um cotonete para fornecer analgesia local. Coloque pomada ocular de ofloxacina nos olhos para proteger a córnea.
  4. Faça uma incisão no couro cabeludo ao longo da linha média usando um bisturi de 1 mm posterior aos olhos até a linha interaural.
  5. Use um cotonete embebido em peróxido de hidrogênio a 3% para remover o periósteo, depois seque o crânio e exponha as suturas cranianas. Marque a localização do bregma e lambda.
  6. Ajuste a posição da cabeça usando a barra incisiva até que o bregma e o lambda fiquem no mesmo plano horizontal. Ajuste a ponta da agulha para tocar o bregma ou lambda, registre as coordenadas medial/lateral (ML) e dorsal/ventral (DV) e ajuste a barra incisiva para que as coordenadas DV e ML de bregma e lambda sejam iguais, respectivamente.
  7. Destrave o botão de posicionamento perpendicular e o parafuso de trava e, em seguida, ajuste o braço do manipulador (eixo z) para 30° na direção anterior/posterior (AP), conforme mostrado na Figura 1A,B. Bloqueie o botão.
  8. Fixe a seringa Hamilton cheia de 2 μL de 5,7-DHT (3 μg/μL) no suporte (para o grupo simulado, os camundongos são injetados com solução salina a 0,9% contendo ácido ascórbico a 0,1%). Ajuste a ponta da agulha para tocar o ponto de referência bregma e, em seguida, zere os valores ML, AP e DV usando o módulo de exibição digital.
    NOTA: A solução de 5,7-DHT é um líquido de cor marrom, tornando mais fácil determinar se a seringa Hamilton está devidamente cheia. Se não houver acesso a um módulo de exibição digital, registre o número exibido em três eixos quando a ponta da agulha tocar o bregma, e as coordenadas finais representam "o número registrado mais a coordenada fornecida neste protocolo". Por exemplo, se o número registrado no braço manipulador do eixo y (direção A/P) for "a", a coordenada final na direção A/P deve ser "a - 6,27".
  9. Mova o braço manipulador para ajustar a ponta da agulha para a posição de injeção (APa = -6,27, ML = 0; a fórmula para calcular as coordenadas finais está listada na Figura 1B). Marque a posição alvo usando um marcador.
  10. Faça o furo da rebarba usando uma broca de alta velocidade com micromotor portátil e, em seguida, mova o braço do manipulador para abaixar a ponta da agulha até o alvo (DVa = -4.04). Injete 2 μL da solução no cérebro lentamente (0,5 μL/3 min), mantendo a agulha in situ por mais 5 min para evitar vazamento da solução. Remova a agulha suavemente após a injeção.
  11. Aplique suturas interrompidas sobre a incisão usando suturas 3-0. Envolva a incisão suturada com um cotonete embebido em iodopovidona para evitar infecção.
  12. Limpe a orelha direita com um cotonete de iodopovidona e, em seguida, aplique a etiqueta auricular esterilizada na base da orelha para identificação.
  13. Remova os camundongos experimentais do aparelho estereotáxico e coloque-os em uma gaiola de recuperação de camundongos em cima de uma almofada de aquecimento até que a recuperação total da anestesia seja observada.

5. Cuidados pós-operatórios de camundongos

  1. Submeter camundongos a injeções s.c. de cetoprofeno 1x/dia até 2 dias após a cirurgia.
  2. Inspecione os ratos diariamente até 7 dias após a cirurgia.

6. Teste do labirinto em T elevado

NOTA: Realize o teste conforme descrito anteriormente19,20.

  1. Certifique-se de que o teste de labirinto em T elevado (ETM) seja composto por dois braços abertos (30 cm x 5 cm x 0.5 cm) perpendiculares a dois braços fechados (30 cm x 5 cm x 16 cm x 0.5 cm) com uma plataforma central (5.0 cm x 5.0 cm x 0.5 cm). Um dos braços fechados é bloqueado por uma folha de plástico opaca para formar uma forma de T (Figura 2A).
  2. Três dias antes do teste de ETM, habituar os animais com manuseio diário por 5 min.
  3. No dia 30 após a cirurgia, realize o teste ETM.
  4. No dia do teste comportamental, exponha os ratos a um dos braços abertos por 10 minutos.
  5. Para testes de prevenção inibitória, coloque cada camundongo na extremidade distal do braço fechado e registre o tempo necessário para deixar esse braço com quatro patas em três tentativas. O primeiro ensaio é a evitação basal, o segundo ensaio é a evitação 1 e o terceiro ensaio é a evitação 2.
  6. Mantenha os ratos em suas gaiolas por 30 s entre as trilhas e estabeleça um tempo limite (aqui, 300 s é usado para cada tentativa).

7. Perfusão, fixação, coloração imuno-histoquímica e quantificação

  1. Ao final do estudo (35 dias após a cirurgia, após o teste comportamental), realize a perfusão e fixação de corpo inteiro assim que o camundongo estiver sob anestesia geral.
    1. Anestesie o mouse conforme descrito na etapa 3.3. Coloque o camundongo profundamente anestesiado em decúbito dorsal.
    2. Molhe o pelo com álcool 75% em toda a área ventral.
    3. Faça um corte abaixo do esterno seguido de uma incisão em forma de V na caixa torácica. Segure a caixa torácica usando o clamp para expor o coração.
    4. Insira a agulha de infusão venosa no ventrículo esquerdo e, em seguida, corte o apêndice atrial imediatamente com uma tesoura para permitir que o sangue flua.
    5. Ligue a bomba peristáltica para perfundir solução salina em todo o corpo através do sistema circulatório. Mude de solução salina para paraformaldeído a 4% (PFA) quando o fluido que sai do átrio direito se tornar claro e quando o fígado mudar de vermelho para vermelho pálido. Perfunda mais 5 mL de PFA a 4% quando a cauda do rato se move e o corpo está rígido.
      NOTA: O balanço da cauda do rato é o sinal de perfusão adequada.
  2. Isolamento do cérebro após perfusão intracardíaca com PFA a 4%
    1. Decapite o rato usando uma tesoura grande e corte a pele para expor o crânio.
    2. Faça dois cortes na base do crânio (conectado ao pescoço), faça um corte ao longo da linha que liga os olhos e, em seguida, corte o crânio ao longo da sutura sagital. Segure e descasque o crânio de cada hemisfério para fora para expor o cérebro usando uma pinça.
      NOTA: O corte do crânio ao longo da sutura sagital deve ser realizado com cuidado, caso contrário, o cérebro pode ser danificado e separado em partes.
    3. Remova o cérebro e coloque-o em PFA a 4% a 4 ° C durante a noite para pós-fixação e, em seguida, transfira o cérebro para sacarose a 30% até que ele afunde no fundo.
      NOTA: A desidratação com sacarose a 30% não é necessária se as seções forem cortadas com um vibratome.
  3. Absorva qualquer excesso de líquido ao redor do tecido usando uma toalha de papel antes de incorporar. Incorpore o tecido cerebral na OCT com a face rostral no mandril.
    NOTA: A orientação da amostra é importante. A face rostral do cérebro deve ser fixada ao mandril para garantir que a aresta de corte seja a porção caudal.
  4. Corte uma seção coronal do DRN (4,0–4,8 mm posterior do bregma) com 30 μm de espessura (intervalos de quatro seções) usando um criostato e colete as seções em PBS. Conservar em solução de criopreservação (SCS) a -20 °C.
    NOTA: A identificação do DRN é muito importante. As estruturas anatômicas consecutivas são mostradas como Figura 3A-H. As estruturas características são as seguintes: recesso lateral do quarto ventrículo (LR4V, traço vermelho na Figura 3A,E), quarto ventrículo (4V, triângulo traço vermelho na Figura 3B,F), segundo lóbulo cerebelar (2Cb, traço vermelho estrutura em forma de diamante na Figura 3C/G) e aqueduto (Aq, traço vermelho Comece a coletar os tecidos quando as estruturas forem observadas, conforme mostrado na Figura 3D,H, depois corte em seções de 30 μm de espessura (intervalos de quatro seções) para produzir 24 seções coronais totais. A coloração H & E das seções é mostrada na (Figura 3E-H). A quarta seção de cada uma das quatro seções será selecionada para realizar a coloração imunofluorescente. As seções restantes são armazenadas no SCS. Se for difícil reconhecer as estruturas, é útil montar uma peça das seções no slide.
  5. Realizar ensaio imuno-histoquímico conforme descrito anteriormente21,22.
  6. Conte células positivas para 5-HT em diferentes níveis de seção em todo o DRN usando ImageJ.

8. Análise estatística

  1. Use software estatístico para análise de dados. Expresse os resultados como meios ± SEM.
  2. Processe os valores para análise estatística por ANOVA de duas vias ou teste t não pareado e considere as diferenças significativas em **p < 0,01.

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Resultados

Em uma seção coronal, a localização do NRD é logo abaixo do SSS e do aqueduto (Figura 1B,C); assim, direcionar o DRN usando procedimentos padrão pode levar a sangramento maciço e alta mortalidade em camundongos16. Portanto, as injeções estereotáxicas foram realizadas aqui usando uma abordagem angular em vez da abordagem vertical padrão para evitar danos ao SSS (Figura 1A, B). Para confirmar a localização ...

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Discussão

Este protocolo descreve com sucesso a produção de um modelo confiável de camundongo com lesão de neurônio serotoninérgico DRN com alta reprodutibilidade de lesão e baixa taxa de mortalidade. Direcionar o DRN é uma tarefa complexa, pois pode danificar o SSS localizado logo acima do DRN16 e levar a sangramento excessivo e até a morte14. Portanto, as injeções estereotáxicas foram realizadas ajustando o braço de manipulação a 30° na direção AP ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China [Grant numbers 2017YFA0104100]; a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China [números de concessão 31771644, 81801331 e 31930068]; e os Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
peróxidoMilliporeSLGPRB
3%Caoshanhu Co., Ltd, Jiangxi, China
5,7-DihydroxytryptamineSigma-AldrichSML20583ug/ul, 2ul
Máquina compacta da anestesia para pequenos animaisRWD Life Science Co., LtdSérie R500
CryostatLeica Biosystems, Wetzlar, AlemanhaCM1950
Cy 3 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch705-165-0031:2.000
dapiSigma-AldrichD8417
Sigma-AldrichPHR172325mg / kg
Tubo EppendorfAnticorpo509-GRD-Q
Abcamab660471:800
GraphPad PrismGraphpad Software Inc, CA, EUA
Seringa de microlitro Hamilton87943
CetoprofenoSigma-AldrichK1751-1G5mg/kg
Ácido L-ascórbicoBBI Life SciencesA610021-05000,10%
pomada de lidocaínaTsinghua Tongfang Pharmaceutical Co. LtdH20063466
pomada para os olhos de ofloxacinaShenyang Xingqi Pharmaceutical Co.Ltd, ChinaH10940177
bomba peristálticaHuxi Analytical Instrument Factory Co., Ltd, Xangai, ChinaHL-1D
RWD Life Science Co., Ltd68018
freezer de temperatura ultrabaixaHaierDW-86L388
VortexKylin-bellVORTEX-5
de hidrogênio de Cloridrato de desipramina anti-5-HT de cabra Quality Scientific Plastics Aparelho estereotáxico

Referências

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