É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Medições de Respostas de Estresse Fisiológico em C. Elegans

14.4K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/61001

⸱

21 de maio de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, caracterizamos as respostas de estresse proteotóxico celular no nematoide C. elegans medindo a ativação de repórteres transcritores fluorescentes e atribuindo sensibilidade ao estresse fisiológico.

Resumo

Organismos são frequentemente expostos a ambientes flutuantes e mudanças na homeostase intracelular, que podem ter efeitos prejudiciais em seu proteome e fisiologia. Assim, os organismos evoluíram respostas de estresse direcionadas e específicas dedicadas a reparar danos e manter a homeostase. Esses mecanismos incluem a resposta proteica desdobrada do retículo endoplasmático (UPRER),a resposta proteica desdobrada das mitocôndrias (UPRMT),a resposta ao choque térmico (HSR) e a resposta ao estresse oxidativo (OxSR). Os protocolos aqui apresentados descrevem métodos para detectar e caracterizar a ativação dessas vias e suas consequências fisiológicas no nematoide, C. elegans. Em primeiro lugar, o uso de repórteres transcritores fluorescentes específicos da via é descrito para caracterização celular rápida, triagem de drogas ou triagem genética em larga escala (por exemplo, RNAi ou bibliotecas mutantes). Além disso, são descritos ensaios fisiológicos complementares e robustos, que podem ser utilizados para avaliar diretamente a sensibilidade dos animais a estressores específicos, servindo como validação funcional dos repórteres transcritores. Juntos, esses métodos permitem a rápida caracterização dos efeitos celulares e fisiológicos das perturbações proteotóxicas internas e externas.

Introdução

A capacidade de um organismo de responder a mudanças no ambiente intra e extracelular é crucial para sua sobrevivência e adaptação. Isso é feito em nível celular através de numerosas vias de proteção que garantem a integridade da célula. Embora numerosos componentes celulares estejam sujeitos a danos associados ao estresse, um grande envolvimento das respostas ao estresse celular é reparar e proteger a homeostase do proteome celular. No entanto, a compartimentação de proteínas em estruturas especiais, chamadas organelas, representa um desafio para a célula, pois não pode contar com uma forma centralizada de controle de qualidade proteica para garantir que todas as proteínas dentro da célula sejam devidamente dobradas e funcionais. Portanto, para lidar com perturbações de suas proteínas, organelas desenvolveram mecanismos dedicados de controle de qualidade, que podem sentir proteínas desdobradas e ativar uma resposta ao estresse na tentativa de aliviar o estresse dentro desse compartimento. Por exemplo, o citosol depende da resposta ao choque térmico (HSR), enquanto o retículo endoplasmático (ER) e mitocôndrias dependem de suas respostas proteicas desdobradas específicas do compartimento (UPR). O OxSR serve para aliviar os efeitos tóxicos das espécies de oxigênio reativa (ROS). Cada resposta ao estresse é desencadeada na presença de desafios celulares e insultos ambientais e induz uma resposta transcricional sob medida. As marcas dessas respostas incluem sintetizar moléculas que redobram proteínas desdobradas (como acompanhantes) direcionadas à organela adequada, ou, alternativamente, remover proteínas danificadas pela degradação proteica. A falha em ativar essas respostas de estresse resulta no acúmulo de proteínas danificadas, disfunção celular propagada para falha sistêmica dos tecidos e, eventualmente, morte do organismo. A função e a regulação das diferentes respostas ao estresse são revisadas em outros lugares1.

Muitos insights sobre a regulação e atividade das respostas ao estresse celular foram atribuídos ao nematode, Caenorhabditis elegans, um organismo modelo multicelular em pesquisa genética. Os nematóides não só permitem estudar a ativação das respostas ao estresse no nível celular, mas também no nível organismo; nematóides têm sido usados para estudar os efeitos de perturbações genéticas ou exposição a drogas e poluentes em seu crescimento e sobrevivência. Seu tempo de geração rápida, isogenia, transparência, trabilidade genética e facilidade de uso durante a experimentação os tornam ideais para tais estudos. Além disso, a resposta fisiológica relativamente rápida ao estresse (entre horas e poucos dias) e a conservação evolutiva das vias celulares fazem dos nematóides uma ferramenta proeminente no estudo da resistência ao estresse.

Existem duas cepas de E. coli comumente usadas como fonte de alimento para cultivar C. elegans: padrão OP50, uma cepa B na qual a maioria das experimentações foi historicamente realizada2 e HT115, uma cepa K-12 que é usada para quase todos os experimentos RNAi3,4. É importante notar que existem diferenças significativas entre as dietas bacterianas OP50 e HT115. O crescimento dessas diferentes fontes bacterianas tem sido demonstrado para causar grandes diferenças no perfil metabólico, número de cópia de DNA mitocondrial e vários dos principais fenótipos, incluindo a vida útil5. Algumas dessas diferenças são atribuídas à deficiência de Vitamina B12 associada ao crescimento das bactérias OP50, o que pode resultar em defeitos na homeostase mitocondrial e aumento da sensibilidade a patógenos e estresses. Todos esses fenótipos têm sido amenizados pelo crescimento das bactérias HT115, que têm níveis mais elevados de Vitamina B126. Portanto, recomenda-se que todos os experimentos em respostas fisiológicas ao estresse sejam realizados em bactérias HT115, independentemente da necessidade das condições rnai. No entanto, devido à facilidade de manutenção de animais na OP50, todo o crescimento padrão (ou seja, manutenção e amplificação de animais) pode ser realizado na OP50, uma vez que diferenças significativas nos paradigmas experimentais descritos aqui não foram detectadas em vermes mantidos na OP50 desde que fossem transferidos para HT115 pós-sincronização (ou seja, de eclosão pós-branqueamento com ou sem L1) até a experimentação.

Aqui, é descrita a caracterização da atividade das respostas ao estresse celular utilizando dois métodos funcionais. Deve-se notar que os protocolos apresentados são focados principalmente nas respostas ao estresse celular e seu impacto na homeostase proteica. Em primeiro lugar, são utilizados repórteres transcricionais fluorescentes, que são regulados por promotores genéticos endógenos que são especificamente ativados em resposta a diferentes tensões celulares. Esses repórteres transcritores fluorescentes baseiam-se na indução transcricional de genes específicos que fazem parte nativamente da resposta ao estresse. Por exemplo, hSP-4, um ortologode de proteína de choque térmico para a acompanhante humana HSPA5/BiP, é ativado sobre o estresse er e localiza-se para o ER para aliviar o estresse. Em condições de estresse er (por exemplo, exposição à tnicamicina), uma proteína fluorescente verde (GFP), colocada sob a regulação do promotor hsp-4, é sintetizada em altos níveis, como pode ser avaliada por microscopia fluorescente ou quantitativamente medida utilizando citometria de fluxo de partículas grandes de nematóides7. Da mesma forma, utiliza-se o promotor de um acompanhante mitocondrial, hsp-6 (ortologos a mamíferos HSPA9), para monitorar a ativação do UPRMT8, e o promotor da acompanhante citossólica hsp-16.2 (ortologous aos genes alfa cristalino humano) é utilizado para avaliar a atividade do HSR9. Esses repórteres permitem uma rápida caracterização dos caminhos ativados em resposta a várias perturbações.

Muitas vezes, os repórteres aqui apresentados são imagem do uso de microscopia, que fornece uma saída qualitativa da ativação de respostas ao estresse. No entanto, embora as técnicas de imagem forneçam informações sobre a intensidade e a localização do tecido dos repórteres descritos acima, sua quantificação nem sempre é precisa ou robusta. Embora seja possível quantificar a ativação fluorescente usando ferramentas de análise de imagem, esses métodos são relativamente baixos de throughput e o tamanho da amostra é pequeno, devido ao número relativamente baixo de animais com imagem. A facilidade e a capacidade de obter grandes quantidades de animais rapidamente fazem de C. elegans um sistema de modelo ideal para medir a ativação de repórteres de estresse fluorescente através do uso de um grande citómetro de fluxo de partículas. Um citómetro de fluxo de partículas grandes é capaz de registrar, analisar e classificar com base no tamanho e fluorescência de muitos animais vivos. Usando este método, é possível obter a intensidade fluorescente, tamanho e também informações espaciais (2D) para milhares de vermes. O sistema é controlado utilizando o FlowPilot, que permite a aquisição e análise de dados em tempo real dos parâmetros medidos. Aqui, métodos para imagens microscópicas e análise quantitativa usando um citómetro de fluxo de partículas de grande porte são oferecidos como métodos para medir a ativação das respostas ao estresse.

Além da análise do repórter, a sensibilidade ou resistência dos animais ao estresse pode ser medida por meio de ensaios de estresse fisiológico. Isso é conseguido expondo animais a ambientes estressantes que ativam vias específicas de estresse celular. Aqui, vários métodos são fornecidos para medir a sensibilidade de animais inteiros a tipos específicos de estressores.

O estresse er é aplicado a C. elegans usando o agente químico, tunicamicina, que bloqueia a glicosilação ligada a N, causando acúmulo de proteínas dobradas no ER10. Em C. elegans,o crescimento após a exposição à tnicamicina resulta em grandes perturbações na função ER, e uma redução significativa da vida útil11. Ao medir a sobrevivência dos animais em placas contendo tnicamicina, a sensibilidade ao estresse de ER dos animais pode ser quantificada. Por exemplo, animais com indução ectópica UPRER e, portanto, aumento da resistência ao estresse desdobrado de proteína no PS têm uma sobrevida aumentada sobre a exposição à tnicamicina em comparação com animais do tipo selvagem12.

O estresse oxidativo e mitocondrial é aplicado aos C. elegans expondo os animais ao agente químico, paraquat. Paraquat é um herbicida comumente usado, que causa formação de superóxido especificamente nas mitocôndrias13. Devido à localização específica de espécies de oxigênio reativo derivadas de mitocôndrias (ROS), ensaios de paraquat são frequentemente usados como um ensaio de estresse "mitocondrial". No entanto, o superóxido é rapidamente convertido em peróxido de hidrogênio por dismutases de superóxido mitocondrial (SODs)14. O peróxido de hidrogênio pode posteriormente difundir-se para fora das mitocôndrias e causar estresse oxidativo em outros compartimentos da célula. Por isso, descrevemos ensaios de sobrevivência de paraquat como a sensibilidade de medição tanto ao estresse mitocondrial quanto ao oxidativo (outros ensaios de estresse oxidativo podem ser encontrados15).

Os ensaios de termotolerância são realizados em C. elegans colocando animais em temperaturas elevadas. As temperaturas ambientes para nematóides são de ~15-20 °C e o estresse térmico é induzido a temperaturas acima de 25 °C16,17. Os ensaios de termotolerância são geralmente realizados a temperaturas que variam de 30-37 °C, uma vez que os animais apresentam grandes defeitos celulares a esta temperatura, e os ensaios de sobrevivência são concluídos dentro de 24 horas16,18. Aqui, dois métodos alternativos são fornecidos para a realização de ensaios de termotolerância: crescimento a 34 °C e crescimento a 37 °C. Juntos, os protocolos aqui apresentados podem ser utilizados para realizar telas em larga escala quando combinados com o knock-down genético padrão usando interferência de RNA ou bibliotecas de medicamentos químicos.

O protocolo pode ser dividido em 4 procedimentos amplos: crescimento de C. elegans e preparação para imagens (seções 1 e 2), imagens de repórteres transcritores usando microscopia fluorescente (seções 3-5), medidas quantitativas de repórteres usando um citómetro de fluxo de partículas de grande porte (seção 6) e ensaios fisiológicos para medir a sensibilidade ao estresse em C. elegans (seção 7).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Condições padrão de crescimento das temperaturas e OP50 vs HT115

  1. Crescimento e expansão padrão
    1. Cultivar uma cultura de OP50 em LB(Tabela 1) ou mídia equivalente de escolha para 24-48 h à temperatura ambiente (~22-25 °C). Cultivar bactérias à temperatura ambiente como OP50 é um auxotroph uracil e há uma maior incidência de revertantes (por exemplo, mutantes supressores) quando cultivados a 37 °C. O armazenamento a longo prazo das culturas OP50 não é recomendado (máx 1 semana a 4 °C).
    2. Semeie um volume de ~100-200 μL de cultura OP50 saturada em uma placa NGM de 60 mm(Tabela 1)para manutenção de vermes e 1 mL de cultura OP50 saturada em uma placa de 100 mm para expansão de animais para experimentação.
    3. Deixe as placas secarem durante a noite em um banco.
      NOTA: Placas de 100 mm podem precisar de mais tempo para secar, especialmente se usarplacas não ventiladas. Armazene todas as placas C. elegans em recipientes a ar condicionado armazenados a 4 °C. Não utilize placas com mais de 6 meses de idade, pois ocorrerá a dessecação das placas, o que mudará a fisiologia animal nas placas devido à pressão osmótica diferente e rigidez das placas.
    4. Para manutenção padrão, mova 10-15 animais jovens (ovos, estágios L1 ou L2) para uma placa de 60 mm, embora mais possam ser movidos se lidarem com mutantes ou animais transgênicos com menor fecundidade. Para animais com defeitos de desenvolvimento ou fecundidade, remasse uma piscina mais variável de animais para evitar a perda do estoque. Se mantido a 15 °C, mova animais toda semana; por 20 °C, mova animais a cada 3-4 dias.
    5. Realize um degelo fresco de animais a cada 25-30 passagens (~ 6 meses se os animais são movidos uma vez por semana e mantidos a 15 °C).
    6. Para expansão, coloque uma placa completa de 60 mm em placas de 100 mm para expansão. Como referência, animais com fecundidade do tipo selvagem podem ter uma placa completa de 60 mm cortada em 4ºs-6ths e ser cortados em uma placa grande a 20 °C por 2 dias ou 15 °C por 3 dias para criar uma placa completa de 100 mm sem chegar à fome.

2. Estadiamento/sincronização de worms usando branqueamento

  1. Protocolo de branqueamento para sincronizar worms
    1. Lave vermes gravid (adultos cheios de ovos) de placas de ágar usando M9(Tabela 1). Partindo de uma população não sincronizada de vermes (ou seja, vermes em pedaços do passo 1.1.6) para branquear para experimentos, uma vez que a deriva genética significativa pode ocorrer em rodadas sucessivas de sincronização via branqueamento.
    2. Mova a mistura worm/M9 para um tubo cônico de 15 mL usando uma pipeta de vidro; várias placas de vermes podem ser coletadas em um único tubo cônico de 15 mL.
    3. Girar animais para baixo para 30 s a 1.000 x g. Aspirar M9 supernatant. É desnecessário lavar bactérias residuais a menos que haja uma quantidade flagrante de contaminação ou grandes aglomerados de bactérias. Se este for o caso, execute várias lavadas com M9.
    4. Prepare um novo estoque de solução de branqueamento(Tabela 1). A solução de branqueamento pode ser mantida por vários dias a 4 °C, mas use solução de branqueamento recém-feita, pois o branqueamento ineficiente pode resultar em branqueamento desigual, o que causará danos aos ovos antes de eliminar todas as carcaças de vermes.
    5. Adicione 2-10 mL de solução de branqueamento aos animais (~1 mL de solução de alvejante para cada ~0,1 mL de pelota animal). Inverta a mistura de alvejante e verme por ~5 min (não exceda 10 min; note que os tempos de branqueamento podem variar e devem ser titulados especificamente para cada laboratório). Agite vigorosamente para ajudar a dissolver carcaças de vermes mais rapidamente e para a preservação ideal dos ovos. Procure periodicamente sob um microscópio de dissecção ou coloque o tubo cônico a uma luz para observar quando as carcaças de vermes adultos foram totalmente dissolvidas e apenas os ovos permanecem no tubo.
    6. Pelota os ovos girando a 1.000 x g por 30 s e, em seguida, aspirar o sobrenadante. Os ovos podem ser centrifugados mais rápido que os vermes sem interromper sua integridade, por isso, se não tiverem certeza da velocidade da centrífuga, os ovos podem ser girados para baixo em até 2.500 x g sem afetar sua fisiologia.
    7. Adicione M9 até 15 mL e inverta o tubo para limpar o alvejante dos ovos.
    8. Repita as etapas 2.1.6-2.1.7 (processo de lavagem/pelota) 2-3 vezes mais para remover o alvejante.
    9. Ovo pipet/M9 misture em placas e cresça a 15-20 °C para experimentação. Para obter uma medida de quantos vermes usar, realize a contagem aproximada de ovos, pipetando 5 μL de mistura de ovos em uma placa de ágar ou slide e dividindo a contagem de ovos por 5 para determinar o número de ovos por 1 μL de volume. Uma média de 3 contagens independentes pode melhorar a precisão. Para evitar a fome, uma tabela de contagem recomendada de ovos por prato está disponível na Tabela 2.
    10. Se necessário, L1 prende animais para uma sincronização temporal mais apertada colocando a mistura de ovo/M9 em um rotor a 20 °C por até 24 h. Para animais do tipo selvagem, não foram detectados defeitos na fisiologia animal quando l1 prende por até 48 h. No entanto, mutantes sensíveis à fome (por exemplo, mutantes de sossomoso ou autofagia) fazem muito mal com a prisão de L1, e, portanto, não é recomendável realizar este método de sincronização para mutantes que são conhecidos por serem sensíveis à fome. Se for necessária uma sincronização mais rigorosa para animais que não podem ser presos L1, use o método de ovo-lay descrito na seção 2.2.
  2. Protocolo de ovo-lay para sincronizar worms
    NOTA: Como método alternativo ao branqueamento, um ensaio de ovo pode ser realizado. O ovo-lay é usado quando o branqueamento de animais não proporciona uma sincronização próxima o suficiente, pois os ovos dentro do saco de ovos de animais adultos podem ser tão diferentes quanto 8-12 h de diferença. Para paradigmas experimentais onde é fundamental que os animais sejam o mais próximos possível, mas onde a prisão de L1 não é possível (por exemplo, em mutantes da fome), são recomendados ensaios de ovo-leigo. No entanto, deve-se notar que, devido ao trabalho envolvido no protocolo de leigos, é menos viável realizar experimentos de alta escala.
    1. Coloque 4-12 adultos gravídicos (ver Nota após o passo 2.2.2) em uma placa NGM padrão OP50 ou HT115 (ver Seção 1 acima para recomendações sobre cepas bacterianas). Dependendo da escala de experimentos, várias placas podem ser usadas. Certifique-se de documentar cuidadosamente quantos animais estão em cada prato para a etapa 2.2.
    2. Coloque os animais na temperatura desejada para experimentos (15-20 °C) por 4-8 h.
      NOTA: O número de horas que os animais são deixados na placa determinará o quão intimamente sincronizado o primeiro ovo colocado e o último ovo colocado será, de modo que o tempo pode ser ajustado conforme necessário. Uma vez que os tempos de incubação mais curtos significam que cada animal tem menos tempo para colocar ovos, mais animais devem ser colocados em placas para garantir que ovos suficientes sejam colocados. Embora a taxa real de colocação de ovos não seja totalmente normalizada devido à tendência dos animais de passar por pequenas rajadas de ovos em vez de uma taxa normalizada de ovo-lay, a taxa média de ovos colocados por animal pode ser estimada em ~5 ovos/hora para animais que exibem fecundidade selvagem19. Ao tentar cultivar animais para o estágio adulto do 1º dia, cronometre o ovo-lay para ter <100 ovos por prato para evitar a fome (consulte a Tabela 2 para obter mais detalhes sobre os animais recomendados por prato).
    3. Remova animais adultos das placas. Certifique-se de que todos os animais adultos sejam removidos das placas, pois os animais continuarão a colocar ovos e resultarem em uma população não sincronizada e/ou fome da placa.

3. Condições de crescimento de vermes para imagens de repórteres transcritores

  1. Crescimento de vermes
    1. Cultura bacteriana inocular de HT115 abrigando pL4440 RNAi plasmídeo (EV) e/ou carregando um RNAi contra gene(s) alvo desejado em mídia LB complementada com carbenicillin 100 μg/mL e 20 μg/mL tetraciclina.
    2. Cultivar cultura durante a noite (~16 horas) para saturação em uma incubadora de 37 °C.
    3. Localize placas NGM RNAi de 60 mm com 200 μL de cultura bacteriana saturada e placas NGM RNAi de 100 mm com 1.000 μL de cultura bacteriana saturada. Deixe secar à temperatura ambiente (~22 °C) durante a noite no escuro (coberto vagamente com papel alumínio).
    4. Coloque a população sincronizada de vermes transgênicos carregando repórteres fluorescentes (ver Tabela 3 para lista completa) em placas NGM RNAi semeadas com bactérias de escolha.
    5. Cresça a 15-20 °C para etapas necessárias para repórteres específicos, conforme descrito abaixo.
  2. Considerações para a encenação de vermes para experimentações
    1. Realizar experimentos para repórteres transcritores no primeiro dia da idade adulta, com exceção de ensaios que requerem animais L4. De acordo com o WormAtlas, os animais L4 são obtidos aproximadamente 2,5 dias (~56 h) de crescimento a 20 °C da fase do ovo(www.wormatlas.org).
    2. Para "adultos do dia 1", use animais em aproximadamente 3-4 dias (~65-96 h) de crescimento a 20 °C após o emplacamento de ovos.
      NOTA: Esta ampla gama é explicada da seguinte forma: ~65 h a 20 °C é quando os animais atingem a "colocação de ovos", que é o verdadeiro estado de "idade adulta". 96 h é quando os animais entram no que wormAtlas descreve como "ovo-lay maximal", que é quando o adulto é um adulto gravídico e tem um saco de ovos cheio. É quando os animais seriam descritos como sendo mais velhos do que o primeiro dia e podem começar a apresentar diferenças, e assim os protocolos descritos aqui são todos recomendados para começar nesta etapa "dia 1" começando a partir de 65 h e até 96 h. Para os ensaios descritos aqui, grandes diferenças não foram observadas ao usar animais nesta janela ~65-96 h.
    3. Para replicar um único experimento, use um ponto de tempo semelhante para uma reprodutibilidade mais robusta (por exemplo, realize todos os experimentos a ~65 h ou ~96 h após o revestimento de ovos).
      NOTA: Alguns animais transgênicos e mutantes apresentam taxas de crescimento mais lentas. Para isso, existem duas recomendações. 1) Use sincronização escalonada, onde os animais podem ser branqueados em momentos diferentes para que a experimentação seja realizada ao mesmo tempo. Isso é recomendado quando a variabilidade técnica no ensaio pode ser maior do que as variâncias técnicas que podem surgir do ensaio de sincronização (por exemplo, ensaios de sobrevivência, que duram longas durações podem sofrer se não forem realizadas simultaneamente). 2) Use análise socida, onde os animais podem ser branqueados ao mesmo tempo, mas o ensaio em si é realizado em momentos diferentes. Isso é recomendado para ensaios muito simples que não têm variabilidade inerente (por exemplo, indução RNAi de respostas ao estresse).

4. Indução de respostas ao estresse

  1. Usando hsp-4p::GFP como leitura para a ativação doER UPR
    1. Induzindo o estresse do ER usando RNAi
      1. Preparar placas avistadas com bactérias RNAi visando o gene de interesse nas placas NGM RNAi (Tabela 1) como na seção 3. Utilizar ev como controle para níveis deER upr basal e knockdown RNAi de tag-335 (enzima para glicosilação n-ligada de proteínas residentes em ER; O knockdown RNAi tem efeitos semelhantes ao tratamento de tunicamicina) como um controle positivo para ativação doER UPR sob estresse ER.
      2. Sincronizar animais repórteres hsp-4p::GFP usando métodos descritos na seção 2.
      3. Ovos de placa em placas RNAi utilizando critérios recomendados na Tabela 2.
      4. Incubar ovos a 20 °C por aproximadamente 3-4 dias (~65-96 h) para realizar experimentos no primeiro dia da idade adulta. Para os experimentosUPR ER, há diferenças na fluorescência basal do repórter hsp-4::GFP quando cultivado em temperaturas diferentes. Portanto, realize todos os experimentos a 20 °C.
    2. Induzindo o estresse do ER usando um agente químico
      1. Sincronize os animais repórteres hsp-4p::GFP usando métodos descritos na seção 2 e cresça a 20 °C até que os animais cheguem ao estágio L4. Transfira animais para um tubo de M9. Permitir que os vermes se acomodem (~2-3 min por gravidade ou um giro de 30 s a 1.000 x g), e, em seguida, remover M9.
      2. Diluir a tunicamicina a 25 ng/mL em M9 (diluição de 1:40 de 1 mg/mL de estoque). Como controle, diluir também um volume equivalente de DMSO em M9.
      3. Adicione 25 ng/mL tunicamicina/M9 ou controle a solução DMSO/M9 para worms (use 400-500 mL para um tubo de 1,5 mL ou 2 mL para um tubo cônico de 15 mL). Incubar a 20 °C em uma plataforma rotativa por 3-4 horas.
        NOTA: A tunicamicina também pode ser diluída diretamente na mistura worm/M9.
      4. Permitir que os worms se instalem, removam a solução M9/TM e lavem com 1 mL de M9.
      5. Transfira os animais para placas NGM ou NGM RNAi e permita recuperar durante a noite (ou ~15-20 h) e chegar ao Dia 1 da idade adulta a 20 °C antes de realizar a microscopia fluorescente (seção 5). Uma recuperação durante a noite é realizada para permitir que um nível detectável de GFP se acumule.
      6. Alternativamente, induzir hsp-4p::GFP movendo animais L4 para placas de ágar contendo tunicafina de 25 ng/μL por 16-24 h. Isso tem uma indução muito mais robusta de hsp-4p::GFP devido à maior duração do estresse, e assim o alcance dinâmico é muito menor do que o ensaio descrito acima.
  2. Usando hsp-6p::GFP como leitura para a ativação doUPR MT
    1. Induzindo o estresse mitocondrial usando RNAi
      1. Ativar UPRMT seguindo o mesmo protocolo da seção 4.1.1, exceto usando o knockdown RNAi de genes mitocondriais, como cox-5b/cco-1 (subunidade citocromo c oxidase 5B; knockdown inibe a atividade da cadeia de transporte de elétrons). Para a ativação do UPRMT através de perturbações na função da cadeia de transporte de elétrons, o knockdown RNAi precisa ser realizado durante o desenvolvimento precoce20. Portanto, realize RNAi a partir da escotilha para esses experimentos.
    2. Induzindo o estresse mitocondrial usando um agente químico
      1. Preparar placas avistadas com bactérias RNAi visando o gene de interesse como na seção 3. Use bactérias HT115 mesmo em experimentos que não envolvam knockdown RNAi (ver Seção 1). Certifique-se de que ambas as placas NGM RNAi (ou NGM RNAi + DMSO0.2) e NGM RNAi + antimicina A(Tabela 1)estejam preparadas para a etapa 4.2.2.5.
      2. Sincronizar hsp-6p::GFP ou hsp-60p::GFP animais repórteres usando métodos descritos na seção 2.
      3. Ovos de placa em placas semeadas de escolha utilizando critérios recomendados na Tabela 2. Uma vez que a antimicina A é dissolvida em DMSO, cultivar os animais em placas NGM RNAi + DMSO0.2 da escotilha.
      4. Incubar ovos a 20 °C durante 2 dias (~56 h) para o estágio L4. Alternativamente, crie animais a 15 °C por 3 dias (~75 h).
      5. Mova worms de placas NGM RNAi + DMSO0.2 para NGM RNAi + antimicina A placas ou NGM RNAi + DMSO0.2 como controle. Os vermes podem ser movidos manualmente com uma picareta para experimentos em pequena escala, mas para experimentos em larga escala, recomendamos lavar animais com M9, estabelecer-se com centrifugação, aspirar M9 e, em seguida, chapeamento para placas NGM RNAi + antimicina A.
      6. Incubar vermes por ~20 h adicionais e imagem no 1º dia adulto (seção 5).
  3. Usando gst-4p::GFP como leitura para a resposta ao estresse oxidativo.
    1. Induzindo o OxSR usando RNAi
      1. Alternativamente, induzir gst-4p::GFP usando RNAi-knockdown do wdr-23 (codifica um regulador negativo de skn-1; assim, seu knockdown induz o OxSR) usando o protocolo descrito na seção 4.1.1.
    2. Induzindo o OxSR usando exposição ao hidróxido de tert-butilo químico (TBHP)
      1. Preparar placas avistadas com bactérias RNAi visando o gene de interesse como na seção 3. Use bactérias HT115 mesmo em experimentos que não envolvam knockdown RNAi (ver Seção 1).
      2. Sincronize os animais repórteres gst-4p::GFP usando métodos descritos na seção 2.
      3. Ovos de placa em placas semeadas de escolha utilizando critérios recomendados na Tabela 2. Certifique-se de preparar mais placas do que o necessário, pois o protocolo de tratamento medicamentoso resulta na perda de >10-20% dos animais. Para imagens, comece com >100 animais, e para classificação, comece com >1.000 animais.
      4. Incubar ovos em 20 °C durante 2 dias (~56 h) para o estágio L4. Alternativamente, crie animais a 15 °C por 3 dias (~75 h).
      5. Lave os animais L4 das placas e divida em dois tubos cônicos de 15 mL por condição. Aspirar volume para baixo para pelo menos 1 mL e adicionar um volume igual de TBHP de 2 mM recém-feito. Use um volume líquido total para pelo menos 2 mL, pois volumes mais baixos podem causar morte significativa de vermes ao girar. Não lave antes do tratamento medicamentoso, pois bactérias residuais das placas ajudarão a garantir que os vermes não morram defome durante a incubação.
      6. Incubar vermes no rotor por 4h a 20 °C.
      7. Lave os vermes girando a 1.000 x g,aspirando a mistura M9 + TBHP e substituindo por 15 mL de M9. Repita para uma segunda lavagem.
      8. Vermes de placa em EV RNAi para recuperar durante a noite (~16-24 h) a 20 °C. Os vermes podem ser recuperados na correspondência rnai de escolha, mas não foram observadas diferenças significativas quando recuperados em EV RNAi, de modo que isso pode ser feito para facilitar a configuração experimental. Tire imagens do 1º dia de adultos após a recuperação.
        NOTA: Uma recuperação durante a noite é realizada para permitir que um nível detectável de GFP se acumule. Sem essa recuperação, não há sinal GFP detectável. Se uma recuperação de curto prazo for desejada, é possível usar o ensaio descrito na seção 4.3.3.
    3. Induzindo o OxSR usando exposição ao paraquat oxidante químico (PQ)
      1. Repita todas as etapas na seção 4.2.2 para obter 2 lotes de animais L4 gst-4p::GFP em tubos cônicos de 15 mL por condição.
      2. Aspirar volume para baixo para pelo menos 1 mL e adicionar um volume igual de 100 μM PQ recém-feito. Semelhante a 4.3.2.5, recomenda-se um volume mínimo de 2 mL.
      3. Incubar vermes no rotor por 2h a 20 °C.
      4. Lave os vermes girando a 1.000 x g,aspirando a mistura M9 + PQ e substituindo por 15 mL de M9. Repita para uma segunda lavagem.
      5. Vermes de placa em EV RNAi para recuperar por 2 h a 20 °C e, em seguida, tirar imagens imediatamente após a recuperação.
        NOTA: 2h de recuperação foi a recuperação mínima necessária para visualizar a indução GFP.
  4. Usando hsp-16.2p::GFP e hsp-70p::GFP como leitura para ativação do HSR.
    1. Induzir hsr usando exposição a temperaturas elevadas
      1. Preparar placas avistadas com bactérias RNAi visando o gene de interesse como na seção 3. Use bactérias HT115, mesmo em experimentos que não envolvam knockdown RNAi (ver Introdução).
      2. Sincronizar hsp-16.2p::GFP ou hsp-70p::GFP animais repórteres usando métodos descritos na seção 2.
      3. Ovos de placa em placas semeadas de escolha utilizando critérios recomendados na Tabela 2. Certifique-se de preparar 2x o número de placas necessárias, pois metade da amostra será exposta a temperaturas elevadas para indução de choque térmico, e a outra metade servirá como um controle não-térmico.
      4. Incubar ovos a 20 °C por aproximadamente 3-4 dias (~65-96 h) para realizar experimentos no primeiro dia da idade adulta. Não plante vermes a 15 °C para experimentos de choque térmico, pois há apenas pequenas diferenças entre animais que experimentam choque térmico de 15 °C versus 20 °C.
      5. Mova grupos experimentais de animais para uma incubadora de 34 °C por 2 h. Coloque as placas na incubadora como uma única camada (ou seja, sem empilhamento de placas) para garantir a distribuição mais rápida e igualitária de calor entre as placas.
      6. Mova animais com choque térmico para uma incubadora de 20 °C para recuperar por 2h e, em seguida, imagem imediatamente (ver Seção 5). Os animais podem ser recuperados por mais tempo, se necessário, para uma maior indução de GFP.
        NOTA: 2h de recuperação foi a recuperação mínima necessária para visualizar a indução GFP.

5. Imagem usando um microscópio estéreo ou microscópio de campo largo/composto de baixa ampliação

  1. Preparação de vermes para microscopia fluorescente
    1. Pipeta 5-10 μL de 100 mM de azida de sódio em cima de uma placa NGM padrão (ou seja, sem bactérias).
      NOTA: A concentração de azida de sódio pode ser derrubada até 10 mM, embora a imobilização mais robusta tenha sido observada em azida de sódio de 100 mM sem efeito detectável no sinal fluorescente.
    2. Sob um microscópio dissecando, escolha 10-20 animais de placas experimentais e transfira para o local de azida de sódio. Os animais devem cessar o movimento logo após o pouso em azida de sódio, e a própria azida de sódio evaporará em segundos.
    3. Uma vez que a azida de sódio tenha evaporado, alinhe os animais à configuração de imagem desejada. Mova os animais lado a lado com lados anteriores e posteriores na mesma orientação para todos os animais. Animais de imagem imediatamente.
      NOTA: Não foram observadas alterações no sinal do repórter para qualquer um dos repórteres transcritores da Tabela 3 por até 15 min depois de paralisação em azida de sódio.
  2. Aquisição de imagem usando um microscópio estereomicroscópio
    NOTA: Para este protocolo, foi utilizado um microscópio Leica M205FA equipado com uma câmera CCD monocromática Leica DFC3000G, filtro Padrão Leica GFP (ex 395-455, EM 480 LP) e software LAS X. As configurações recomendadas para os tempos de exposição podem ser encontradas na Tabela 4.
    1. Lançar o programa LAS X.
    2. Inicie um novo projeto: Abra a guia de aquisição, clique em Abrir Projetos e clique em Pasta para abrir um novo projeto. Este projeto pode ser renomeado clicando com o botão direito do mouse na pasta e rolando para Rename ou clicando em F2. Na guia de aquisição, há também opções para ajustar o tempo de exposição e ampliar as configurações desejadas.
    3. Posicione a amostra de vermes sob o objetivo do microscópio e localize o ponto focal correto dos vermes usando a configuração de campo brilhante para minimizar o branqueamento fluorescente. O centro da amostra é onde a linha de ovos é claramente visível e não embaçada. Defina o tempo de exposição, zoom, foco e condensadores de campo brilhante para as configurações desejadas.
    4. Adquira uma imagem usando o botão Capturar imagem.
    5. Salve a imagem no formato .lif (Leica Image File) pois isso salva todas as imagens brutas e metadados. Um TIFF também pode ser exportado clicando com o botão direito (ou projeto) e sob a opção Salvar como opção, clique em TIFF. Isso armazenará todos os canais (por exemplo, campo brilhante e GFP) com quaisquer modificações (por exemplo, se o contraste for ajustado, isso será salvo no TIFF).
  3. Análise quantitativa de imagens fluorescentes
    1. Se for realizada uma análise quantitativa, tire imagens 3D. Isso é realizado clicando na opção de seção z rotulada com "z" no canto superior direito. As seções Z estarão ativas se esta caixa estiver vermelha.
    2. Otimize as seções z selecionando a faixa e a espessura da fatia no canto inferior esquerdo das opções ajustáveis. Sempre que possível, use o botão Otimizado do sistema para as configurações ideais.
    3. Capture a imagem e armazene a imagem conforme descrito acima na seção 5.2. Alinere minhocas com espaços entre eles para medidas mais fáceis.
    4. Importe imagens TIFF para o software de imagem de escolha (por exemplo, ImageJ).
    5. Para ImageJ, no menu Analisar, escolha 'Definir medidas ''Definir'. Verifique a seguinte: área, valor cinza médio, densidade integrada, etiqueta de exibição.
    6. Utilizando a ferramenta ROI (região de interesse), desenhe um ROI. Meça cada verme individualmente. No menu Analisar, escolha Medir ou pressione M. Desenhe um ROI no fundo onde não há vermes e, em seguida, meça o fundo da mesma maneira. Copiar ou salvar as medidas que aparecem na janela Resultados.
    7. Subtraia a densidade integrada de fundo da densidade integrada de cada ROI medido. A intensidade de fundo para um ROI é definida como o produto do valor médio de fundo cinza e a área do ROI desenhado.
  4. Aquisição de imagens usando um microscópio composto/de campo largo
    NOTA: Para imagens de repórteres transcritores usando um microscópio composto/de campo largo, este protocolo utiliza um microscópio Revolve ECHO R4 equipado com uma lente objetiva Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13, um filtro Padrão Olympus FITC (ex 470/40; em 525/50; DM 560), e um iPad Pro para a câmera e para dirigir o software ECHO. As configurações recomendadas para os tempos de exposição podem ser encontradas na Tabela 4.
    1. Use o touchpad para iniciar o programa de controle. Crie um novo álbum e nome de arquivo.
    2. Posição da placa sob a lente objetiva. Defina o tempo de exposição e a intensidade da fluorescência usando a linha de base (tratamento EV/controle) e o controle positivo, de modo que o sinal seja visível, mas não saturado.
    3. Salve uma imagem de campo brilhante e uma imagem GFP/FITC.

6. Medições quantitativas de repórteres usando um citómetro de fluxo de partículas de grande porte

NOTA: O crescimento e a preparação de vermes para análise de citómetro de fluxo de partículas grandes podem seguir os mesmos paradigmas das seções 1-5 para preparação de vermes para imagens fluorescentes, com a exceção de que um número maior de animais é necessário. Use >500 animais por condição, pois alguns animais são perdidos durante a manipulação, nem todos os animais passam pelos critérios de filtragem durante a quantificação, e alguns animais não são devidamente lidos pelo citómetro de fluxo. Lave os animais prontos para separar as placas em 5-10 mL de solução M9 em tubos cônicos de 15 mL para posterior triagem no citómetro de fluxo.

  1. Configuração de classificação usando um grande citómetro de fluxo de partículas
    1. Antes de ligar o citómetro de fluxo
      1. Certifique-se de que a garrafa líquida da bainha não está vazia. Prepare o líquido da bainha do estoque de 250x pelo menos algumas horas antes de usar o classificador, pois há uma pequena quantidade de detergente no fluido da bainha, o que pode causar bolhas que podem causar artefatos durante a aquisição.
      2. Certifique-se de que todos os recipientes de lixo não estejam cheios.
    2. Ligando o citómetro de fluxo
      1. Ligue o compressor de ar. Gire-o para Auto. Verifique o medidor de pressão - deve ser em torno de 30 psi.
      2. Ligue o instrumento. Use o interruptor de alimentação que está ao lado do cabo de alimentação à esquerda do instrumento.
      3. Ligue os lasers. Uma fonte de luz de 488 nm é geralmente suficiente para a maioria dos experimentos, embora uma fonte de luz de 561 nm precise ser usada se for necessária uma excitação maior para fluorescência vermelha.
      4. Abra o software FlowPilot; o instrumento deve fazer uma série de cliques ligando as diferentes válvulas.
      5. Ligue os lasers na janela do software clicando em Iniciar. Inicie o laser na janela popup do controle a laser Argon clicando em Executar. Isso deve fazer com que o laser se ligue e alcance cerca de 12 mW. O nível de fonte de luz 488 subirá para cerca de 12.
      6. Clique em Feito para fechar a janela.
    3. Verifica o software antes de progredir
      1. Verifique os medidores de pressão -Veja os 4 valores de pressão exibidos na parte inferior da janela. Os valores devem estar em torno da configuração original (Bainha 5.5-5.7; Amostra 5.7-6.0; Classificador 3.1-3.3; Limpar 8,5-8,7). Se parecer semelhante, verifique a caixa ao lado de Pressure OK.
      2. Verifique a fluífica -Para ter certeza de que não há bolhas de ar e detritos bloqueando o fluxo de bainha/amostra através da célula de fluxo, clique em Limpar várias vezes.
      3. Verifique a taxa de fluxo da bainha - Para isso, colete bainha para 60 s. Desligue o tipoe, em seguida, ligue bainha nos controles manuais para iniciar o fluxo da bainha. Coletar em um tubo de 15 mL para 60 s; a vazão deve ser de ~9-10 mL/min.
    4. Limpeza antes do uso do citómetro de fluxo
      1. Coloque ~3-5 mL de solução de alvejante de 10% na coleção 'copo' e clique em Adquirir. Deixe correr por ~30 s, clique em Abort, e remova o excesso com vácuo.
      2. Enxágüe o 'copo' da coleção com água desionizada e remova com vácuo. Repita 2x.
      3. Coloque ~3-5 mL de solução de limpeza COPAS na coleção 'copo' e clique em Adquirir. Deixe correr por ~30 s, clique em Abort, e remova a solução de limpeza em excesso com vácuo.
      4. Enxágüe o 'copo' da coleção com água desionizada e remova com vácuo. Repita 2x.
      5. Coloque ~3-5 mL de solução M9 na coleção 'copo' e clique em Adquirir. Deixe correr por ~30 s, clique em Parare remova o excesso de solução M9 com vácuo.
  2. Executando amostras no classificador
    1. Ajuste a potência e o tamanho do PMT a laser com base na condição que causa a ativação mais brilhante do repórter transcricional de interesse. As configurações recomendadas podem ser encontradas na Tabela 4.
    2. Adicione vermes preparados ao 'copo'. Clique em Adquirir. Observe para certificar-se de que todo o líquido não é levado para a máquina; isso fará com que o citómetro de fluxo tome ar e crie bolhas no detector.
    3. Clique em Abort quando a amostra for baixa e/ou animais suficientes foram coletados.
    4. Clique em Configuração | Armazenamento de dados | Somente fechado. Isso salvará os dados apenas com base nas restrições de tamanho. Clique em Armazenar fechado e salvar dados fechados. Clique em Apagar dados para apagar dados.
    5. Enxágüe o 'copo' da coleção com água desionizada e remova com vácuo. Repita 2x.
    6. Repita as etapas 6.2.1-6.2.5 com o resto das amostras.
  3. Calibração/ Controle de Qualidade - se necessário
    NOTA: Isto requer controle de funcionamento de 42 μM partículas fluorescentes GYR fornecidas, para calibrar o laser 488.
    1. Pressione o lábio metálico na parte superior do copo de amostra para remover o tubo de ar. Desrosqueia a tampa e use uma seringa para remover o líquido do copo de amostra.
    2. Misture bem a garrafa de partículas de controle antes de usar e adicione alguns mililitros no copo de amostra. Feche a tampa e coloque o ar de volta pressionando-o até que ele clique no lugar.
    3. No software, vá para a opção Ferramentas e clique em Executar partículas de controle.
    4. Para partículas de controle, redefinir os valores de PMT para: VERDE - 325; AMARELO - 365; VERMELHO- 575.
    5. Clique em Adquirir. A bainha deve ligar-se seguida de amostra. Uma vez que as contas começam a passar pela célula de fluxo, a taxa de fluxo será vista na parte inferior da tela. O ideal é que a vazão fique entre 5/s e 15/s. Se a vazão estiver muito baixa ou zero, gire a válvula de amostra fisicamente no sentido horário para aumentar a vazão. Se a vazão for muito alta, gire a válvula de amostra fisicamente no sentido anti-horário para diminuir a vazão.
      NOTA: Normalmente, sob o modo de poupador de contas, 500 contas são lidas antes de desligar. Os dados podem ser apagados e as contas releituras.
    6. Uma vez concluída a leitura, verifique se há picos únicos limpos para os 5 parâmetros, bem como os valores cv. O Coeficiente de Variância (CV) deve ser <15%. Além disso, certifique-se de que os valores de CV para os três canais fluorescentes diferentes estão próximos um do outro.
    7. Faça um registro da verificação do QC: na guia Arquivo, clique em Salvar como imagem da tela.
  4. Limpeza e desligamento
    1. Use um vácuo para remover a amostra do copo de amostra e repita a seção 4.1.4.
    2. Coloque ~3-5 mL de água desionizada em 'copo' de coleta e clique em Adquirir, deixe correr por ~ 30 s, e depois clique em Abort. Deixe um pouco de água destilada para trás no copo de amostra.
    3. Esvazie o copo de recuperação da amostra e a garrafa de lixo.
    4. Desligue o software. Na guia Arquivo, clique em Sair. No menu pop-up, clique em Desligar sem purgar.
    5. Desligue o laser, desligue o instrumento e desligue o compressor de ar. Feche a escotilha para cobrir o instrumento.

7. Ensaios fisiológicos para medir a sensibilidade ao estresse em C. elegans

  1. Medição da sensibilidade ao estresse do ER usando exposição à tnicamicina
    1. Prepare as placas NGM RNAi DMSO vistas com bactérias RNAi visando o gene de interesse como na seção 3. Use bactérias HT115 mesmo em experimentos que não envolvam knockdown RNAi (ver Seção 1). Lembre-se também de semear placas NGM RNAi TM (ver Tabela 1). Semeie uma quantidade suficiente de placas: planeje para ~5-7 conjuntos de placas NGM RNAi DMSO e ~2-3 conjuntos de placas NGM RNAi TM.
    2. Sincronizar animais de escolha usando métodos descritos na seção 2.
    3. Ovos de placa em placas NGM RNAi DMSO semeadas de escolha utilizando critérios recomendados na Tabela 2. Certifique-se de preparar 2x o número de placas necessárias, pois metade da amostra será transferida para as placas NGM RNAi TM.
    4. Incubar ovos a 20 °C por aproximadamente 3-4 dias (~65-96 h) até o primeiro dia da idade adulta.
    5. No primeiro dia, prepare a vida útil transferindo animais para placas separadas. Para conservar placas (como os custos de MT são altos), utilize 8 placas de 15 animais por condição, totalizando 120 animais por condição. Isso permite um número gerenciável de animais por prato para pontuação e permite uma quantidade suficiente de animais para análises estatísticas, mesmo com alguma censura.
    6. Durante os primeiros 5-7 dias, mova animais adultos para longe da descendência todos os dias para um novo prato até que a prole não esteja mais visível. Durante esta etapa, censuraanimais ensacados, exibem saliências/explosões vulvais ou rastejam pelos lados das placas, pois não são mortes associadas à sensibilidade ao estresse er. Note-se que o tratamento de MT causa a detenção em animais e, portanto, apenas 1-2 movimentos desses animais a cada 2-3 dias é suficiente para minimizar os custos associados à produção de placas contendo TM. Animais do tipo selvagem têm uma sobrevivência média de ~15-17 dias no DMSO e 12-14 dias em tunicamcyin.
    7. Depois que os animais pararam de produzir descendentes, a pontuação dura a cada 1-2 dias até que todos os animais sejam marcados como mortos ou censurados. TM-tratar animais todos os dias durante o dia 6-14 da idade adulta para maior resolução.
  2. Medição da sensibilidade ao estresse mitocondrial e oxidativo usando exposição ao paraquat
    1. Preparar placas avistadas com bactérias RNAi visando o gene de interesse como na seção 3. Use bactérias HT115 mesmo em experimentos que não envolvam knockdown RNAi (ver Introdução).
    2. Sincronizar animais de escolha usando métodos descritos na seção 2.
    3. Ovos de placa em placas NGM RNAi de escolha utilizando critérios recomendados na Tabela 1. O ensaio exige ~60-100 animais por condição, então prepare-se de acordo.
    4. Incubar ovos a 20 °C por aproximadamente 3-4 dias (~65-96 h) até o primeiro dia da idade adulta.
    5. Prepare um frasco fresco de 100 mM de paraquat na solução M9.
    6. Pipeta 50-75 μL de M9+paraquat em tantos poços de uma placa de 96 poços de fundo plano como desejado. Geralmente é recomendado ter ~8-10 poços por condição contendo ~8-10 animais por poço. Isso permite um número facilmente visível de animais por poço com ~80 animais por cepa.
    7. Escolha 8-10 animais por condição e transfira-os para cada poço contendo M9+paraquat. Use uma picareta para transferir animais para os poços em vez de pipetting para evitar diferenças de volume e mudanças não intencionais nas concentrações de paraquat.
    8. A cada 2h, pontuação para morte de animais em cada poço. Bata suavemente nas placas, o que fará com que os animais vivos batam ou dobrem. Note que é possível que animais vivos às vezes sejam paralisados tempo suficiente para serem marcados como mortos. Portanto, se o número de animais vivos exceder o número de animais vivos de um ponto de tempo anterior, é provável que o animal estivesse vivo e não fosse pontuado (por exemplo, se na hora 4, 2/10 animais são pontuados como mortos, e na hora 6, apenas 1/10 animais estão mortos, a hora 4 deve ser remarcada como 1/10 animais mortos).
  3. Medição da sensibilidade ao calor usando exposição a temperaturas elevadas
    1. Preparar placas avistadas com bactérias RNAi visando o gene de interesse como na seção 3. Use bactérias HT115 mesmo em experimentos que não envolvam knockdown RNAi (ver Seção 1).
    2. Sincronizar animais de escolha usando métodos descritos na seção 2.
    3. Ovos de placa em placas semeadas de escolha utilizando critérios recomendados na Tabela 1. Tenha 60-100 animais por condição para ensaios de termotolerância. Para ensaios de termotolerância, use ensaios de apreensão de L1 ou lay de ovos para a melhor sincronização, pois há grande variabilidade com base na idade dos animais no ensaio.
    4. Incubar animais a 20 °C por aproximadamente 3-4 dias (~65-96 h) para realizar experimentos no primeiro dia da idade adulta. Não plante vermes a 15 °C para experimentos de choque térmico, pois há uma pequena diferença entre os animais que experimentam choque térmico de 15 °C versus 20 °C.
    5. No primeiro dia, prepare os animais transferindo-os para placas separadas. É geralmente recomendado ter ~10-15 animais por prato com 4-6 placas, para um total de 60 animais. Isso permite um número gerenciável de animais por placa para pontuação e permite um tempo mínimo para que os animais sejam retirados de temperaturas elevadas.
    6. Coloque os animais em uma incubadora de 37 °C e marque a cada 2 h. Comece a pontuar para termotolerância a 37 °C na hora 5, pois pouco ou nenhuma morte ocorre antes de 5 horas. A termotolerância mediana é realizada em ~9 horas, então as horas 7, 9 e 11 são pontos de tempo críticos, embora devido à incubadora e variabilidade laboratório-laboratório, isso pode precisar ser titulado por laboratório. Além disso, quaisquer métodos para diminuir a variabilidade ajudarão (por exemplo, não empilhar placas, colocar placas na mesma área dentro de uma única incubadora, minimizando o tempo de abertura ou fechamento da incubadora, tirando como poucas placas da incubadora de cada vez para minimizar o tempo que os animais passam fora de 37 °C, etc. Para obter um guia completo, consulte21).
    7. Como alternativa ao passo 7.3.6, coloque os animais a 34 °C em vez de 37 °C. A termotolerância mediana a 34 °C é de pouco mais de 14 h, portanto os pontos de tempo 12, 14 e 16 são críticos para ensaios de termotolerância de 34 °C.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Usando repórteres transcritores para medir a ativação de respostas ao estresse
Aqui, são utilizados repórteres transcricionais fluorescentes, que servem como ferramentas robustas para medir a ativação da maioria das respostas ao estresse em C. elegans. A expressão GFP é conduzida sob o promotor de alvos canônicos de reguladores transcritores mestres envolvidos na resposta a tensões específicas do compartimento. Uma lista abrangente de repórteres transcricionis...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Aqui, são descritos métodos para interrogar respostas de estresse celular em C. elegans,usando repórteres transcritores fluorescentes e ensaios de sobrevivência do estresse fisiológico. Todos os repórteres utilizam a expressão GFP conduzida sob o promotor de um alvo transcricional a jusante dos fatores de transcrição envolvidos na montagem das respostas ao estresse celular. O uso de hsp-4p::GFP modulado por XBP-1s mediado UPRER, hsp-6p::GFP controlado por ATFS-1 mediado UPRMT

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

R.BZ. é apoiado pela bolsa de longo prazo EMBO e a Fundação Larry L. Hillblom. O R.H.S é apoiado pela bolsa 5F32AG032023-02 através do Instituto Nacional de Envelhecimento (NIA) e da Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship. A A.F. é apoiada pelo subsídio F32AG051355 através da NIA. H.K.G. é apoiado pela bolsa DGE1752814 através do National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. M.G.M. é suportado por 1F31AG060660-01 através da NIA. A.D. é apoiado pela Fundação Thomas e Stacey Siebel, o Howard Hughes Medical Institute, e 4R01AG042679-04 e 5R01AG055891-02 da NIA, e 5R01ES021667-09 da NIEHS. Agradecemos a Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet e Anel Esquivel por assistência técnica significativa. Agradecemos ao laboratório morimoto e ao CGC (financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) por tensões.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Antimicina ASigma-AldrichA8674para o stress mitocondrial
Bacto PeptoneFisher ScientificDF0118072para placas NGM
Ágar granulado BD DifcoVWR90000-782para placas NGM
Cloreto de cálcio di-hidratadoVWR97061-904para placas NGM
CarbenicilinaBioPioneerC0051-25para RNAi
ColesterolSigma-Aldrich57-88-5para placas NGM COPAS
BiosorterUnion Biometrica350-5000-000equipado com uma fonte de luz de 488 nm.
Solução de limpeza COPASUnion Biometrica300-5072-000para usar com COPAS
Solução de bainhaCOPAS Union Biometrica300-5070-100para usar com COPAS
DMSOSigma-Aldrich472301 solvente para medicamentos
IPTG livre de dioxanoDenville ScientificCI8280-4para RNAi
LB Caldo MillerFisher ScientificBP1426500para
estereoscópio LB M205FAA Leica10450040equipada com uma câmera CCD monocromática Leica DFC3000G, filtro Leica GFP padrão (ex 395-455, EM 480 LP) e software LAS X
Sulfato de magnésio heptahidratadoVWREM-MX0070-3para placas NGM, M9
ParaquatSigma-Aldrich36541para estresse oxidativo/mitocondrial
Cloreto de potássioFisherP217-500para solução de lixívia
Fosfato de potássio dibásicoVWREM-PX1570-2para placas NGM
Fosfato de potássio monobásicoVWREM-PX1565-5para M9
RevolveECHO75990-514equipado com uma lente objetiva Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13, filtro Olympus FITC padrão (ex 470/40; em 525/50; DM 560) e um iPad Pro para câmera e para acionar o software ECHO
Azida de sódioSigma-Aldrich71289-50Gpara imagens
de cloreto de sódioEMD MilliporeSX0420-5para placas NGM, M9
Fosfato de sódio dibásicoVWR71003-472para M9
Hidroperóxido de terc-butilaSigma-Aldrich458139para estresse
oxidativoCloridrato de tetraciclinaSigma-AldrichT7660-5Gpara RNAi
TunicamicinaSigma-AldrichT7765-50MGpara estresse ER

Referências

  1. Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A Futile Battle? Protein Quality Control and the Stress of Aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
  2. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  3. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).
  4. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  5. Reinke, S. N., Hu, X., Sykes, B. D., Lemire, B. D. Caenorhabditis elegans diet significantly affects metabolic profile, mitochondrial DNA levels, lifespan and brood size. Molecular Genetics and Metabolism. 100 (3), 274-282 (2010).
  6. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 15 (3), e1008011(2019).
  7. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  8. Yoneda, T., Benedetti, C., Urano, F., Clark, S. G., Harding, H. P., Ron, D. Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones. Journal of Cell Science. 117 (Pt 18), 4055-4066 (2004).
  9. Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene. Cell Stress & Chaperones. 4 (4), 235-242 (1999).
  10. Heifetz, A., Keenan, R. W., Elbein, A. D. Mechanism of action of tunicamycin on the UDP-GlcNAc:dolichyl-phosphate Glc-NAc-1-phosphate transferase. Biochemistry. 18 (11), 2186-2192 (1979).
  11. Struwe, W. B., Hughes, B. L., Osborn, D. W., Boudreau, E. D., Shaw, K. M. D., Warren, C. E. Modeling a congenital disorder of glycosylation type I in C. elegans: a genome-wide RNAi screen for N-glycosylation-dependent loci. Glycobiology. 19 (12), 1554-1562 (2009).
  12. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 is a cell-nonautonomous regulator of stress resistance and longevity. Cell. 153 (7), 1435-1447 (2013).
  13. Castello, P. R., Drechsel, D. A., Patel, M. Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14186-14193 (2007).
  14. Oberley, L. W., Buettner, G. R. Role of Superoxide Dismutase in Cancer: A Review. Cancer Research. 39 (4), 1141-1149 (1979).
  15. Senchuk, M. M., Dues, D. J., Van Raamsdonk, J. M. Measuring Oxidative Stress in Caenorhabditis elegans: Paraquat and Juglone Sensitivity Assays. Bio-protocol. 7 (1), (2017).
  16. Lithgow, G. J., White, T. M., Hinerfeld, D. A., Johnson, T. E. Thermotolerance of a long-lived mutant of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (6), B270-B276 (1994).
  17. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The Biology of Proteostasis in Aging and Disease. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 435-464 (2015).
  18. Park, H. E. H., Jung, Y., Lee, S. J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
  19. Waggoner, L. E., Hardaker, L. A., Golik, S., Schafer, W. R. Effect of a Neuropeptide Gene on Behavioral States in Caenorhabditis elegans Egg-Laying. Genetics. 154 (3), 1181-1192 (2000).
  20. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144 (1), 79-91 (2011).
  21. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological Considerations for Heat Shock of the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods (San Diego, Calif). 68 (3), 450-457 (2014).
  22. Shen, X., Ellis, R. E., Sakaki, K., Kaufman, R. J. Genetic interactions due to constitutive and inducible gene regulation mediated by the unfolded protein response in C. elegans. PLoS genetics. 1 (3), e37(2005).
  23. Frakes, A. E., Dillin, A. The UPR(ER): Sensor and Coordinator of Organismal Homeostasis. Molecular Cell. 66 (6), 761-771 (2017).
  24. Martinus, R. D., et al. Selective induction of mitochondrial chaperones in response to loss of the mitochondrial genome. European Journal of Biochemistry. 240 (1), 98-103 (1996).
  25. Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science (New York, N.Y). 337 (6094), 587-590 (2012).
  26. Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial protein quality control during biogenesis and aging. Trends in Biochemical Sciences. 36 (5), 254-261 (2011).
  27. Shore, D. E., Carr, C. E., Ruvkun, G. Induction of Cytoprotective Pathways Is Central to the Extension of Lifespan Conferred by Multiple Longevity Pathways. PLOS Genetics. 8 (7), e1002792(2012).
  28. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  29. Chiang, S. M., Schellhorn, H. E. Regulators of oxidative stress response genes in Escherichia coli and their functional conservation in bacteria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 525 (2), 161-169 (2012).
  30. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88 (Pt B), 290-301 (2015).
  31. Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 284 (20), 13291-13295 (2009).
  32. Lo, J. Y., Spatola, B. N., Curran, S. P. WDR23 regulates NRF2 independently of KEAP1. PLOS Genetics. 13 (4), e1006762(2017).
  33. Link, C., Johnson, C. Reporter Transgenes for Study of Oxidant Stress in Caenorhabditis elegans. Methods in enzymology. 353, 497-505 (2002).
  34. Choe, K. P., Przybysz, A. J., Strange, K. The WD40 Repeat Protein WDR-23 Functions with the CUL4/DDB1 Ubiquitin Ligase To Regulate Nuclear Abundance and Activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2704-2715 (2009).
  35. Velazquez, J. M., Lindquist, S. hsp70: nuclear concentration during environmental stress and cytoplasmic storage during recovery. Cell. 36 (3), 655-662 (1984).
  36. Tissières, A., Mitchell, H. K., Tracy, U. M. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. Journal of Molecular Biology. 84 (3), 389-398 (1974).
  37. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
  38. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS genetics. 9 (4), e1003466(2013).
  39. Hentze, N., Le Breton, L., Wiesner, J., Kempf, G., Mayer, M. P. Molecular mechanism of thermosensory function of human heat shock transcription factor Hsf1. eLife. 5, (2016).
  40. Li, J., Labbadia, J., Morimoto, R. I. Rethinking HSF1 in Stress, Development, and Organismal Health. Trends in Cell Biology. , (2017).
  41. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  42. Senchuk, M. M., et al. Activation of DAF-16/FOXO by reactive oxygen species contributes to longevity in long-lived mitochondrial mutants in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 14 (3), (2018).
  43. Henderson, S. T., Bonafè, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
  44. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the Cellular Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans by Thermosensory Neurons. Science. 320 (5877), 811-814 (2008).
  45. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  46. Shivers, R. P., Kooistra, T., Chu, S. W., Pagano, D. J., Kim, D. H. Tissue-specific activities of an immune signaling module regulate physiological responses to pathogenic and nutritional bacteria in C. elegans. Cell Host & Microbe. 6 (4), 321-330 (2009).
  47. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), (2018).
  48. Glover-Cutter, K. M., Lin, S., Blackwell, T. K. Integration of the Unfolded Protein and Oxidative Stress Responses through SKN-1/Nrf. PLOS Genetics. 9 (9), e1003701(2013).
  49. Liu, Y., Chang, A. Heat shock response relieves ER stress. The EMBO journal. 27 (7), 1049-1059 (2008).
  50. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The Caenorhabditis elegans Lifespan Machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  51. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of Oxidative Stress: Mitochondrial Function Using the Seahorse System. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1710, 285-293 (2018).
  52. Morton, E. A., Lamitina, T. Caenorhabditis elegans HSF-1 is an essential nuclear protein that forms stress granule-like structures following heat shock. Aging Cell. 12 (1), 112-120 (2013).
  53. Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13 (4), 467-480 (2007).
  54. Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
  55. An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
  56. Daniele, J. R., Esping, D. J., Garcia, G., Parsons, L. S., Arriaga, E. A., Dillin, A. High-Throughput Characterization of Region-Specific Mitochondrial Function and Morphology. Scientific Reports. 7 (1), 6749(2017).
  57. Daniele, J. R., et al. A non-canonical arm of UPRER mediates longevity through ER remodeling and lipophagy. bioRxiv. , 471177(2018).
  58. Xu, N., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 895-911 (2012).
  59. Baird, N. A., et al. HSF-1-mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance and life span. Science (New York, N.Y.). 346 (6207), 360-363 (2014).
  60. Higuchi-Sanabria, R., et al. Spatial regulation of the actin cytoskeleton by HSF-1 during aging. Molecular Biology of the Cell. 29 (21), 2522-2527 (2018).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Resposta ao Estresse em C. elegansResposta ao Choque TérmicoResposta a Proteínas Não DobradasResposta ao Estresse OxidativoRepórteres Transcricionais FluorescentesAnálise por Citometria de FluxoEnsaio de Sensibilidade ao ParaquatEnsaio de Sobrevivência por TermotolerânciaKnockdown de XBP-1Knockdown de DAF-2
Medições de Respostas de Estresse Fisiológico em C. Elegans
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.