Medição da Toxicidade do Peptídeo RAN em C. elegans

Summary

Os produtos translacionais não dependentes do ATG são características patogênicas emergentes de várias doenças baseadas em expansão repetida. O objetivo do protocolo descrito é avaliar a toxicidade causada por esses peptídeos utilizando ensaios comportamentais e celulares no sistema modelo C. elegans.

Abstract

C. elegans é comumente usado para modelar doenças neurodegenerativas relacionadas à idade causadas por mutações de expansão repetidas, como a Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) e a doença de Huntington. Recentemente, o RNA contendo expansão repetida mostrou-se o substrato para um novo tipo de tradução proteica chamada tradução não-dependente de AUG (RAN). Ao contrário da tradução canônica, a tradução RAN não requer um codon inicial e só ocorre quando as repetições excedem um comprimento de limiar. Como não há codon de início para determinar o quadro de leitura, a tradução RAN ocorre em todos os quadros de leitura tanto de modelos de RNA de sentido quanto de RNA antissentido que contêm uma seqüência de expansão repetida. Portanto, a tradução ran expande o número de possíveis peptídeos tóxicos associados à doença de um para seis. Até agora, a tradução ran foi documentada em oito diferentes doenças neurodegenerativas e neuromusculares baseadas em expansão. Em cada caso, decifrar quais produtos RAN são tóxicos, bem como seus mecanismos de toxicidade, é um passo crítico para entender como esses peptídeos contribuem para a fisiopatologia da doença. Neste artigo, apresentamos estratégias para medir a toxicidade dos peptídeos RAN no sistema modelo C. elegans. Em primeiro lugar, descrevemos procedimentos para medir a toxicidade do peptídeo RAN sobre o crescimento e a motilidade do desenvolvimento de C. elegans. Em segundo lugar, detalhamos um ensaio para medir efeitos pós-desenvolvimento, dependentes da idade dos peptídeos RAN sobre a motilidade. Finalmente, descrevemos um ensaio de neurotoxicidade para avaliar os efeitos dos peptídeos ran na morfologia dos neurônios. Esses ensaios fornecem uma ampla avaliação da toxicidade do peptídeo RAN e podem ser úteis para a realização de telas genéticas ou pequenas moléculas em larga escala para identificar mecanismos ou terapias de doenças.

Introduction

A expansão inadequada das sequências de repetição do DNA é a base genética para várias doenças neurodegenerativas, como a esclerose lateral amiotrófica (ELA), a demência frontotemporal (TFT) e a doença de Huntington (HD)¹. Embora existam modelos celulares e animais estabelecidos para essas doenças, os mecanismos subjacentes a essas condições não são bem definidos. Por exemplo, o HD é causado pelas expansões de uma seqüência de repetição CAG na seqüência de codificação para a proteína Huntingtin Htt². Como o CAG codifica a glutamina de aminoácidos, a expansão de repetição do CAG resulta na inserção de uma seqüência de pol....

Protocol

1. Gerando construções de expressão ran variadas de códon

1. Projete a seqüência individual de codificação de peptídeos RAN utilizando códons sinônimos para eliminar a estrutura fundamental de DNA/RNA repetitivo, mas preservar a seqüência de aminoácidos sobrepostas.
2. Encomendar as seqüências de códon personalizadas comercialmente nos comprimentos de repetição necessários para os estudos (tipicamente 5-100 repetições). Inclua um local de restrição HindIII no final de 5' e um site de restrição bamhi no final de 3' para facilitar a clonagem em vetores de expressão C. elegans, como pPD95.79.
   NOTA: Se a síntese de construções maiores se mostrar ....

Results

Utilizou-se os ensaios descritos aqui para avaliar o efeito de diferentes inibições genéticas sobre a toxicidade dos dipeptídeos RAN que são encontrados em pacientes com ELA com uma expansão repetitiva G₄C_2. Usando o ensaio de crescimento para medir a toxicidade do desenvolvimento, analisamos os efeitos de vários mutantes de nocaute genético identificados em um genoma de supressores de tela RNAi de toxicidade PR50-GFP expressa muscular. Enquanto a expressão de PR50-GFP sozinha resultou em uma prisão.......

Discussion

Aqui relatamos métodos que podem ser usados para ensaio da toxicidade do peptídeo RAN modelado no músculo ou nos neurônios de C. elegans. Embora as proteínas neurodegenerativas tenham um fenótipo de início de idade em pacientes humanos, elas também podem exibir toxicidade de desenvolvimento quando superexpressas em sistemas modelo. A superexpressão tem limitações interpretativos significativas, mas também fornece um ponto de partida poderoso para telas genéticas ou farmacológicas destinadas a identificar genes o.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placa de Petri de 35 mm x 10 mm, Estéril	CELLTREAT Scientific Products	50-202-036	Placas de crescimento de nematóides e ágar RNAi
GRANULADO 2 QUILOGRAMAS	BD DIAGNOSTIC SYSTEMS		Placas de crescimento de nematóides e RNAi
AGAROSE ULTRAPURE	LIFE TECHNOLOGIES		Microinjeção para gerar cepas transgênicas de peptídeos RAN
CARBENICILINA 5G	THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS	BP26485	Placas de crescimento de nematóides e ÓCULOS DE COBERTURA DE RNAi
Nº 1 22MM 1OZ/PK	THERMO SCI ERIE	12542B	Imagem para ensaio de comissura
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS	EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS		Microinjeção para gerar cepas transgênicas de peptídeos
RAN FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK	THERMO SCI ERIE	125485C	Microinjeção para gerar cepas transgênicas de peptídeos RAN
Fisherbrand  Lâminas de Microscópio Superfrost Plus	THERMO SCI ERIE	12-550-15	Imaging para ensaio de comissura
Gibco  Bacto Peptone	Gibco	DF0118-17-0 Placas de	crescimento de nematóides e RNAi
HALOCARBON OIL 700	SIGMA-ALDRICH INC	H8898-50ML	Microinjeção para gerar cepas transgênicas de peptídeos RAN
IPTG BIOTECH 10G	THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS		Placas de crescimento de nematóides e RNAi
Leica Advanced Fluorescence imaging software	Leica Microsystems	LAS-AF	Software de aquisição de imagem para análise de velocidade de vídeo e ensaio de comissura
Leica Immersion tipo N (Óleo)	W NUHSBAUM INC		Imaging para ensaio de comissura
CLORIDRATO DE LEVAMISOL 10GR	THERMO SCI ACROS ORGANICS		Imaging para ensaio de comissura
PONTAS DE MICROCARREGADOR 2 X 96 PCS	EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS		E5242956003Microinjeção para gerar cepas transgênicas de peptídeos RAN
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS	CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC		Placas de crescimento de nematóides e RNAi
PLACA DE CULTO DE TECIDO 24WEL 50/CS	CORNING LIFE SCIENCES DL	87721	Placas de crescimento de nematóides e RNAi