Descrevemos uma injeção intracisternal que emprega uma agulha dobrada na ponta que pode ser estabilizada no crânio, eliminando assim o risco de dano ao parênquima subjacente. A abordagem pode ser usada para mapeamento do destino genético e manipulações de células leptomeningeais e para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano.
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Artigo de método
Indução da Modificação das Células Leptomenínias via Injeção Intracisternal
Neste artigo
Resumo
Resumo
O protocolo aqui descrito descreve como injetar soluções com segurança e manualmente através da cisterna magna, eliminando o risco de danos ao parnchyma subjacente. Protocolos publicados anteriormente recomendam o uso de agulhas retas que devem ser reduzidas a um máximo de 1-2 mm da superfície dural. A queda repentina da resistência uma vez perfurada a membrana dural dificulta a manutenção da agulha em posição constante. Nosso método, em vez disso, emprega uma agulha dobrada na ponta que pode ser estabilizada contra o osso occipital do crânio, impedindo assim que a seringa penetre no tecido após perfuração da membrana dural. O procedimento é simples, reproduzível e não causa desconforto duradouro nos animais operados. Descrevemos a estratégia de injeção intracisternal no contexto do mapeamento do destino genético das células leptomenínias vasculares. A mesma técnica pode, além disso, ser utilizada para abordar uma ampla gama de questões de pesquisa, como sondar o papel das leptomeninges no neurodesenvolvimento e a disseminação da meningite bacteriana, através da ablação genética de genes putativamente implicados nesses fenômenos. Além disso, o procedimento pode ser combinado com um sistema de infusão automatizado para uma entrega constante e usado para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano através da injeção de moléculas rotuladas fluorescentes.
Introdução
As células leptomeningeais são uma população de células semelhantes ao fibroblasto organizadas em uma camada fina sobrepondo o cérebro e expressando genes implicados na crosslinking de colágeno (por exemplo, Dcn e Lum),e no estabelecimento de uma barreira cérebro-meningeal (por exemplo, Cldn11)1,2. As células leptomenínias estão implicadas em uma ampla gama de funções fisiológicas, desde o controle rigoroso sobre a drenagem do fluido cefalorraquidiano3 até a orientação de progenitores neurais no cérebro em desenvolvimento4,
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Protocolo
Os procedimentos cirúrgicos apresentados foram aprovados pela Estocolmo Norra Djurförsöksetiska Nämnd e realizados de acordo com as especificações fornecidas pelo instituto de pesquisa (Instituto Karolinska, Suécia).
NOTA: A injeção intracisternal pode ser adaptada de forma flexível para múltiplos fins de pesquisa. Apresentamos abaixo um procedimento desenvolvido para rotular eficientemente as células leptomeningeais para mapeamento do destino com base na injeção de endoxifen em uma linha de rato transgênica que transporta R26R-tdTomato12 e CreER, este último sob o promotor Cx3013
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Resultados
A injeção intracisternal de endoxidos em camundongos transgênicos que expressam CreER sob o promotor Cx3013 e um repórter fluorescente induível permite uma recombinação específica de células leptomenínias sem rotular a superfície de expressão cx30 e os astrócitos parêmicos no córtex(Figura 1). Para ter acesso à cisterna magna, o animal anestesiado é posicionado com seu corpo e sua cabeça em um ângulo de aproximadamente 120°, permitindo.......
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Discussão
O protocolo aqui descrito apresenta um procedimento simples e reprodutível para rotular células leptomeningeais para mapeamento do destino. Utilizamos injeção intracisternal de endoxifen, um metabólito ativo de Tamoxifen, para induzir a expressão do repórter fluorescente tdTomato em Cx30-CreER; Ratos R26R-tdTomato12,13.
Em comparação com outros protocolos usados para obter acesso ao fluido cefalorraquidiano através da cisterna magna
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Divulgações
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado por subsídios do Conselho Sueco de Pesquisa, da Sociedade Sueca de Câncer, da Fundação Sueca de Pesquisa Estratégica, de Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse e do Programa de Pesquisa Estratégica em Células-Tronco e Medicina Regenerativa do Instituto Karolinska (StratRegen).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Unidade de anestesia | Univentor 410 | 8323102 | Completo de vaporizador, câmara e tubulação que se conecta à câmara e ao suporte da cabeça do mouse |
| Anestesia (isoflurano) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofeno | Orion Pharma AB | 014920 | Nome comercial Cola |
| cianoacrilato | Carl Roth | 0258.1 | Use suturas de seda 5-0, em alternativa |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifeno | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Etanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Seringa Hamilton (agulha chanfrada de 30 G) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaína | Aspen Nordic | 520455 | |
| Suporte de cabeça de rato | Narishige International | SGM-4 | Com bocal para anestesia inalatória. Como alternativa, use uma estrutura estereotáxica |
| Tesoura | Ferramentas de Ciência Fina | 15009-08 | |
| Barbeador | Aesculap | GT420 | |
| Lanças de absorção estéreis | Ferramentas de Ciência Fina | 18105-01 | Cotonetes estéreis também são uma boa opção |
| Separador cirúrgico | Instrumento de Precisão Mundial | 501897 | |
| Pinças | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch& Lomb Nordic AB | 541760 |
Referências
- Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
- Whish, S., et al. The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to t....
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Reimpressões e permissões
