Detecção de Proteína S-Acilação usando captura assistida de acila-resina

A s-acilação é uma modificação pós-translacional reversível que envolve a adição de uma cadeia de acila gordurosa a um resíduo de cisteína interna em uma proteína alvo através de uma ligação de thioester labile¹. Foi relatado pela primeira vez como uma modificação de proteínas com palmitato, um ácido graxo saturado de 16^{carbonos 2}, e, portanto, esta modificação é frequentemente referida como S-palmitoylation. Além do palmitato, as proteínas podem ser reversivelmente modificadas por uma variedade de ácidos graxos mais longos e curtos saturados (myristate e esteato), monoinsaturados (oleato) e poliinsaturados (aracidonate e eicosapentanoato) ácidos graxos^3,4,5,6,7. Em células eucarióticas, a s-acilação é catalisada por uma família de enzimas conhecidas como aciltransferases de proteína DHHC e a reação reversa da deacinada cisteína é catalisada por thioesterases protéicas, a maioria das quais ainda permanecem enigmáticas⁸.

A labilidade da ligação tioester torna reversível essa modificação lipídica, permitindo-lhe regular dinamicamente o agrupamento de proteínas, a localização da membrana plasmática, o tráfico intracelular, as interações proteína-proteína e a estabilidade proteica^9,10. Consequentemente, a s-acilação tem sido associada a vários distúrbios, incluindo a doença de Huntington, doença de Alzheimer e vários tipos de câncer (próstata, gástrico, bexiga, pulmão, colorretal), o que requer o desenvolvimento de métodos confiáveis para detectar essa modificação proteica pós-translacional¹¹.

A rotulagem metabólica com palmitato radioativo^([3H], [¹⁴C] ou [¹²⁵I]) foi uma das primeiras abordagens desenvolvidas para ensaio de proteína S-acilação^12,13,14. No entanto, os métodos baseados em rotulagem por radiorotulagem apresentam preocupações de saúde, não são muito sensíveis, demorados e detectam apenas lipidação de proteínas altamente abundantes¹⁵. Uma alternativa mais rápida e não radioativa à rotulagem radioativa é a rotulagem metabólica com sondas de ácidos graxos bioortogonais, que é usada rotineiramente para ensaio dinâmico da proteína S-acilação¹⁶. Neste método, um ácido graxo com um repórter químico (grupo alquina ou azida) é incorporado na proteína S-acylated por uma proteína aciltransferase. A reação de cicloadição de Azide-alquino Huisgen (química do clique) pode então ser usada para anexar um grupo funcionalizado, como um floróforo ou biotina, ao ácido graxo integrado que permite a detecção da proteína S-acylated^17,18,19.

A troca de acilina (ABE) é um dos métodos bioquímicos amplamente utilizados para captura e identificação de proteínas S-acyladas que ignora algumas das deficiências da rotulagem metabólica, como a inadequação para amostras de tecido¹⁵. Este método pode ser aplicado para análise da s-acilação em uma variedade diversificada de amostras biológicas, incluindo tecidos e amostras de células congeladas^20,21. Este método baseia-se no decote seletivo da ligação tioester entre o grupo acile e o resíduo de cisteína por hidroxilamina neutra. Os grupos thiol liberados são então capturados com um derivado de biotina tiol-reativo. As proteínas biotinyladas geradas são então purificadas por afinidade usando agarose de streptavidin e analisadas por imunoblotting.

Uma abordagem alternativa denominada captura assistida de acilina (Acyl-RAC) foi posteriormente introduzida para substituir a etapa de biotinylation por conjugação direta de cisteínas livres por uma resina tiol-reativa^22,23. Este método tem menos passos em comparação com a ABE e da mesma forma pode ser usado para detectar aciação de proteína S em uma ampla gama de amostras¹.

A Cil-RAC consiste em 4 passos principais (Figura 1),
1. Bloqueio de grupos de tiol livres;
2. Decote seletivo da ligação cisteine-acila thioester com hidroxilamina neutra (HAM) para expor grupos de cisteína thiol;
3. Captura das cisteínas lipidados com resina tiol-reativa;
4. Enriquecimento seletivo das proteínas S-acylated após elução com a redução do tampão.

As proteínas capturadas podem então ser analisadas por imunoblotting ou submetidas à espectrometria de massa (MS) para avaliar o proteoma s-acylado em uma variedade variada de espécies e tecidos^22,24,25. Os locais individuais de s-acilação também podem ser identificados pela digestão da tripsina das proteínas capturadas e análise dos peptídeos resultantes por LC-MS/MS²². Aqui, demonstramos como a acil-RAC pode ser usada para detecção simultânea de s-acilação de múltiplas proteínas em uma linha celular e uma amostra de tecido.

Os camundongos utilizados neste protocolo foram eutanizados de acordo com as diretrizes do NIH. O Comitê de Bem-Estar Animal do Centro de Ciência da Saúde da Universidade do Texas, em Houston, aprovou todo o trabalho animal.

1. Preparação de lysates celulares

1. Prepare o buffer de lysis conforme descrito na Tabela 1. A 10 mL de PBS, adicione 0,1 g de n-dodecil β-D-maltoside detergente (DDM) e gire para dissolver. Adicione 100 μL de coquetel inibidor de fosfatase 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) e coquetel inibidor de protease (1x) e esfrie o tampão no gelo antes do uso.
2. Transferir a mídia necessária contendo células da incubadora para tubos cônicos de 15 mL ou 50 mL e células giratórias a 350 x g por 5 min e aspirar para se livrar de quaisquer detritos celulares.
   NOTA: Utilizou 1 x 10⁷ células para cada reação acil-RAC a ser realizada.
3. Lave a pelota resuspendendo-a em 5 mL de PBS e girando a 350 x g por 5 min.
   NOTA: Execute rapidamente a etapa 1.3 para evitar a lse celular devido à incubação prolongada na PBS.
4. Adicione 600 μL de tampão de lysis preparado na etapa 1.1 para a pelota e lyse-lo agitando a 1500 rpm em um shaker térmico por 30 min a 4 °C.
5. Limpe as lidas por centrifugação a 20.000 x g a 4 °C por 30 min para pellet detergente-insolúvel. Colete lysate limpo em tubos de microfusão pré-resfriados de 1,5 mL e mantenha-os no gelo.
6. Realize um ensaio bradford/bca para estimar a concentração de proteínas. É fundamental garantir a mesma quantidade de proteína em diferentes amostras antes de realizar o experimento. Recomendamos o uso de pelo menos 500 μg de proteína por reação.
   NOTA: Nos experimentos descritos, utilizou-se células cultivadas (Jurkat) e esplenocites primários a partir do tecido de camundongos. O método de lyse descrito acima também pode ser adotado para outros tipos de células. A concentração média de proteína obtida para os tipos de células acima mencionadas é de aproximadamente 500 μg por 1 x 10⁷ células. As células de Jurkat foram mantidas no meio RPMI-1640 modificado para conter 2 mM L-glutamina, 10 mM HEPES, 1 mM de piruvato de sódio, 4.500 mg/L de glicose e 1.500 mg/L de bicarbonato de sódio suplementado com 10% de FBS a 37 °C com 5% de CO₂. Usamos 1 x 10⁷ células Jurkat por reação. Os esplenocites primários foram isolados do tecido do baço do camundongo como descrito²⁶. Resumidamente, o tecido do baço foi macerado no gelo, seguido de lyse de eritrócitos em solução hipotônica e separação dos linfócitos por centrifugação. Usamos 1 x¹⁰⁷ células primárias por reação.

2. Acill-RAC: Bloqueio de grupos de tiol gratuitos

NOTA: Todas as etapas subseqüentes podem ser executadas à temperatura ambiente (RT).

1. Transfira o lysate para um tubo de microfusão fresco de 1,5 mL e realize precipitação de clorofórmio-metanol (CM), conforme descrito abaixo.
   1. Adicione metanol (MeOH) e clorofórmio (CHCl₃) ao lysato em uma razão final de lysate: MeOH: CHCl₃ de 2:2:1 e agite vigorosamente para criar uma suspensão homogênea.
   2. Gire a 10.000 x g por 5 min para formar uma pelota ("panqueca") na interfase entre as fases aquosas e orgânicas.
   3. Incline o tubo e aspirar o máximo de solvente possível usando uma agulha ou uma ponta de carregamento de gel.
   4. Seque o ar da pelota de proteína por alguns minutos e lave-a delicadamente adicionando 600 μL de MeOH e misturando suavemente para evitar quebrar a pelota
   5. Retire cuidadosamente o MeOH restante e seque a pelota de proteína em uma bancada por aproximadamente 5 minutos.
   6. (Opcional) Realize um passo adicional de centrifugação para girar qualquer pelota quebrada após a lavagem MeOH para evitar a perda da amostra.
      NOTA: O experimento pode ser interrompido após a etapa de precipitação de CM. Uma vez obtida a pelota, pode ser armazenada em 500 μL de MeOH em -20 °C até uma semana.
      1. Dissolva a pelota de proteína em 200 μL de tampão 2SHB, vórticando a 42 °C/1500 rpm em um agitador térmico até que a pelota seja dissolvida.
   7. (Opcional) Incubar por mais 5-10 min em um banho de água sônica para dissolver a pelota.
      NOTA: O comprimento da sonagem varia dependendo da solubilidade do material. No entanto, a sonoração prolongada pode causar degradação proteica.
2. Prepare 0,2% de metanosulfonato de metila (MMTS) (v/v) em 2SHB adicionando 2 μL de MMTS a 998 μL de tampão 2SHB.
   NOTA: Use mms de 0,2% recém-preparados para cada experimento.
3. Adicione 200 μL de 0,2% de MMTS em 2SHB a cada tubo a uma concentração final de 0,1% MMTS. Incubar por 15 min a 42 °C com agitação a 1500 rpm em um agitador térmico.

3. Acila-RAC: Decote de hidroxilamina (HAM) e captura de proteínas S-aciadas

1. Repita precipitações de 3-4x CM conforme descrito acima para remover mmts. A remoção do MMTS pode ser estimada pela falta de odor distinto de MMTS. Após cada precipitação, dissolva a pelota em 100 μL de tampão 2SHB, vórticando a 42 °C/1500 rpm em um agitador térmico até que a pelota se dissolva e, em seguida, diluir com 300 μL de Tampão A.
2. Após a precipitação final, dissolva amostras em 200 μL de tampão 2SHB conforme descrito acima e diluir com 240 μL de Buffer A.
3. No caso de comparar as alterações na acilação s em resposta a várias condições de tratamento, meça novamente a concentração de proteínas e prossiga com a mesma quantidade de proteína para cada condição.
4. Retenha 40 μL de cada amostra como um controle de entrada.
5. Divida as amostras em duas partes iguais de 200 μL e marque tubos como "+ HAM" e "- HAM". Adicione 50 μL de 2 M HAM neutro recém-preparado (pH 7.0-7.5) a uma concentração final de 400 mM a um dos tubos (+ HAM) e 50 μL de 2 M neutros para o segundo tubo (- HAM), que será usado como um controle negativo. Proceder à adição de contas de thiopropyl-Sepharose (TS).
   NOTA: O experimento pode ser interrompido após qualquer uma das etapas de precipitação do CM. Uma vez obtida a pelota, pode ser armazenada em 500 μL de MeOH em -20 °C até uma semana. O pH neutro de 2 M HAM garante sua seletividade para a ligação de thioester acile-cisteína e deve ser cuidadosamente ajustado. Deve-se tomar cuidado ao manusear amostras no tampão 2SHB para evitar a perda da amostra devido à espuma excessiva. Todas as etapas seguintes são idênticas para amostras de HAM e + HAM.
6. Adicione 30 μL de pasta-de-bico-ts a cada tubo e gire os tubos por 1-2 h em RT.
7. Lave as contas TS 4x com 1% de SDS no Buffer A para remover o HAM residual.
   1. Gire suavemente todas as amostras de contas usando um microfuge por 1 min e apiratee cuidadosamente o sobrenadante.
   2. Ressuspensão das contas em 500 μL de 1% de SDS no Buffer A.
   3. Repita o passo 3.7.1-3.7.2 três vezes.
      NOTA: O thiopropyl-Sepharose ativado (TS) é fornecido congelado na presença de aditivos que devem ser lavados em pH neutro antes do acoplamento. A água destilada é recomendada para inchaço e lavagem. Pesar 0,1 g de contas e resuspender em 1 mL de água destilada e deixá-la inchar enquanto gira por 30 min-1 h em RT. Lave as contas 1x com tampão A e prepare um chorume com tampão A, em uma razão de 50% de médio assentado a 50% tampão. TS inchado pode ser armazenado em pH neutro na presença de 20% de etanol a 4 °C até uma semana. Não use azida de sódio como agente bacteriostático, uma vez que os íons de azida reagem com os grupos de dissulfeto de 2-piridinas. Para maior eficiência, prepare contas novas. Ao manusear as contas, a ponta de uma pipeta P200 pode ser cortada ligeiramente de modo a evitar qualquer dano.
      NOTA: O experimento pode ser interrompido em qualquer estágio após a precipitação de CM. A pelota pode ser guardada em 500 μL de MeOH em -20 °C até uma semana.

4. Elução e detecção de proteínas S-aciadas

1. Após a última lavagem, gire suavemente para baixo as contas como descrito acima e aspirar o máximo de sobrenatantes possível sem perturbar as contas.
2. Recupere as proteínas das contas com tampão amostral de 4x SDS com DTT.
   1. Adicione 50 μL de tampão de amostra SDS 4x às contas e incubar a 80 °C, 1500 rpm por 15 min em um shaker térmico. Deixe os tubos esfriarem.
   2. Centrifugar as contas a 5.000 x g por 3 min para pellet completamente as contas e transferir as proteínas eluidas para um tubo fresco de 1,5 mL usando uma ponta de carregamento de gel.
3. Execute o SDS-PAGE e analise a s-acilação das proteínas de interesse pela mancha ocidental.

Seguindo o protocolo descrito acima, primeiro usamos acil-RAC para detectar simultaneamente a acilação de S de várias proteínas em células de Jurkat, uma linha de células T imortalizada originalmente derivada do sangue periférico de um paciente com leucemia de células T27. As proteínas de células T regulatórias previamente identificadas como S-acylated9,28,29 foram escolhidas para demonstrar a utilidade deste método. Como mostrado na Figura 2A,a tyrosine quinase Lck pode ser detectada em lisatos tratados com hidroxilamina neutra de 2 M para cortar a ligação de thioester entre resíduos de cisteína e um moiety ácido graxo (+ pista HAM). A amostra tratada com 2 M NaCl (- faixa HAM) representa um importante controle negativo, indicando a seletividade do ensaio para detecção das ligações de thioester. A faixa de entrada confirma ainda mais a especificidade do sinal e pode servir como um controle positivo se a proteína de interesse não for S-acylated. A membrana foi então despojada e rescada com anticorpos contra proteínas Fyn e LAT para demonstrar que o ensaio acil-RAC pode ser usado para analisar a acilação S de múltiplas proteínas ao mesmo tempo(Figura 2A).

Para demonstrar a utilidade deste método para detectar a cianação de proteínas em amostras de tecido, aplicamos o protocolo acil-RAC ao baço do camundongo. Como mostrado na Figura 2B,a acilação s de Lck, Fyn e LAT pode ser prontamente detectada em esplenocós de camundongos primários indicando que esta modificação é conservada entre duas espécies.

Figura 1. Representação esquemática de acil-RAC. O método consiste em 4 passos principais: (1) bloquear grupos de tiol livres com metatornossulfonato metil (MMTS), (2) decote seletivo da ligação cisteína-acila thioester com hidroxilamina neutra (HAM) para expor grupos de cisteína thiol, (3) captura de proteínas com cisteína thiol recém-exposta por conjugação direta com uma resina tiol-reativa e (4) recuperação de proteínas capturadas utilizando um tampão de elução redutor, seguido de imunoblotação ou análise de Esm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Detecção de proteínas S-acyladas. Um ensaio acilo-RAC foi usado para detectar s-acilação de proteínas de sinalização de células T em células Jurkat T(A) e tecido de baço murina(B). A imunoblotação com anticorpos específicos de Lck, Fyn e LAT mostra a acilação s dessas proteínas na amostra tratada com hidroxilamina (+ pista HAM). Uma amostra tratada com cloreto de sódio (- pista de HAM) serve como controle negativo. Lysates não tratados são mostrados na faixa de entrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Composição tampão de buffers comumente utilizados exigidos no protocolo. 2SHB buffer e Buffer A podem ser preparados com antecedência, mas seu pH deve ser verificado regularmente. Lysis buffer e HAM devem estar preparados no dia da experiência.

Nenhum conflito de interesse declarado.