Descrevemos um protocolo para avaliar a morfologia cardíaca e a função em zebrafish adultos usando ecocardiografia de alta frequência. O método permite a visualização do coração e posterior quantificação de parâmetros funcionais, como freqüência cardíaca (HR), saída cardíaca (CO), mudança de área fracionada (FAC), fração de ejeção (EF), e velocidades de fluxo e fluxo sanguíneo.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Ecocardiografia de ultrassom de alta frequência para avaliar a função cardíaca de zebrafish
Neste artigo
Resumo
Resumo
O zebrafish (Danio rerio) tornou-se um organismo modelo muito popular em pesquisas cardiovasculares, incluindo doenças cardíacas humanas, em grande parte devido à sua transparência embrionária, trabilidade genética e amenidade a estudos rápidos e de alto nível. No entanto, a perda de transparência limita a análise da função cardíaca na fase adulta, o que complica a modelagem das condições cardíacas relacionadas à idade. Para superar tais limitações, a ecocardiografia de ultrassom de alta frequência em zebrafish está emergindo como uma opção viável. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para avaliar a função cardíaca em zebrafish adultos por ecocardiografia não invasiva usando ultrassom de alta frequência. O método permite a visualização e análise da dimensão cardíaca do zebrafish e a quantificação de parâmetros funcionais importantes, incluindo freqüência cardíaca, volume de derrame, saída cardíaca e fração de ejeção. Neste método, os peixes são anestesiados e mantidos debaixo d'água e podem ser recuperados após o procedimento. Embora o ultrassom de alta frequência seja uma tecnologia cara, a mesma plataforma de imagem pode ser usada para diferentes espécies (por exemplo, murina e zebrafish) adaptando diferentes transdutores. A ecocardiografia do zebrafish é um método robusto para fenotipagem cardíaca, útil na validação e caracterização de modelos de doenças, particularmente doenças de início tardio; telas de drogas; e estudos de lesão cardíaca, recuperação e capacidade regenerativa.
Introdução
O zebrafish (Danio rerio) é um modelo de vertebrados bem estabelecido para estudos de processos de desenvolvimento e doenças humanas1. Os zebrafish têm alta similaridade genética aos seres humanos (70%), trabilidade genética, alta fecundidade e transparência óptica durante o desenvolvimento embrionário, o que permite a análise visual direta de órgãos e tecidos, incluindo o coração. Apesar de ter apenas um átrio e um ventrículo, o coração de zebrafish (Figura 1) é fisiologicamente semelhante aos corações de quatro câmaras dos mamíferos. É importante ressaltar que a freqüência cardíaca do zebrafish, a morfologia eletrocardiograma e a forma potencial de ação se assemelham às dos seres humanos mais do que as espécies de murina2. Essas características tornaram o zebrafish um excelente modelo para a pesquisa cardiovascular e forneceram grandes insights sobre o desenvolvimento cardíaco3,4, regeneração5, e condições patológicas1,3,4, incluindo arteriosclerose, cardiomiopatias, arritmias, doenças cardíacas congênitas e cardiotoxicidade da cadeia de luz amilóide1,4,6. A avaliação da função cardíaca tem sido possível durante o estágio embrionário (1 dias após a fertilização) por meio da análise direta de vídeo utilizando microscopia de vídeo de alta velocidade7,8. No entanto, os zebrafish perdem sua transparência além do estágio embrionário, limitando avaliações funcionais de corações maduros normais e condições cardíacas de início tardio. Para superar essa limitação, a ecocardiografia tem sido empregada com sucesso como uma alternativa de imagem não invasiva de alta resolução, em tempo real e não invasiva para avaliar a função cardíaca do zebrafish adulto9,,10,,11,,12,,13,14,15.
Em zebrafish, o coração está localizado ventralmente na cavidade torácica imediatamente posterior às brânquias com o átrio localizado dorsal ao ventrículo. O átrio coleta sangue venoso do venoso sinusal e transfere-o para o ventrículo onde é ainda mais bombeado para o bulbo arterioso(Figura 1). Aqui, descrevemos um protocolo fisiológico, subaquático, para avaliar a função cardíaca em zebrafish adultos por ecocardiografia não invasiva usando uma sonda de ultrassom de matriz linear com uma freqüência central de 50 MHz para imagem de modo B em uma resolução de 30 μm. Uma vez que as ondas de ultrassom podem facilmente viajar através da água, manter a proximidade entre o peixe e a sonda de varredura debaixo d'água fornece superfície de contato suficiente para detecção cardíaca sem necessidade de gel de ultrassom e é no geral menos estressante para o peixe. Embora sistemas alternativos de ecocardiografia de zebrafish tenham sido relatados por vários autores9,12,13, aqui apresentamos a configuração geral e mais comumente utilizada que se aplica ao ultrassom de alta frequência em animais.
O método permite imagens de alta resolução do coração de zebrafish adulto, rastreamento de estruturas cardíacas e quantificação de velocidades de pico das medidas de fluxo sanguíneo Doppler. Mostramos quantificação in vivo confiável de parâmetros sistólicos e diastólicos importantes, como fração de ejeção (EF), mudança de área fracionada (FAC), fluxo de sangue ventricular e velocidades de saída, freqüência cardíaca (HR) e saída cardíaca (CO). Contribuímos para estabelecer uma gama confiável de parâmetros funcionais e dimensionais cardíacos adultos saudáveis e saudáveis para permitir uma avaliação mais precisa dos estados patológicos. No geral, fornecemos um método robusto para avaliar a função cardíaca em zebrafish, que tem se mostrado extremamente útil no estabelecimento e validação de doenças cardíacas zebrafishmodelos 6,16, lesão cardíaca e recuperação10,13, e regeneração11,12, e pode ser usado ainda para avaliar drogas potenciais.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os procedimentos envolvendo zebrafish foram aprovados pelo nosso Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e estão em conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal do USDA.
1. Configuração experimental
-
Configuração da plataforma para aquisição de imagens
- Usando uma tesoura pequena ou um bisturi faça uma incisão em uma esponja na posição das 12 horas para segurar o peixe durante a varredura. Coloque a esponja em um recipiente de vidro(Figura 2A).
NOTA: A posição da incisão deve permitir espaço suficiente para mover o transdutor e também manter o peixe berrando a linha de água quando a plataforma estiver inclinada para digitalização (Figura 2). A incisão pode variar dependendo do tamanho do peixe; no entanto, para um tamanho e peso padrão, a incisão deve ser de aproximadamente 2,5 cm x 0,7 cm x 0,5 cm (comprimento, largura e profundidade, respectivamente). O recipiente de vidro deve ter pelo menos 6 cm de profundidade para evitar vazamento de água durante a imagem do peixe. - Afixar a caixa de vidro contendo a esponja na plataforma de ultrassom, por exemplo, usando fita dupla face. Certifique-se de que a caixa de vidro está no centro da plataforma e firmemente presa(Figura 2B).
- Incline a plataforma para a frente cerca de 30° usando o botão no lado esquerdo do porta-plataforma(Figura 2B). Encha o quadrado de vidro com 200-250 mL de água do sistema de peixe contendo 0,2 mg/mL de metanosulfonato tricaine (MS222).
NOTA: O tricaine pode ser preparado como uma solução de estoque de 4 mg/mL em Tris 40 mM pH 7 e ainda diluído à concentração desejada na água do sistema de peixes; 0,2 mg/mL foi considerada a melhor concentração16. A solução de estoque tricaine de 4 mg/mL pode ser armazenada por um longo período de tempo a -20 °C ou a 4 °C por um mês. - Insira o transdutor dentro do suporte do micromanipulador na estação ferroviária de trabalho, girando o entalhe do transdutor em direção ao operador. Mantenha a matriz paralela ao solo com o lado de trabalho longitudinal em relação ao estágio (ver Figura 2B). Deixe espaço suficiente (10 cm em ambos os lados) para que o sistema transdutor-ferroviário agora conectado se mova ao longo dos eixos x e y.
- Faça login no software de controle e escolha Mouse (Pequeno) Vascular. Crie um novo estudo, bem como uma nova série para cada animal incluído no estudo. Encontre o novo botão de estudo localizado no lado inferior esquerdo da tela na página do navegador (a exibição começa no modo B).
- Usando uma tesoura pequena ou um bisturi faça uma incisão em uma esponja na posição das 12 horas para segurar o peixe durante a varredura. Coloque a esponja em um recipiente de vidro(Figura 2A).
2. Manipulação do Peixe
NOTA: Os zebrafish utilizados neste estudo eram adultos, machos de 11 meses de idade da cepa do tipo selvagem AB/Tuebingen (AB/TU). Os zebrafish foram mantidos em um sistema de aquário autônomo a 28 °C em um ciclo de luz constante definido como 14 h luz/10 h escuro. Os zebrafish eram alimentados duas vezes por dia com camarão de salmoura(Artemia nauplii)e flocos de alimentos secos.
- Usando uma rede de peixe, transfira o peixe para um pequeno tanque contendo água do sistema com tricaine de 0,2 mg/mL. Aguarde até que o peixe esteja totalmente anestesiado (sem movimento e sem resposta ao toque).
- Usando uma colher de chá de plástico, transfira suavemente e rapidamente o peixe para a caixa de vidro contendo a esponja para a incisão anteriormente feita com o lado ventral do peixe voltado para cima.
NOTA: Certifique-se de que a cabeça do peixe está posicionada em direção ao operador (mesma direção do entalhe do transdutor) e em um nível ligeiramente mais alto em comparação com o resto do corpo para obter uma melhor visualização cardíaca. - Abaixe suavemente o transdutor (mantendo sua posição original) usando a alça no sistema ferroviário, colocando-o longitudinalmente e perto do lado ventral do peixe com o entalhe do transdutor voltado para o operador. Deixe 2-3 mm (não mais de 1 cm) de saque do peixe. Ajuste a plataforma em relação ao transdutor usando o micromanipulador em todos os 3 eixos até que o coração do peixe seja visualizado e, em seguida, iniciar a aquisição de imagem. O ângulo do transdutor não deve ser alterado durante toda a aquisição da imagem (Figura 2C).
NOTA: Enquanto houver proximidade suficiente (até 1 cm), a água em cima do peixe fornecerá uma superfície de contato através da tensão da superfície líquida que permite a transmissão das ondas de ultrassom entre a sonda e o peixe. Portanto, não há necessidade de empurrar o transdutor contra o peixe. Tente completar esta etapa e termine a varredura em menos de 3 minutos para evitar a morte do peixe ou uma diminuição da freqüência cardíaca durante a aquisição de imagens. Se necessário, use um temporizador. O coração pode ser encontrado no lado superior da tela em direção ao lado esquerdo do olho, que pode ser facilmente visualizado se mover o eixo x todo o caminho para a direita. Se houver dificuldade contínua em encontrar o coração durante o Modo B, mude para o modo Doppler de cor, que permitirá rastrear o fluxo sanguíneo (vermelho indica sangue fluindo em direção ao operador) e localizar o coração.
3. Aquisição de imagens
NOTA: Consulte A Tabela de Materiais para sistema de imagem e software de análise de imagens.
- Modo B de exibição longitudinal
- Depois de localizar o coração, selecione ou fique no Modo B (encontrado no lado inferior esquerdo da tela sensível ao toque depois de ter iniciado uma nova série) e reduza o campo para ampliar e ter um olhar mais atento ao coração para facilitar o rastreamento durante a análise.
- Para ter uma visão mais próxima e clara do coração na aquisição de imagem do Modo B, reduza o campo com zoom. Use a tela sensível ao toque para estreitar manualmente o campo nos eixos x e y.
- Se necessário, melhore a qualidade/contraste da imagem definindo o intervalo dinâmico para 45-50 dB. Vá para os controles do modo B na opção Mais Controles e, posteriormente, salve a alteração em Predefinições de Modo. Toque em Predefinições de modo para selecionar a configuração de aquisição de imagem otimizada todas as vezes antes de começar a visualizar uma nova série.
- Tire quantas imagens desejarem no plano de eixo longo selecionando Salvar imagem.
NOTA: Informações mais detalhadas e recursos de treinamento sobre aquisição de imagens podem ser encontrados em https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab e https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
- Onda de pulso de visão longitudinal
- Mude para Color Doppler para detecção de fluxo sanguíneo (selecione botão Cor) e aquisição (encontrado no lado inferior esquerdo da tela sensível ao toque depois de ter iniciado uma nova série).
- Usando a tela de toque posicione o quadrante na parte superior da válvula atrioventricular e localize a entrada, que será distinguida pelo sinal de cor vermelha(Figura 3A). Reduza a área do quadrante o máximo possível para aumentar a taxa de quadros.
NOTA: Reduza a freqüência de repetição de pulso de cor (Color PRF) (faixa de velocidade) para garantir que a cor amarela possa ser vista no perfil de velocidade da imagem Color Doppler. Isso aumentará a gama de velocidades que podem ser vistas e ajudará a criar um mosaico de cores que permitirá visualizar mais claramente as velocidades de pico. - Ativar o modo doppler de onda de pulso (selecione PW) para amostrar a velocidade de entrada de sangue ventricular. Posicione o portão de volume da amostra no centro da válvula atrioventricular (onde o sinal de cor vermelha se torna mais amarelado) para detectar a velocidade máxima de fluxo. Ajuste o ângulo PW na tela usando os dedos para que ele se alinhe com a direção da entrada de sangue. Pressione iniciar ou atualizar para começar a amostragem da velocidade do sangue que flui para o ventrículo.
NOTA: Certifique-se de que a linha correta do ângulo é paralela ao fluxo sanguíneo, a fim de fornecer resultados consistentes e reprodutíveis. Colocar a linha correta do ângulo para que corresponda à direção do fluxo sanguíneo garantirá que as velocidades sejam capturadas com precisão. - Repita a etapa 3.2.3 para determinar a velocidade de saída colocando o quadrante Color Doppler na junção entre o ventrículo e o bulbo (válvula bulbuventricular) e localize o fluxo, que será distinguido por um sinal de cor azul(Figura 3B). Posicione o portão de volume da amostra antes da junção ventrículo-bulbus e ajuste a linha de correção do ângulo para corresponder à direção do fluxo sanguíneo.
NOTA: Como mencionado anteriormente, para obter valores de velocidade precisos, certifique-se de que o ângulo PW esteja alinhado com o fluxo sanguíneo. - Ajuste a linha de base (barra), baixando-a ou elevando-a no painel de velocidade de fluxo, a fim de detectar e rastrear completamente os picos de sinal(Figura 3C,D). Identifique os picos de entrada no quadrante superior/positivo (sinal indo em direção à sonda) e os picos de fluxo no quadrante inferior/negativo (sinal que se afasta da sonda).
4. Recuperação de peixes
- Assim que a aquisição da imagem estiver completa, usando uma colher de chá, transfira o peixe para o sistema regular aterrou água aerada livre de tricaine e deixe o peixe recuperar (geralmente leva de 30 s a 2 min para retomar o movimento da brânquia e natação).
- Para ajudar na recuperação, esguiche água repetidamente sobre as brânquias usando uma pipeta de transferência para promover a aeração da transferência de água e oxigênio.
5. Análise de imagens
- Abra o software de análise de imagens.
- Selecione uma imagem e clique no ícone de processamento de imagem(Figura 4). Utilizando a escala disponível(Figura 4),ajuste o brilho e o contraste da imagem para permitir uma visualização clara das paredes ventriculares ou do padrão de fluxo sanguíneo.
- Usando a imagem do modo B, abra a lista de parada da opção PSLAX (eixo longo parasternal) no pacote cardíaco/medidas(Figura 4). Selecione o traço de LV e trace a parede interna ventricular em sístole e diastole para obter a área ventricular (VA) em sístole (VAs) e diastole (VAd), volume diastólico final (EDV) e volume sistólica final (ESV) ( Figura5A,B).
NOTA: Os valores de volume são extrapolados a partir de rastreamentos de imagens 2D e podem desviar-se da entidade 3D. Para todas as medições, média de pelo menos 3 ciclos cardíacos representativos por animal. - Observe o volume de traçado e a fração de ejeção que serão automaticamente calculados e exibidos pelo software.
NOTA: Volume de traçado e fração de ejeção também podem ser calculados manualmente usando as fórmulas
SV = EDV-ESV
EF = (EDV-ESV)/EDV
onde SV é volume de traçado, EDV é volume diastólico final, ESV é volume sistólica final, e EF é fração de ejeção - Calcular mudança de área fracionada usando a fórmula
FAC = (VAd - VAs)/ VAd
onde FAC é mudança de área fracionada, VAd é área ventricular em diastole, e VAs é área ventricular em sístole. - Calcule a saída cardíaca usando a fórmula
CO = HR x SV
onde CO é saída cardíaca, HR é freqüência cardíaca, e SV é volume de derrame - Usando a imagem do modo doppler de onda pulsada, meça a velocidade sanguínea de entrada selecionando a opção Fluxo MV o pacote cardíaco(Figura 4). Selecione E ou A para diastole precoce e diastole tardia, respectivamente, e determine as velocidades de pico no gráfico(Figura 3C).
- Meça a velocidade sanguínea de saída selecionando Fluxo AoV e determine os picos no traçado(Figura 3D).
- Meça a freqüência cardíaca usando 2 metodologias diferentes para uma avaliação mais confiável:
- Quando o coração é visualizado na tela durante a aquisição da imagem, conte as batidas dentro de 10 s e multiplique-o por 6.
- Usando a imagem Pulse Wave Doppler no software Vevo LAB, escolha o botão de freqüência cardíaca e os intervalos de rastreamento entre 3 picos de fluxo aórtico consecutivos(Figura 4 e Figura 6).
- Para exportar dados para uma planilha depois de ter rastreado o LV e os picos do fluxo sanguíneo, clique no relatório | exportação | save as | excel.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O protocolo descrito permite a medição de importantes parâmetros cardíacos dimensionais e funcionais, análogos à técnica utilizada na ecocardiografia humana e animal. As imagens do Modo B permitem o rastreamento da parede interna ventricular em sístole e diastole(Figura 5) e a obtenção de dados dimensionais, como dimensões de câmara e parede, e dados funcionais, como freqüência cardíaca, volume de derrame e saída cardíaca, bem como parâmetros de função sistól...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Descrevemos um método sistemático para a imagem ecocardiográfica e avaliação da função cardíaca em zebrafish adultos. A ecocardiografia é o único método não invasivo e mais robusto disponível para imagem cardíaca de peixe adulto vivo e análise funcional, e está se tornando cada vez mais popular na pesquisa cardiovascular de zebrafish. O tempo necessário é curto e permite estudos longitudinais de alta duração e de alta duração. No entanto, há uma variação considerável na metodologia empregada e na análise dos dados. A pad...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Agradecemos o apoio técnico de Fred Roberts e a revisão do manuscrito.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fita | |||
| Rede de | |||
| Recipiente de vidro - 100 polegadas de altura | |||
| Transdutor de alta frequência | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Largura da banda 29-71 MHz, Transmissão central 50 MHz, Resolução axial 30 µ m |
| Colher de chá | |||
| Bisturi ou tesoura | |||
| Pequenos tanques | |||
| de peixes Esponja (esponja de cozinha) | |||
| Pipetas de transferência (graduadas 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Sistema de imagem e estação de imagem | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB software v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
Referências
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Verkerk, A. O., Remme, C. A. Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders. Frontiers in Physiology. 3, 255(2012).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).
- Poon, K. L., Brand, T. The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects. Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Mishra, S., et al. Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).
- Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
- Mishra, S., et al. Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).
- Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish. Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).
- González-Rosa, J. M., et al. Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish. PLoS One. 9 (12), (2014).
- Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration. Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).
- Kang, B. J., et al. High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts. Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).
- Lee, J., et al. Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair. Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).
- Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz). Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).
- Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish. Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Models & Mechanisms. 10 (1), 63(2017).
- Lee, L., et al. Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography. PLOS ONE. 11 (1), e0145163(2016).
- Genge, C. E., et al. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. Nilius, B., et al. 171, Springer International Publishing. 99-136 (2016).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
