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Caracterização de estruturas amilóides em Envelhecimento C. Elegans usando imagem de fluorescência ao longo da vida

DOI:

10.3791/61004

⸱

March 27th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund Berlin, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Molecular Neuroscience Group, Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge, 4Cell Biology, University of Bremen

In This Article

Summary

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A fluorescência de imagens ao longo da vida monitora, quantifica e distingue as tendências de agregação de proteínas em modelos de doença susturais de C. elegans vivos, envelhecidos e estressados.

Abstract

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Fibrilas amilóides estão associadas a uma série de doenças neurodegenerativas, como Huntington, Parkinson ou Doença de Alzheimer. Essas fibrilas amilóides podem sequestrar proteínas metastáveis endógenas, bem como componentes da rede de proteotase (PN) e, assim, exacerbar a proteína dobrável na célula. Há um número limitado de ferramentas disponíveis para avaliar o processo de agregação de proteínas amilóides dentro de um animal. Apresentamos um protocolo de microscopia vitalícia de fluorescência (FLIM) que permite o monitoramento, bem como a quantificação da fibrilização amiloide em células específicas, como neurônios, de forma não invasiva e com a progressão do envelhecimento e após perturbação de o PN. FLIM é independente dos níveis de expressão do flúor e permite uma análise do processo de agregação sem qualquer maior coloração ou branqueamento. Fluoróforos são extintos quando estão próximos de estruturas amilóides, o que resulta em uma diminuição da vida útil da fluorescência. A saciedade correlaciona-se diretamente com a agregação da proteína amilóide. FLIM é uma técnica versátil que pode ser aplicada para comparar o processo de fibrilização de diferentes proteínas amilóides, estímulos ambientais ou origens genéticas in vivo de forma não invasiva.

Introduction

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A agregação proteica ocorre tanto no envelhecimento quanto na doença. Os caminhos que levam à formação e deposição de grandes amilóides ou inclusões amorfas são difíceis de seguir e seus cinéticos são igualmente desafiadores para desvendar. As proteínas podem se desdobrar devido a mutações intrínsecas dentro de suas sequências de codificação, como no caso de doenças genéticas. As proteínas também se desdobram porque a rede de proteota (PN) que as mantém solúveis e devidamente dobradas é prejudicada, como acontece durante o envelhecimento. A PN inclui acompanhantes moleculares e máquinas de degradação e é responsável pela biogênese, dobramento, tráfico e degradação de ....

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Protocol

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1. Sincronização de C. elegans

  1. Sincronize C. elegans através do tratamento da solução de hipoclorito alcalino ou através de um simples ovo por 4 h a 20 °C8.
  2. Cultivar e manter nematóides a 20 °C em placas médias de crescimento de nematóides (NGM) semeadas com OP50 E. coli de acordo com os procedimentos padrão9. Idade dos nematóides até o estágio ou dia de desenvolvimento desejado.
    NOTA: Neste protocolo, adultos jovens são imagem no dia 4 e nematóides velhos são imagem no 8º dia de vida.

2. R. RMS mediado por maquinaria de acompanhante atravé....

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Results

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O protocolo mostra como monitorar com precisão a formação de espécies agregadas em C. elegansvivos, tanto durante seu envelhecimento natural quanto quando submetidos ao estresse. Selecionamos quatro cepas diferentes de nematóides transgênicos que expressam proteínas de poliglutamina de repetições de 40T, 44T ou 85Q. Essas proteínas são sintetizadas em diferentes tecidos e foram fundidas a diferentes floróforos. As cepas C. elegans expressaram Q40-mRFP nos músculos da par.......

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Discussion

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O protocolo aqui apresentado descreve uma técnica baseada em microscopia para identificar espécies agregadas no sistema modelo C. elegans. FLIM pode caracterizar com precisão a presença de espécies agregadas e solúveis fundidas a um fluoróforo através da medição de suas decaidas ao longo da vida de fluorescência. Quando uma proteína de fusão começar a agregar sua vida média registrada passará de um valor mais alto para um valor mais baixo16. A propensão da agregação pode então ser deduzid.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgements

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A cepa músculo-Q40-mRFP fornecida pelo CGC, que é financiada pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). O neuronal-Q40-CFP foi um presente gentil do Laboratório Morimoto. Reconhecemos o DFG (KI-1988/5-1 para JK, a bolsa de doutorado NeuroCure pelo Cluster de Excelência neurocure para MLP), a EMBO (bolsa de curto prazo para a MLP) e a Companhia de Biólogos (bolsas de viagem para CG e MLP) para financiamento. Também reconhecemos a instalação de imagens de microscopia avançada de luz no Centro Max Delbrück de Medicina Molecular, Berlim, por fornecer a configuração para a imagem que o YFP constrói.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ágar-Ágar Kobe ICarl Roth GmbH + Co. KG5210.2NGM componente
Ahringer Library hsp-1 siRNAFonte BioScience UK LimitedF26D10.3
AmpicilinaCarl Roth GmbH + Co. KGK029.3Antibiótico
B& H DCS-120 SPC-150Becker & Hickl GmbHFLIM Software de aquisição
B& H SPC830-SPC ImagemBecker & Hickl GmbHFLIM Software de aquisição
BD Bacto PeptoneBD-Bionsciences211677componente NGM
C. elegans iQ44-YFPCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OG412
C. elegans iQ85-YFPGentil presente do Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFPPresente gentil do Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFPGentil presente do Morimoto
Lab Deckglä ser-18x18mmCarl Roth GmbH + Co. KG0657.2Lamínulas
Isopropil-β-D-tiogalactopiranoside (IPTG)Carl Roth GmbH + Co. KG2316.4
Leica M165 FCLeica Camera AGEstereomicroscópio de Montagem
Leica TCS SP5Leica Camera AGMicroscópio Confocal
Cloridrato de LevamisolAppliChem GmbHA4341Anestésico
OP50 Escherichia coliCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)50
PicoQuant PicoHarp300 PicoQuantGmbHFLIM Software de aquisição
Azida de sódioCarl Roth GmbH + Co. KGK305.1anestésico
Carl Roth GmbH + Co. KG3957.2NGM componente
Standard-Objektträ gerCarl Roth GmbH + Co. KG0656.1Corrediças de vidro
Universal AgaroseBio & Vender GmbHBS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1Carl Zeiss AGMicroscópio Confocal
Zeiss LSM510-Meta NLOCarl Zeiss AGMicroscópio Confocal
Cloreto de sódio

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
  2. Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Bio....

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Fluorescence Lifetime ImagingAmyloid FibrilizationC Elegans ModelProtein Aggregation AnalysisNoninvasive MonitoringFLIM AcquisitionLifetime MeasurementPhoton DetectionAgarose Pad PreparationNeurodegenerative Disease Study

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