Determinação da eficiência do inibidor químico contra o crescimento intracelular toxoplasma Gondii usando um ensaio de crescimento baseado em luciferase

Melanie Key; Amy Bergmann; Chiara Micchelli; L. Brock Thornton; Sophie Millard; Zhicheng Dou

doi:10.3791/60985

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Artigo de método

Determinação da eficiência do inibidor químico contra o crescimento intracelular toxoplasma Gondii usando um ensaio de crescimento baseado em luciferase

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DOI:

10.3791/60985

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29 de abril de 2020

Melanie Key^*¹^,² , Amy Bergmann^*¹^,² , Chiara Micchelli¹^,² , L. Brock Thornton¹^,² , Sophie Millard¹^,² , Zhicheng Dou¹^,²

¹Department of Biological Sciences, Clemson University, ²Eukaryotic Pathogens Innovation Center, Clemson University

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para avaliar a eficácia da inibição de compostos químicos contra o crescimento intracelular in vitro de Toxoplasma gondii usando um ensaio de crescimento à base de luciferase. A técnica é usada para confirmar a especificidade da inibição pela exclusão genética do gene alvo correspondente. A inibição do LHVS contra a protease TgCPL é avaliada como um exemplo.

Resumo

Toxoplasma gondii é um patógeno protozoário que afeta amplamente a população humana. Os antibióticos atuais utilizados no tratamento da toxoplasmose clínica são limitados. Além disso, apresentam efeitos colaterais adversos em certos grupos de pessoas. Portanto, a descoberta de novas terapêuticas para toxoplasmose clínica é imperativa. O primeiro passo do novo desenvolvimento de antibióticos é identificar compostos químicos que ausitem alta eficácia na inibição do crescimento de parasitas usando uma estratégia de triagem de alto desempenho. Como um patógeno intracelular obrigatório, o Toxoplasma só pode se replicar dentro das células hospedeiras, o que proíbe o uso de medidas de absorvância óptica como um indicador rápido de crescimento. Apresentado aqui é um protocolo detalhado para um ensaio de crescimento baseado em luciferase. Como exemplo, este método é usado para calcular o tempo de duplicação de parasitas toxoplasma do tipo selvagem e medir a eficácia do crescimento intracelular de morfolinurea-leucil-leucyl-vinil sulfone (LHVS, um composto de protease cisteína) em relação à inibição do crescimento intracelular parasitário. Também é descrito um protocolo de exclusão genética baseado em CRISPR-Cas9 no Toxoplasma usando regiões homólogas de 50 bp para recombinação dependente de homologia (HDR). Ao quantificar as eficácias de inibição do LHVS em tipos selvagens e tgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease)-deficientes, é mostrado que o LHVS inibe o crescimento de parasitas do tipo selvagem de forma mais eficiente do que o crescimento de Δcpl, sugerindo que o TgCPL é um alvo ao que o LHVS se liga no Toxoplasma. A alta sensibilidade e o fácil funcionamento deste ensaio de crescimento à base de luciferase tornam-no adequado para monitorar a proliferação do Toxoplasma e avaliar a eficácia da droga de forma de alta produtividade.

Introdução

Toxoplasma gondii é um parasita intracelular altamente bem sucedido que infecta aproximadamente um terço da população humana. Sua alta taxa de transmissão é predominantemente devido às suas diversas rotas de transmissão, incluindo consumo de carne mal cozida, exposição a reservatórios de mamíferos e transmissão congênita durante o nascimento. T. gondii causa principalmente infecções oportunistas que podem levar à morbidade e mortalidade graves em indivíduos imunocomprometidos¹^,²^,³^,⁴^,⁵^....