Name: Indução da Modificação das Células Leptomenínias via Injeção Intracisternal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Aprenda a técnica de injeção intracisternal com agulha curvada para edição genética específica de células leptomeníngeas em camundongos transgênicos. Este método minimiza danos aos tecidos neurais adjacentes e possibilita estudos precisos de neurodesenvolvimento e patologias meníngeas.

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Este estudo foi apoiado por subsídios do Conselho Sueco de Pesquisa, da Sociedade Sueca de Câncer, da Fundação Sueca de Pesquisa Estratégica, de Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse e do Programa de Pesquisa Estratégica em Células-Tronco e Medicina Regenerativa do Instituto Karolinska (StratRegen).

Os procedimentos cirúrgicos apresentados foram aprovados pela Estocolmo Norra Djurförsöksetiska Nämnd e realizados de acordo com as especificações fornecidas pelo instituto de pesquisa (Instituto Karolinska, Suécia).
NOTA: A injeção intracisternal pode ser adaptada de forma flexível para múltiplos fins de pesquisa. Apresentamos abaixo um procedimento desenvolvido para rotular eficientemente as células leptomeningeais para mapeamento do destino com base na injeção de endoxifen em uma linha de rato transgênica que transporta R26R-tdTomato12 e CreER, este último sob o promotor Cx3013. A rotulagem dessa população de células pode ser obtida através da injeção de construtos virais utilizando o mesmo procedimento descrito abaixo. Finalmente, esta abordagem pode ser empregada para rastrear o fluxo de fluido cefalorraquidiano, por infusão de rastreadores fluorescentes.
1. Preparação do Sistema de Injeção
NOTA: Recomendamos a realização do procedimento em uma sala cirúrgica adequada e em condições assépticas. As ferramentas cirúrgicas podem ser esterilizadas usando calor (autoclave, esterilizador de fibra de vidro) ou higienizadas usando um desinfetante químico de alto nível se forem sensíveis ao calor. Enxágüe os instrumentos antes de usar ao empregar desinfecção química ou permita-os esfriar quando higienizados com calor.
<ol><li>Com fórceps, dobre a agulha da seringa de injeção a 30° a 3 mm da ponta. NOTA: Use seringas Hamilton com uma agulha chanfrada de 30 G.</li>
	<li>Prepare 1 mg/mL de solução endoxifen, diluída em 10% DMSO e encha a seringa com a agulha dobrada. NOTA: Administrar 5 μL do composto para garantir a exposição generalizada de células meningeais no camundongo C57Bl/6j adulto (ca. 25-30 g), embora experimentos piloto que testem diferentes concentrações e volumes de injeção possam ser necessários no tratamento de animais de diferentes idades e cepas.</li>
	<li>Ajuste o suporte da cabeça do mouse de modo que o pedaço da boca esteja a aproximadamente 30° da superfície da mesa cirúrgica. NOTA: Um quadro estereotático com fixação de três pontos (ou seja, orelhas e boca) também pode ser usado para este procedimento. Neste caso, porém, o animal só será fixado com o pedaço da boca, enquanto as barras de ouvido podem ser estendidas sob os membros dianteiros do animal e ser usadas para apoiar o corpo do animal durante o procedimento.</li>
</ol>2. Indução da Anestesia
<ol><li>Para anestésicos injetáveis, utilize concentrações e modos de administração recomendados pela unidade veterinária da instituição local.</li>
	<li>Para anestésicos inalacionais, como isoflurano, prepare a unidade de administração de acordo com as especificações do fabricante.</li>
	<li>Com isoflurano, definir a concentração do composto em 4% para indução de anestesia.</li>
	<li>Entregar ar a uma taxa de 400 mL/min.</li>
	<li>Deixe a unidade de anestesia encher a câmara com o anestésico por alguns minutos e coloque o mouse na câmara depois. NOTA: Para os presentes experimentos, usamos camundongos transgênicos adultos (>2 meses e aproximadamente 30 g) masculinos e femininos que transportam Cx30-CreER e R26R-tdTomato, e criados em um fundo C57Bl/6j.</li>
	<li>Monitore o animal durante a indução da anestesia. O padrão de respiração deve diminuir quando o mouse estiver sob anestesia total.</li>
	<li>Retire o animal da câmara e verifique se há supressão do reflexo da pata apertando delicadamente as patas traseiras. NOTA: O reflexo ainda pode estar presente, mas atrasou alguns segundos. Se esse for o caso, coloque o animal de volta na câmara até que a supressão completa do reflexo da pata tenha sido alcançada.</li>
	<li>Administrar analgésico (por exemplo, Carprofeno, 5 mg/kg através de injeção subcutânea) para auxiliar o tratamento da dor pós-operatória.</li>
</ol>3. Posicionamento do Animal para o Procedimento
<ol><li>Fixar a cabeça do animal no porta-cabeças. Para melhorar a acessibilidade à cisterna magna, posicione o corpo do animal a aproximadamente 30° da superfície da mesa e da cabeça intitulada para baixo, para estabelecer um ângulo de 120° com o resto do corpo e estender a parte de trás do pescoço para facilitar o acesso à cisterna magna(Figura 1A).</li>
	<li>Adicione toalhas de papel por baixo do animal para apoiar seu corpo durante todo o procedimento.</li>
	<li>Segure a entrega de anestesia através do bocal e reduza a concentração de isoflurano para 2,5% e a entrega de ar para 200 ml/min.</li>
	<li>Aplique pomada oftálmica.</li>
</ol>4. Exposição da Cisterna Magna
<ol><li>Raspe a parte de trás do pescoço do animal e higienize a área com 70% de etanol e Betadine.</li>
	<li>Utilizando uma tesoura cirúrgica, realize uma incisão midline (cerca de 7 mm de comprimento) começando no nível do osso occipital e estendendo-o posteriormente.</li>
	<li>Separe suavemente os músculos conjuntivos superficiais e os músculos do pescoço puxando lateralmente da linha média com pinças de ponta finas. Isso exporá a membrana dural sobrepondo a cisterna magna, em forma de triângulo invertido.</li>
	<li>Use lanças de absorção estéreis ou cotonetes de algodão para controlar qualquer sangramento resultante.</li>
	<li>Posicione um pequeno separador cirúrgico para manter os músculos do pescoço puxados para fora e possibilitar a visualização da cisterna magna durante todo o procedimento.</li>
</ol>5. Injeção Intracisternal
<ol><li>Para ter acesso à cisterna magna, identifique a extremidade caudal do osso occipital e insira a agulha que antes estava dobrada imediatamente por baixo. NOTA: Haverá uma queda repentina na resistência à medida que a membrana dural for perfurada. No entanto, a ponta da agulha só penetrará ligeiramente sob a superfície meningeal, graças à sua forma enganchando.</li>
	<li>Uma vez perfurada a dura dura, permita que a ponta dobrada da agulha penetre sob a superfície dural puxando suavemente a seringa para cima e paralelamente ao corpo do animal, a fim de "enganchar" a agulha no crânio (ver Figura 1B). Isso garantirá uma melhor estabilidade e evitará que a agulha penetre mais fundo, evitando assim o risco de danificar o cerebelo subjacente ou a medula.</li>
	<li>Injete o composto lentamente para evitar interferência suspito do fluxo natural do fluido cefalorraquidiano. NOTA: Dependendo do propósito do experimento, a taxa de infusão pode variar. Se for necessária uma taxa de infusão lenta e constante (por exemplo, ao usar o procedimento para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano), pode ser aconselhável usar um sistema de microinfusão automatizado em combinação com a seringa.</li>
	<li>Após a injeção, deixe a agulha descansar no local por 1 min e remova-a cuidadosamente. Use fórceps de ponta fina para ajudar a retração da agulha de sua posição enganchando. NOTA: O uso de uma agulha fina (por exemplo, 30 G) não leva a danos substanciais da membrana meningeal, e consequente saída do fluido cefalorraquidiano. Se forem necessários tamanhos maiores de agulha, recomendamos parar o vazamento de fluido, aplicando pressão no local da injeção usando uma ponta de algodão estéril.</li>
</ol>6. Concluir o Procedimento e os Cuidados Pós-Operatórios
<ol><li>Remova o separador e deixe que os músculos voltem à sua posição original sobrepondo a membrana dural.</li>
	<li>Feche a incisão cutânea usando algumas gotas de adesivo cianoacrilato. NOTA: Alternativamente, utilize suturas absorvíveis (por exemplo, 5-0 suturas de vicril) e feche a incisão cutânea com pontos interrompidos.</li>
	<li>Aplique anestésico local (por exemplo, 100 μL de 5% de lidocaína) no local da incisão.</li>
	<li>Retire o animal do suporte e coloque em uma gaiola limpa posicionada sobre uma almofada de aquecimento. Monitore o animal até que ele recupere a consciência. NOTA: Não se espera que o procedimento cause dor ou angústia duradoura no animal. No entanto, o camundongo deve ser monitorado de perto durante os primeiros dias pós-operatórios e medidas de alívio da dor podem ser realizadas sempre que necessário, e de acordo com as recomendações fornecidas pela unidade veterinária de sua instituição.</li>
</ol>

<ol><li>Vanlandewijck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+atlas+of+cell+types+and+zonation+in+the+brain+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature.</a> Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).</li>
<li>Whish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inner+CSF-brain+barrier%3A+developmentally+controlled+access+to+the+brain+via+intercellular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 16(2015).</li>
<li>Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meninges+as+barriers+and+facilitators+for+the+movement+of+fluid%2C+cells+and+pathogens+related+to+the+rodent+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).</li>
<li>Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+morphogenic+signaling+initiated+by+the+meninges+controls+corpus+callosum+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation.</a> Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).</li>
<li>Siegenthaler, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+from+the+meninges+regulates+cortical+neuron+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation.</a> Cell. 139 (3), 597-609 (2009).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenic+Radial+Glia-like+Cells+in+Meninges+Migrate+and+Differentiate+into+Functionally+Integrated+Neurons+in+the+Neonatal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex.</a> Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).</li>
<li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces%3A+a+role+for+connexins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins?</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li>
<li>Ramos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisterna+Magna+Injection+in+Rats+to+Study+Glymphatic+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function.</a> Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).</li>
<li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li>
<li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes%2C+including+amyloid+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li>
<li>Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+journey+into+the+brain%3A+insight+into+how+bacterial+pathogens+cross+blood-brain+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+for+intersectional+targeting+of+neural+sensors+and+effectors+with+high+specificity+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance.</a> Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).</li>
<li>Slezak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+for+conditional+gene+manipulation+in+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells.</a> Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).</li>
<li>Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Neisseria+meningitidis+with+cells+of+the+human+meninges%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges.</a> Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).</li>
<li>Colicchio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meningococcal+ABC-Type+L-glutamate+transporter+GltT+is+necessary+for+the+development+of+experimental+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).</li>
<li>Ricci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+matrix+metalloproteinases+attenuates+brain+damage+in+experimental+meningococcal+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis.</a> BMC Infectious Diseases. 14, 726(2014).</li>
</ol>

Os autores não declaram interesses concorrentes.

O protocolo aqui descrito apresenta um procedimento simples e reprodutível para rotular células leptomeningeais para mapeamento do destino. Utilizamos injeção intracisternal de endoxifen, um metabólito ativo de Tamoxifen, para induzir a expressão do repórter fluorescente tdTomato em Cx30-CreER; Ratos R26R-tdTomato12,13.
Em comparação com outros protocolos usados para obter acesso ao fluido cefalorraquidiano através da cisterna magna<su...

As células leptomeningeais são uma população de células semelhantes ao fibroblasto organizadas em uma camada fina sobrepondo o cérebro e expressando genes implicados na crosslinking de colágeno (por exemplo, Dcn e Lum),e no estabelecimento de uma barreira cérebro-meningeal (por exemplo, Cldn11)1,2. As células leptomenínias estão implicadas em uma ampla gama de funções fisiológicas, desde o controle rigoroso sobre a drenagem do fluido cefalorraquidiano3 até a orientação de progenitores neurais no cérebro em desenvolvimento4,5. Um estudo recente também propôs que as leptomeninges no recém-nascido podem abrigar células radiais semelhantes à glia que migram para o parênquima cerebral e se desenvolvem em neurônios corticais funcionais6.
As células leptomenínias estão localizadas próximas aos astrócitos superficiais e compartilham com elas, assim como outras astroglias parênquias, expressão de connexin-30 (Cx30)7. O procedimento cirúrgico descrito abaixo permite a rotulagem generalizada e específica dessas células meningeais através de uma entrega única de endoxifen na cisterna magna de camundongos transgênicos expressando condicionalmente tdTomato em células Cx30+ (ou seja, usando um sistema CreER-loxP para mapeamento do destino). O endoxifen é um metabólito ativo do Tamoxifen e induz a recombinação de células expressas por CreER da mesma forma que o Tamoxifen. É, no entanto, a solução recomendada para aplicação tópica porque se dissolve em 5-10% DMSO, em vez de altas concentrações de etanol. Além disso, o endoxifen não atravessa a barreira cérebro-meningeal, permitindo assim uma recombinação específica de células leptomeningeais, sem rotular a população cx30+ astroglial subjacente (ver Resultados Representativos).
A técnica aqui apresentada visa injetar manual e seguramente o composto no fluido cefalorraquidiano, via acesso direto à cisterna magna. Ao contrário de outros procedimentos mais invasivos que requerem craniotomia, esta abordagem permite infundir compostos sem causar danos ao crânio ou ao parequima cerebral. Assim, não está associada à indução de reações inflamatórias desencadeadas pela ativação de células glia parenquiais. Semelhante a outras estratégias de injeção descritas antesde 8,9,10, a abordagem presente baseia-se na exposição cirúrgica da membrana dural atlanto-occipital que cobre a cisterna magna, após dissecção contundente dos músculos do pescoço sobreposto. No entanto, ao contrário de outros procedimentos, recomendamos o uso de uma agulha dobrada na ponta, que pode ser estabilizada contra o osso occipital durante a administração. Isso evitará que a agulha penetre muito fundo e prejudique o cerebelo subjacente e a medula.
Este procedimento cirúrgico é compatível com investigações de rastreamento de linhagem que visam mapear mudanças nas identidades celulares e rotas migratórias através de camadas parêmicas. Também pode ser adaptado a estudos de ablação genética que pretendem sondar o papel das células leptomeningeais na saúde e na doença, como sua contribuição para o desenvolvimento cortical5 ou a disseminação da meningite bacteriana3,11. Finalmente, pode ser utilizado para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano quando combinado com a entrega de rastreadores fluorescentes em animais do tipo selvagem.

<table><tbody><tr><td>Unidade de anestesia</td><td>Univentor 410</td><td>8323102</td><td>Completo de vaporizador, câmara e tubulação que se conecta à câmara e ao suporte da cabeça do mouse</td></tr><tr><td>Anestesia (isoflurano)</td><td>Baxter Medical AB</td><td>000890</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Orion Pharma AB</td><td>014920</td><td>Nome comercial Cola</td></tr> de <tr><td>cianoacrilato</td> Rymadil<td>Carl Roth</td><td>0258.1</td><td>Use suturas de seda 5-0, em alternativa</td></tr><tr><td>Medbond Tissue Glue</td><td>Stoelting</td><td>50479</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Endoxifeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8284</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td> <td>Histolab</td><td>01370</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton (agulha chanfrada de 30 G)</td> <td>Hamilton</td><td>80300</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaína</td><td>Aspen Nordic</td><td>520455</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de cabeça de rato</td><td>Narishige International</td><td>SGM-4</td><td>Com bocal para anestesia inalatória. Como alternativa, use uma estrutura estereotáxica</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Barbeador</td><td>Aesculap</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>Lanças de absorção estéreis</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>18105-01</td><td>Cotonetes estéreis também são uma boa opção</td></tr><tr><td>Separador cirúrgico</td><td>Instrumento de Precisão Mundial</td><td>501897</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td>Dumont</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Bausch& Lomb Nordic AB</td><td>541760</td><td></td></tr></tbody></table>

indução da modificação das células leptomenínias via injeção intracisternal

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

O protocolo aqui descrito descreve como injetar soluções com segurança e manualmente através da cisterna magna, eliminando o risco de danos ao parnchyma subjacente. Protocolos publicados anteriormente recomendam o uso de agulhas retas que devem ser reduzidas a um máximo de 1-2 mm da superfície dural. A queda repentina da resistência uma vez perfurada a membrana dural dificulta a manutenção da agulha em posição constante. Nosso método, em vez disso, emprega uma agulha dobrada na ponta que pode ser estabilizada contra o osso occipital do crânio, impedindo assim que a seringa penetre no tecido após perfuração da membrana dural. O procedimento é simples, reproduzível e não causa desconforto duradouro nos animais operados. Descrevemos a estratégia de injeção intracisternal no contexto do mapeamento do destino genético das células leptomenínias vasculares. A mesma técnica pode, além disso, ser utilizada para abordar uma ampla gama de questões de pesquisa, como sondar o papel das leptomeninges no neurodesenvolvimento e a disseminação da meningite bacteriana, através da ablação genética de genes putativamente implicados nesses fenômenos. Além disso, o procedimento pode ser combinado com um sistema de infusão automatizado para uma entrega constante e usado para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano através da injeção de moléculas rotuladas fluorescentes.

A injeção intracisternal de endoxidos em camundongos transgênicos que expressam CreER sob o promotor Cx3013 e um repórter fluorescente induível permite uma recombinação específica de células leptomenínias sem rotular a superfície de expressão cx30 e os astrócitos parêmicos no córtex(Figura 1). Para ter acesso à cisterna magna, o animal anestesiado é posicionado com seu corpo e sua cabeça em um ângulo de aproximadamente 120°, permitindo...

Descrevemos uma injeção intracisternal que emprega uma agulha dobrada na ponta que pode ser estabilizada no crânio, eliminando assim o risco de dano ao parênquima subjacente. A abordagem pode ser usada para mapeamento do destino genético e manipulações de células leptomeningeais e para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano.

Indução da Modificação das Células Leptomenínias via Injeção Intracisternal

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...

Nosso procedimento cirúrgico permite a edição específica de genes de células leptomeningeais para estudar sua função em muitas condições fisiológicas e patológicas, como o neurodesenvolvimento e a disseminação de meningite bacteriana. Para minimizar os danos durante a entrega intracisternal do endoxifen, utilizamos uma agulha dobrada que pode ser presa contra a borda caudal do crânio para evitar que penetrá-lo penetrasse mais fundo no tecido. O procedimento pode ser usado para sondar o papel dos genes que expressam células leptomeningeais através da perda e ganho de experimentos de função.Também pode ser adotado para rastrear o fluxo de fluidos cefalorraquidianos. A demonstração visual deste método garantirá a identificação bem sucedida do local de injeção para injeção intracisternal e a compreensão sobre como fixar a agulha contra o osso occipital. Comece preparando uma seringa Hamilton com uma agulha chanfrada calibre 30 para injeção.Use fórceps para dobrar a agulha a 30 graus três milímetros da ponta. Em seguida, diluir o endoxifen em 10% DMSO a uma concentração de um miligrama por mililitro e enchir a seringa. Anestesiar o animal na câmara isoflurane.Em seguida, ajuste o suporte da cabeça do mouse para que o bocal esteja aproximadamente em um ângulo de 30 graus da superfície da mesa cirúrgica e fixe a cabeça do animal no suporte. Para melhorar a acessibilidade à cisterna magna, posicione o corpo do animal a aproximadamente 30 graus da superfície da mesa com a cabeça inclinada para baixo, o que estabelecerá um ângulo de 120 graus com o resto do corpo e estenderá a parte de trás do pescoço para facilitar o acesso à cisterna magna. Uma vez que o animal esteja devidamente posicionado, aplique pomada oftalmica, raspe a parte de trás do pescoço e higienize a área com lenços umedecidos e Betadine.Use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão midline começando ao nível do osso occipital e estendendo-se posteriormente. Separe suavemente o tecido conjuntivo superficial e os músculos do pescoço puxando para os lados da linha média com pinças finas de ponta que exporão a membrana dural sobre a cisterna magna. Posicione um pequeno separador cirúrgico para permitir a visualização da cisterna magna durante todo o procedimento.Identifique a extremidade caudal do osso occipital e insira a agulha anteriormente dobrada imediatamente por baixo. Uma vez perfurada a dura, permita que a ponta dobrada da agulha penetre sob a superfície puxando suavemente a seringa para cima e paralelamente ao corpo do animal, o que garantirá melhor estabilidade. Injete o composto lentamente para evitar interferências no fluxo natural do fluido cefalorraquidiano.Após a injeção, deixe a agulha descansar por dentro por um minuto e, em seguida, remova-a cuidadosamente com a ajuda de fórceps finos. Feche a pele com algumas gotas de adesivo de cianoacrilato e aplique anestésico local no local da injeção. Retire o animal do suporte e coloque-o em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento.Em seguida, certifique-se de monitorar o animal até que ele recupere a consciência. Injeção intracisternal de endoxifen em camundongos transgênicos expressando CreER sob o promotor Cx30, um repórter fluorescente indutível permite uma recombinação específica de células leptomeningeais sem rotular o vizinho Cx30 expressando astrócitos superficiais e astrócitos parenchímicos no córtex. Este protocolo de injeção aproveita o movimento fisiológico do fluido cefalorraquidiano para que a solução de endoxifen seja distribuída por todo o espaço subaracnóide para recombinar eficientemente as células leptomeningeais que sobrepõem as lâmpadas olfativas, córtex e cerebelo.A solução não atravessa a barreira meningeal cerebral ou entra em contato com células astrogliais do parenchyma em oposição à administração sistêmica através de gavage oral. A recombinação das células leptomeningeais após a injeção intracisternal foi identificada através da reatividade Pdgfr-alfa, enquanto os astrócitos superficiais e parenchímicos que expressavam Gfap permaneceram sem rótulo. Ao tentar este experimento, é importante localizar o local de injeção para entrega intracisternal.Esta demonstração visual fornece o know-how técnico para realizar o procedimento, minimizando o risco de danificar o tecido neural sob ele. Estudos de ablação genética podem ser realizados com essa técnica para investigar o papel das células leptomeningeais na corticogênese e regulação da formação de fluidos cefalorraquidianos e identificar locais adicionais para disseminação de bactérias no espaço subaracnóide.

induction-leptomeningeal-cells-modification-via-intracisternal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Zamboni, M., et al., Indução de modificação de células leptomeníngeas via injeção intracisternal. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o procedimento de administração de um medicamento indutor na cisterna magna de um camundongo anestesiado. A injeção induz seletivamente a expressão de marcadores fluorescentes em células da superfície cerebral acessíveis via líquido cefalorraquidiano, confirmado por imagens de fluorescência.

Entrega de medicamentos direcionados em um modelo de camundongo via injeção de cisterna magna

Neste vídeo, descrevemos o procedimento para entregar células tumorais derivadas de humanos na cisterna magna do cérebro de um camundongo. O modelo de camundongo ortotópico pode ser usado para estudar a disseminação metastática do câncer para as meninges cranianas.

Injeção Cirúrgica de Cisterna Magna: Um Método para Administração de Células Tumorais Diretamente no Sistema Nervoso Central do Modelo Murino

Neste vídeo, demonstramos a entrega intracisternal de Neisseria meningitidis em um modelo de camundongo para gerar infecção por meningite.

Entrega intracisternal de meningococos em modelos de camundongos para induzir meningite meningocócica

O vídeo demonstra um método para gerar um modelo de rato com desmielinização cortical cerebral generalizada. Isso envolve a interrupção da barreira hematoencefálica injetando citocinas pró-inflamatórias em camundongos preparados com proteína recombinante da bainha de mielina. Esse processo facilita a infiltração de células imunológicas, resultando em desmielinização cortical cerebral generalizada.

Gerando a desmielinização cortical cerebral generalizada em um modelo de rato

Neste vídeo, um modelo de camundongo com esclerose múltipla é estabelecido usando encefalomielite autoimune experimental (EAE). O camundongo é injetado com uma emulsão contendo um peptídeo neuronal e um adjuvante, desencadeando uma resposta imune que ativa as células T autorreativas. Isso é seguido por uma injeção de toxina coqueluche (PTX) para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que as células T autorreativas se infiltrem no cérebro. Essa infiltração inicia uma...

Indução de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

O protocolo aqui apresentado permite a reprodução de uma desmielinização de matéria cinzenta generalizada de ambos os hemisférios corticais em ratos agouti machos adultos. O método compreende a implantação intracerebral de um cateter, imunização subclínica contra glicoproteína de oligodendrocyte de mielina e injeção intracerebral de uma mistura de citocinas pró-inflamatórias através do cateter implantado.

Modelo de Rato de Demyelinação Cortical Cerebral Generalizada Induzida por uma injeção intracerebral de citocinas pró-inflamatórias

Aqui, descrevemos um método para induzir a meningite meningocócica através de uma via intracisternal de infecção em camundongos adultos. Apresentamos um protocolo passo a passo de infecção meningocócica desde a preparação do inóculo para a infecção intracisternal; registre então a sobrevivência animal e avalie as cargas bacterianas em tecidos do murine.

Indução meningocócica meningite sorogrupo C em camundongos via parto intracisternal

Aqui, descrevemos um modelo de xenoenxerto de murina que se assemelha funcionalmente a um reservatório de Ommaya em pacientes. Desenvolvemos a Murine Ommaya para estudar novas terapêuticas para a doença leptomeningeal universalmente fatal.

Um modelo de xenoenxerto Murine Ommaya para estudar terapia direta da doença leptomeningeal

O presente protocolo descreve instruções passo a passo para a realização de injeções intratecais em camundongos neonatais para edição gênica e liberação de drogas.

Injeção Intratecal de Camundongos Recém-Nascidos para Edição do Genoma e Liberação de Fármacos

O protocolo descreve um método para injetar células tumorais através da via de punção percutânea na cisterna magna que induz metástase leptomeníngea em camundongos, reduzindo o trauma e a carga tumoral extracraniana.

Modelo de injeção minimamente invasiva de cisterna magna para estudos de metástase leptomeníngea em camundongos

Aqui, é apresentado um protocolo para avaliar os vasos linfáticos meníngeos (MLVs) de camundongos, que desempenham um papel importante em múltiplas doenças neurológicas. O objetivo desse protocolo é fornecer um método integrado que permita tanto a avaliação funcional da drenagem dos traçadores quanto a caracterização morfológica detalhada da rede de MLVs dorsais.

Protocolo Integrado para Avaliação de Linfáticos Meníngeos: Injeção de Cisterna Magna, Imagem de Linfonodos, Dissecção Meníngea e Coloração em Montagem Inteira

Aprenda a técnica de injeção intracisternal com agulha curvada para edição genética específica de células leptomeníngeas em camundongos transgênicos. Este método minimiza danos aos tecidos neurais adjacentes e possibilita estudos precisos de neurodesenvolvimento e patologias meníngeas.

Indução da Modificação das Células Leptomenínias via Injeção Intracisternal

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