Aqui, caracterizamos as respostas de estresse proteotóxico celular no nematoide C. elegans medindo a ativação de repórteres transcritores fluorescentes e atribuindo sensibilidade ao estresse fisiológico.
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Artigo de método
Medições de Respostas de Estresse Fisiológico em C. Elegans
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Organismos são frequentemente expostos a ambientes flutuantes e mudanças na homeostase intracelular, que podem ter efeitos prejudiciais em seu proteome e fisiologia. Assim, os organismos evoluíram respostas de estresse direcionadas e específicas dedicadas a reparar danos e manter a homeostase. Esses mecanismos incluem a resposta proteica desdobrada do retículo endoplasmático (UPRER),a resposta proteica desdobrada das mitocôndrias (UPRMT),a resposta ao choque térmico (HSR) e a resposta ao estresse oxidativo (OxSR). Os protocolos aqui apresentados descrevem métodos para detectar e caracterizar a ativação dessas vias e suas consequências fisiológicas no nematoide, C. elegans. Em primeiro lugar, o uso de repórteres transcritores fluorescentes específicos da via é descrito para caracterização celular rápida, triagem de drogas ou triagem genética em larga escala (por exemplo, RNAi ou bibliotecas mutantes). Além disso, são descritos ensaios fisiológicos complementares e robustos, que podem ser utilizados para avaliar diretamente a sensibilidade dos animais a estressores específicos, servindo como validação funcional dos repórteres transcritores. Juntos, esses métodos permitem a rápida caracterização dos efeitos celulares e fisiológicos das perturbações proteotóxicas internas e externas.
Introdução
A capacidade de um organismo de responder a mudanças no ambiente intra e extracelular é crucial para sua sobrevivência e adaptação. Isso é feito em nível celular através de numerosas vias de proteção que garantem a integridade da célula. Embora numerosos componentes celulares estejam sujeitos a danos associados ao estresse, um grande envolvimento das respostas ao estresse celular é reparar e proteger a homeostase do proteome celular. No entanto, a compartimentação de proteínas em estruturas especiais, chamadas organelas, representa um desafio para a célula, pois não pode contar com uma forma centralizada de controle de qualidade proteica para garantir que todas as pro....
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Protocolo
1. Condições padrão de crescimento das temperaturas e OP50 vs HT115
- Crescimento e expansão padrão
- Cultivar uma cultura de OP50 em LB(Tabela 1) ou mídia equivalente de escolha para 24-48 h à temperatura ambiente (~22-25 °C). Cultivar bactérias à temperatura ambiente como OP50 é um auxotroph uracil e há uma maior incidência de revertantes (por exemplo, mutantes supressores) quando cultivados a 37 °C. O armazenamento a longo prazo das culturas OP50 não é recomendado (máx 1 semana a 4 °C).
- Semeie um volume de ~100-200 μL de cultura OP50 saturada em uma placa NGM de 60 mm(Tabela 1)para manutenção de vermes e 1 ....
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Resultados
Usando repórteres transcritores para medir a ativação de respostas ao estresse
Aqui, são utilizados repórteres transcricionais fluorescentes, que servem como ferramentas robustas para medir a ativação da maioria das respostas ao estresse em C. elegans. A expressão GFP é conduzida sob o promotor de alvos canônicos de reguladores transcritores mestres envolvidos na resposta a tensões específicas do compartimento. Uma lista abrangente de repórteres transcricionis.......
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Discussão
Aqui, são descritos métodos para interrogar respostas de estresse celular em C. elegans,usando repórteres transcritores fluorescentes e ensaios de sobrevivência do estresse fisiológico. Todos os repórteres utilizam a expressão GFP conduzida sob o promotor de um alvo transcricional a jusante dos fatores de transcrição envolvidos na montagem das respostas ao estresse celular. O uso de hsp-4p::GFP modulado por XBP-1s mediado UPRER, hsp-6p::GFP controlado por ATFS-1 mediado UPRMT
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
R.BZ. é apoiado pela bolsa de longo prazo EMBO e a Fundação Larry L. Hillblom. O R.H.S é apoiado pela bolsa 5F32AG032023-02 através do Instituto Nacional de Envelhecimento (NIA) e da Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship. A A.F. é apoiada pelo subsídio F32AG051355 através da NIA. H.K.G. é apoiado pela bolsa DGE1752814 através do National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. M.G.M. é suportado por 1F31AG060660-01 através da NIA. A.D. é apoiado pela Fundação Thomas e Stacey Siebel, o Howard Hughes Medical Institute, e 4R01AG042679-04 e 5R01AG055891-02 da NIA, e 5R01ES021667-09 da NIEHS. Agradecemos a Larry Joe, Melissa Sanchez....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Antimicina A | Sigma-Aldrich | A8674 | para o stress mitocondrial |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118072 | para placas NGM |
| Ágar granulado BD Difco | VWR | 90000-782 | para placas NGM |
| Cloreto de cálcio di-hidratado | VWR | 97061-904 | para placas NGM |
| Carbenicilina | BioPioneer | C0051-25 | para RNAi |
| Colesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | para placas NGM COPAS |
| Biosorter | Union Biometrica | 350-5000-000 | equipado com uma fonte de luz de 488 nm. |
| Solução de limpeza COPAS | Union Biometrica | 300-5072-000 | para usar com COPAS |
| Solução de bainha | COPAS Union Biometrica | 300-5070-100 | para usar com COPAS |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 solvente para medicamentos | |
| IPTG livre de dioxano | Denville Scientific | CI8280-4 | para RNAi |
| LB Caldo Miller | Fisher Scientific | BP1426500 | para |
| estereoscópio LB M205FA | A Leica | 10450040 | equipada com uma câmera CCD monocromática Leica DFC3000G, filtro Leica GFP padrão (ex 395-455, EM 480 LP) e software LAS X |
| Sulfato de magnésio heptahidratado | VWR | EM-MX0070-3 | para placas NGM, M9 |
| Paraquat | Sigma-Aldrich | 36541 | para estresse oxidativo/mitocondrial |
| Cloreto de potássio | Fisher | P217-500 | para solução de lixívia |
| Fosfato de potássio dibásico | VWR | EM-PX1570-2 | para placas NGM |
| Fosfato de potássio monobásico | VWR | EM-PX1565-5 | para M9 |
| Revolve | ECHO | 75990-514 | equipado com uma lente objetiva Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13, filtro Olympus FITC padrão (ex 470/40; em 525/50; DM 560) e um iPad Pro para câmera e para acionar o software ECHO |
| Azida de sódio | Sigma-Aldrich | 71289-50G | para imagens |
| de cloreto de sódio | EMD Millipore | SX0420-5 | para placas NGM, M9 |
| Fosfato de sódio dibásico | VWR | 71003-472 | para M9 |
| Hidroperóxido de terc-butila | Sigma-Aldrich | 458139 | para estresse |
| oxidativoCloridrato de tetraciclina | Sigma-Aldrich | T7660-5G | para RNAi |
| Tunicamicina | Sigma-Aldrich | T7765-50MG | para estresse ER |
Referências
- Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A Futile Battle? Protein Quality Control and the Stress of Aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
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Reimpressões e permissões
Etiquetas
Resposta ao Estresse em C. elegansResposta ao Choque TérmicoResposta a Proteínas Não DobradasResposta ao Estresse OxidativoRepórteres Transcricionais FluorescentesAnálise por Citometria de FluxoEnsaio de Sensibilidade ao ParaquatEnsaio de Sobrevivência por TermotolerânciaKnockdown de XBP-1Knockdown de DAF-2
