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Artigo de método

Determinação da eficiência do inibidor químico contra o crescimento intracelular toxoplasma Gondii usando um ensaio de crescimento baseado em luciferase

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DOI:

10.3791/60985

29 de abril de 2020

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para avaliar a eficácia da inibição de compostos químicos contra o crescimento intracelular in vitro de Toxoplasma gondii usando um ensaio de crescimento à base de luciferase. A técnica é usada para confirmar a especificidade da inibição pela exclusão genética do gene alvo correspondente. A inibição do LHVS contra a protease TgCPL é avaliada como um exemplo.

Resumo

Toxoplasma gondii é um patógeno protozoário que afeta amplamente a população humana. Os antibióticos atuais utilizados no tratamento da toxoplasmose clínica são limitados. Além disso, apresentam efeitos colaterais adversos em certos grupos de pessoas. Portanto, a descoberta de novas terapêuticas para toxoplasmose clínica é imperativa. O primeiro passo do novo desenvolvimento de antibióticos é identificar compostos químicos que ausitem alta eficácia na inibição do crescimento de parasitas usando uma estratégia de triagem de alto desempenho. Como um patógeno intracelular obrigatório, o Toxoplasma só pode se replicar dentro das células hospedeiras, o que proíbe o uso de medidas de absorvância óptica como um indicador rápido de crescimento. Apresentado aqui é um protocolo detalhado para um ensaio de crescimento baseado em luciferase. Como exemplo, este método é usado para calcular o tempo de duplicação de parasitas toxoplasma do tipo selvagem e medir a eficácia do crescimento intracelular de morfolinurea-leucil-leucyl-vinil sulfone (LHVS, um composto de protease cisteína) em relação à inibição do crescimento intracelular parasitário. Também é descrito um protocolo de exclusão genética baseado em CRISPR-Cas9 no Toxoplasma usando regiões homólogas de 50 bp para recombinação dependente de homologia (HDR). Ao quantificar as eficácias de inibição do LHVS em tipos selvagens e tgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease)-deficientes, é mostrado que o LHVS inibe o crescimento de parasitas do tipo selvagem de forma mais eficiente do que o crescimento de Δcpl, sugerindo que o TgCPL é um alvo ao que o LHVS se liga no Toxoplasma. A alta sensibilidade e o fácil funcionamento deste ensaio de crescimento à base de luciferase tornam-no adequado para monitorar a proliferação do Toxoplasma e avaliar a eficácia da droga de forma de alta produtividade.

Introdução

Toxoplasma gondii é um parasita intracelular altamente bem sucedido que infecta aproximadamente um terço da população humana. Sua alta taxa de transmissão é predominantemente devido às suas diversas rotas de transmissão, incluindo consumo de carne mal cozida, exposição a reservatórios de mamíferos e transmissão congênita durante o nascimento. T. gondii causa principalmente infecções oportunistas que podem levar à morbidade e mortalidade graves em indivíduos imunocomprometidos1,2,3,4,5....

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Protocolo

O toxoplasma gondii é categorizado no Grupo de Risco 2 e deve ser manuseado em um Nível de Biossegurança 2 (BSL-2). O protocolo foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Biossegurança da Universidade Clemson.

1. Ensaio de crescimento de toxoplasma baseado em luciferase

  1. Fibroblastos de prepúcio (HFFs) 1 semana antes da inoculação do parasita para garantir que as células hospedeiras sejam totalmente confluentes. Realize um ensaio simulado em uma placa transparente para garantir que os parasitas permaneçam intracelulares durante todo o período de avaliação.
    NOTA: Aqui, o ensaio é conduzido em 96 microp....

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Resultados

A Figura 1 representa um exemplo de uma curva de crescimento para o RHΔku80::Tensão NLuc e o cálculo derivado para o seu tempo de duplicação. Geralmente, o ensaio é realizado em três réplicas técnicas para cada uma das três réplicas biológicas para explicar as variações das leituras da atividade da luciferase. Para calcular a mudança de dobra normalizada do crescimento do parasita, cada leitura a 24-96 h pós-infecção foi dividida pela leitur.......

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Discussão

++Este protocolo descreve um protocolo baseado em luciferase para avaliar o crescimento do Toxoplasma intracelular e avaliar a eficácia da inibição de compostos químicos contra o crescimento de parasitas. Comparado com as estratégias existentes disponíveis para medir o crescimento do Toxoplasma intracelular, este método apresenta alta sensibilidade e especificidade. Enquanto monitora o crescimento de parasitas, recomenda-se um ensaio simulado em uma microplaca clara de 96 poços para confirmar que a cepa.......

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Divulgações

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer aos Drs. Sibley e Carruthers por compartilharem os anticorpos pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT e anti-TgCPL e TgActin. Este trabalho foi apoiado pelo fundo Clemson Startup (para Z.D.), Knights Templar Eye Foundation Pediatric Oftalmology Career-Starter Research Grant (para Z.D.), uma bolsa piloto de uma bolsa NIH COBRE P20GM109094 (para Z.D.), e NIH R01AI143707 (para Z.D.). Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou elaboração do manuscrito.

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de extração de gel de agaroseNew England BioLabsT1020L
BamHINew England BioLabsR0316S
Biotek Synergy H1 Leitor de microplacas multimodo híbridoBioTek Instuments
BTX Gemini Twin Waveform Electroporation SystemHarvard Apparatus
Células E. coli quimicamente competentesNew England BioLabsC29871
CloneAmp HiFi PCR premixTakara Bio639298
Coelenterazine hProlume301-10 hCTZ
EcoRVNew England BioLabsR3195S
Phire Tissue Direct PCR Master MixThermo ScientificF170L
Plasmid miniprep kitZymo ResearchD4054
Q5 Kit de mutagênese dirigida ao localNew England BioLabsE0554S
Software
Software geneioso para design de sgRNA (versão: R11)
Software GraphPad Prism (versão 8th)
SnapGene para clonagem molecular (versão: 4.2.11)

Referências

  1. Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).
  2. Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P.

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Reimpressões e permissões

Etiquetas

Dele o G nica por CRISPR Cas9Tempo de Duplica o do ParasitaComposto LHVSGene TgCPLTriagem de Alto RendimentoFibroblastos de Prep cio HumanoLeitor de Microplacas