A Cil-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) é um método altamente sensível, confiável e fácil de executar para detectar modificações lipídicas reversíveis de resíduos de cisteína (S-acilação) em uma variedade de amostras biológicas.
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Artigo de método
Detecção de Proteína S-Acilação usando captura assistida de acila-resina
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A proteína S-acilação, também referida como S-palmitoylation, é uma modificação pós-translacional reversível de resíduos de cisteína com ácidos graxos de cadeia longa através de uma ligação de tiéster labile. A acilação s, que está emergindo como um mecanismo regulatório generalizado, pode modular quase todos os aspectos da atividade biológica das proteínas, desde a formação complexa até o tráfico de proteínas e a estabilidade proteica. O recente progresso na compreensão da função biológica da proteína S-acilação foi alcançado em grande parte devido ao desenvolvimento de novas ferramentas bioquímicas permitindo a detecção robusta e sensível da proteína S-acilação em uma variedade de amostras biológicas. Aqui, descrevemos a captura assistida por acilina (Acyl-RAC), um método recentemente desenvolvido baseado na captura seletiva de proteínas endógenas S-acylated por contas de Sefarrose reativas de tiol. Em comparação com as abordagens existentes, a Acyl-RAC requer menos passos e pode produzir resultados mais confiáveis quando associada à espectrometria de massa para identificação de novos alvos de acilação S. Uma grande limitação nesta técnica é a falta de capacidade de discriminação entre espécies de ácidos graxos ligadas a cisteínas através da mesma ligação thioester.
Introdução
A s-acilação é uma modificação pós-translacional reversível que envolve a adição de uma cadeia de acila gordurosa a um resíduo de cisteína interna em uma proteína alvo através de uma ligação de thioester labile1. Foi relatado pela primeira vez como uma modificação de proteínas com palmitato, um ácido graxo saturado de 16carbonos 2, e, portanto, esta modificação é frequentemente referida como S-palmitoylation. Além do palmitato, as proteínas podem ser reversivelmente modificadas por uma variedade de ácidos graxos mais longos e curtos saturados (myristate e esteato), monoinsaturados (oleato) e poliinsaturados (aracidonate ....
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Protocolo
Os camundongos utilizados neste protocolo foram eutanizados de acordo com as diretrizes do NIH. O Comitê de Bem-Estar Animal do Centro de Ciência da Saúde da Universidade do Texas, em Houston, aprovou todo o trabalho animal.
1. Preparação de lysates celulares
- Prepare o buffer de lysis conforme descrito na Tabela 1. A 10 mL de PBS, adicione 0,1 g de n-dodecil β-D-maltoside detergente (DDM) e gire para dissolver. Adicione 100 μL de coquetel inibidor de fosfatase 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) e coquetel inibidor de protease (1x) e esfrie o tampão no gelo antes do uso.
- Transferir a mídia necessária contendo....
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Resultados
Seguindo o protocolo descrito acima, primeiro usamos acil-RAC para detectar simultaneamente a acilação de S de várias proteínas em células de Jurkat, uma linha de células T imortalizada originalmente derivada do sangue periférico de um paciente com leucemia de células T27. As proteínas de células T regulatórias previamente identificadas como S-acylated9,28,29 foram escolhidas para demonstrar a utilidade d.......
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Discussão
Aqui, utilizamos com sucesso o ensaio acil-RAC para detectar a ciação S de proteínas selecionadas em células humanas cultivadas e células primárias derivadas do tecido do camundongo. Este método é simples, sensível e pode ser facilmente realizado com requisitos mínimos de equipamento usando técnicas padrão de bioquímica. Este método tem sido demonstrado para identificar com sucesso novas proteínas S-acylated, como a β-subunidade do sistema de translocação de proteínas (Sec61b), proteína ribossômica S11 (Rps11) e glutatio.......
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Divulgações
Nenhum conflito de interesse declarado.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde 5R01GM115446 e 1R01GM130840.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| comprimidos de coquetel de inibidor de protease completo | Sigma | 11836170001 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| hidroxilamina (HAM) | Sigma | 159417 | |
| metil metantiossulfonato (MMTS) | Sigma | 64306 | |
| Mini rotador de tubo | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-Dodecil β-D-maltosídeo (DDM) | Sigma | D641 | |
| Coquetel Inibidor de Fosfatase 2 | Sigma | P5726 | |
| Tiopropil-Sepharose 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
| Ultrassom Quantrex Sonicator | L &; R |
Referências
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
- Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5)....
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Reimpressões e permissões
