Métodos padronizados para medir a indução da resposta de choque térmico em elegans caenorhabditis

A resposta ao choque térmico (HSR) é uma resposta universal de estresse celular induzida por erros de proteína citosolítica causada por aumentos de temperatura e outras tensões proteotóxias. A ativação do HSR em Caenorhabditis elegans leva à regulação transcricional de genes de choque térmico como hsp-70 e hsp-16.2. Muitas proteínas de choque térmico (HSPs) funcionam como acompanhantes moleculares que restauram a homeostase dobrável de proteínas, ou proteostase, interagindo diretamente com proteínas mal dobradas ou danificadas. O regulador mestre do HSR é o fator de transcrição Heat Shock Factor 1 (HSF-1), cuja ativação é elegantemente controlada através de múltiplos mecanismos¹.

O papel do HSF-1 não se restringe ao estresse. O HSF-1 é necessário para o crescimento e desenvolvimento normais, uma vez que a exclusão do hsf-1 leva à prisão larval². O HSF-1 também é importante durante o envelhecimento e doenças neurodegenerativas relacionadas à idade caracterizadas pelo acúmulo de agregados proteicos e pela incapacidade de manter a proteostase. O knockdown do hsf-1 causa acúmulo de agregados proteicos e uma vida útil reduzida, enquanto a superexpressão do hsf-1 reduz a agregação de proteínas e prolonga a vida útil^3,,4. Portanto, a regulação do HSF-1 a nível molecular tem amplas implicações para a fisiologia e doenças do organismo.

C. elegans é um poderoso organismo modelo para pesquisa de HSR porque o HSR pode ser medido nos níveis molecular, celular e organismo^4,,5,6. Destacando o poder deste modelo, foram descobertos avanços fundamentais na delineamento da via HSR, como diferenças específicas de tecido na regulação da RSE, em C. elegans^7,,8. Além disso, c. elegans é amplamente utilizado para pesquisas de envelhecimento e é um sistema emergente para modelagem de doenças ligadas à interrupção da proteostase.

Embora os experimentos de choque térmico com C. elegans possam ser rápidos e reprodutíveis, há várias perguntas a serem consideradas antes de começar. Por exemplo, qual temperatura deve ser usada para a indução do HSR e quanto tempo os vermes devem ser expostos? É melhor usar uma incubadora seca ou um banho de água? Qual estágio de desenvolvimento deve ser usado? Infelizmente, as metodologias utilizadas para investigar o HSR variam amplamente de laboratório para laboratório, causando confusão ao selecionar as melhores metodologias e dificultando a comparação de resultados em todo o campo.

Apresentamos protocolos robustos e padronizados para o uso de RT-qPCR, repórteres fluorescentes e a diversidade para medir o HSR. Embora essas três abordagens sejam complementares, cada uma delas tem vantagens e desvantagens únicas. Por exemplo, o RT-qPCR é a medição mais direta e quantitativa do HSR, e este ensaio pode ser facilmente expandido para incluir muitos genes indutores de choque térmico diferentes. No entanto, o RT-qPCR é o mais caro, pode ser tecnicamente difícil, e requer o uso de equipamentos especializados. Em contraste, os repórteres fluorescentes têm a vantagem de medir diferenças específicas do tecido na indução de HSR. No entanto, eles são difíceis de quantificar com precisão, só podem medir a indução acima de um certo limiar, e requerem o uso de um microscópio de fluorescência. Além disso, as cepas de repórteres descritas aqui estão atrasadas em desenvolvimento em comparação com a cepa padrão N2. Embora as cepas de repórteres mais novos contendo transgenes de cópia única estejam disponíveis, elas não foram testadas aqui⁹. O terceiro ensaio, thermorecovery, tem a vantagem de fornecer uma leitura fisiologicamente relevante no nível do organismo. No entanto, este ensaio é, sem dúvida, o menos sensível e mais indireto. Por fim, discutimos algumas variações comuns encontradas nesses ensaios e propomos um conjunto de melhores práticas para facilitar a pesquisa nesse campo.

1. Manutenção e sincronização de C. elegans

1. Mantenha os vermes a 20 °C nas placas do Nematode Growth Medium (NGM) semeadas com bactérias OP50 Escherichia coli, transferindo vários adultos para placas frescas aproximadamente 2x por semana¹⁰. Deve-se tomar cuidado para evitar que os vermes fiquem sem comida, pois isso pode afetar sua fisiologia¹¹.
   1. Preparação de placas de NGM.
      1. Misture 3 g de NaCl, 2,5 g de Bacto-peptone, 20 g de ágar, e deionizado (DI) H₂O até 1 L em um frasco.
      2. Autoclave a mistura para esterilização.
      3. Deixe a mistura esfriar a ~50 °C.
      4. Adicione 25 mL de 1 M KH₂PO₄ (pH = 6), 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de 1 M MgSO₄e 1 mL de colesterol (5 mg/mL em 100% etanol).
      5. Utilizando técnica estéril, despeje a mistura em placas de 6 cm para produzir aproximadamente 100 pratos. As placas de derramamento são mais fáceis se a mistura for transferida pela primeira vez para um béquer estéril de 300 mL.
      6. Deixe 1 dia para solidificar à temperatura ambiente (RT) antes de semear com bactérias ou armazenar a 4 °C.
   2. Semeadura de bactérias OP50 em placas de NGM.
      1. Cresça uma cultura bacteriana OP50 saturada durante a noite em LB a 30 °C ou 37 °C.
      2. Coloque aproximadamente 300 μL da cultura no centro de uma placa NGM de 6 cm.
      3. Deixe as placas secarem na RT por 1-3 dias, conforme necessário para que o gramado bacteriano adera à placa. Em seguida, as placas podem ser usadas ou armazenadas a 4 °C.
2. Cresça os vermes sincronizadamente, isolando ovos recém-colocados (descritos aqui) ou, alternativamente, coletando ovos após dissolver vermes com alvejante.
   1. Transfira aproximadamente 10 vermes adultos gravid para uma placa fresca usando uma picareta de fio de platina. A sincronização de ovos funciona melhor se os adultos estiverem no primeiro dia da vida adulta.
   2. Após aproximadamente 1h, remova os vermes da placa. Isso deve resultar em 40-60 ovos por placa, dependendo das condições e da cepa.

2. Imagem fluorescente de repórteres do HSR

1. Sincronize os worms (seção 1.2) e mantenha a 20 °C até o estágio de desenvolvimento desejado. Para as cepas am446 (hsp-70p::gfp) e CL2070 (hsp-16.2p::gfp) as cepas de repórter fluorescentes, vermes adultos jovens que ainda não atingiram a maturidade reprodutiva são gerados 64 horas após a sincronização de ovos.
   NOTA: O tempo de desenvolvimento varia de acordo com cada cepa e a temperatura em que os vermes são levantados. Ambas as cepas de repórteres da HSR exibem um pequeno atraso no desenvolvimento em relação ao N2. É importante ressaltar que a magnitude da indução de HSR diminui aproximadamente 2-4x após o início da maturidade reprodutiva (ver Discussão).
2. Aqueça os vermes embrulhando placas com filme de parafina e submergindo em um banho de água circulante a 33 °C por 1 h. Uma fina tira de filme de parafina deve ser enrolada 2x ao redor da placa para selar as bordas. Não cubra a parte inferior da placa ou ela pode interferir com a transferência de calor. Submergir as placas de cabeça para baixo usando um rack de tubo de ensaio e um peso de chumbo. Lembre-se de incluir uma amostra de controle negativo (sem choque térmico) se necessário.
   NOTA: Se o filme de parafina não estiver seguro, a água entrará na placa e a placa não deve ser usada para coleta de dados.
3. Recupere os vermes removendo as placas do banho de água e secando com uma toalha de papel. Remova o filme de parafina e incuba os vermes a 20 °C por 6-24 h. Este período de recuperação permite tempo suficiente para síntese de GFP e dobramento antes da imagem.
4. Prepare slides para imagens. Slides devem ser preparados frescos para cada uso.
   1. Faça uma solução de 3% de agarose em água e calor usando um micro-ondas até que a agarose seja dissolvida.
   2. Coloque um slide de microscópio para imagens entre dois outros slides de microscópio que têm uma tira de fita de laboratório sobre eles para criar um espaçador para a almofada de agarose.
   3. Usando uma pipeta de 1.000 μL, coloque uma gota (~150 μL) da 3% aquecida no centro do slide do microscópio.
   4. Cubra imediatamente o slide do microscópio com um slide de microscópio em branco perpendicular ao primeiro slide para que o slide superior repouse na fita de laboratório nos slides adjacentes. Isso espalha a gota de agarose para criar uma almofada de largura uniforme.
   5. Remova cuidadosamente o slide superior.
5. Imobilize os worms usando uma pipeta de 200 μL para adicionar uma pequena gota (~5 μL) de 1 mMm levamisole em tampão M9 ao centro da almofada de agarose. Em seguida, transfira 10 vermes para a gota de levamisole usando uma picareta de fio de platina. Cubra com uma mancha de cobertura. A vedação do deslizamento não é necessária para um microscópio vertical. Opcionalmente, os vermes podem ser alinhados quando ficam paralisados espalhando o levamisole fora, para o lado de fora da almofada de agarose, e alinhando os vermes com uma picareta de fio de platina. Alternativamente, o levamisole pode ser absorvido usando um lenço de laboratório.
   NOTA: Imagem o mais rápido possível, pois a incubação prolongada em levamisole pode alterar a fluorescência.
6. Imagem dos vermes usando um microscópio de fluorescência. Os detalhes da captura de imagem variam de acordo com microscópio e software.
   NOTA: Para comparar diretamente as intensidades da imagem, use configurações de microscópio idênticas em uma sessão de imagem. Evite saturar demais a imagem.

3. Medição da expressão genética HSR usando RT-qPCR

1. Sincronizar worms (seção 1.2) e manter a 20 °C até o estágio de desenvolvimento desejado. Para os vermes N2, vermes adultos jovens que ainda não atingiram a maturidade reprodutiva são gerados 60 h após a sincronização de ovos.
   NOTA: O tempo de desenvolvimento varia de acordo com cada cepa e a temperatura em que os vermes são levantados. É importante ressaltar que a magnitude da indução de HSR diminui aproximadamente 2-4x após o início da maturidade reprodutiva (ver Discussão).
2. Vermes de choque térmico descritos na etapa 2.2.
3. Tire os pratos do banho de água, remova o filme de parafina e colete imediatamente os vermes. Os vermes podem ser coletados lavando as placas suavemente com 1 mL de M9, coletando o líquido em um tubo de microcentrífuga e, em seguida, removendo o M9 após centrifugação a 400 x g por 1 min.
4. Lise os vermes e purifique o RNA usando extração orgânica.
   1. Adicionar 250 μL de reagente de isolamento de RNA (ver Tabela de Materiais).
   2. Tubos de vórtice à mão para 30 s.
   3. Tubos de vórtice por 20 min a 4 °C usando um acessório de tubo de microcentrífuga (ver Tabela de Materiais).
   4. Adicione 50 μL de clorofórmio.
   5. Vórtice para 30 s.
   6. Incubar as amostras na RT por 3 minutos.
   7. Centrífuga a ≥14.000 x g para 15 min a 4 °C.
   8. Transfira a camada aquosa (ou seja, camada superior, ~125 μL) para um novo tubo de microcentrifuge.
      NOTA: Evite a camada orgânica e o material na interface.
   9. Adicione 50 μL de clorofórmio.
   10. Vórtice para 30 s.
   11. Incubar as amostras na RT por 3 minutos.
   12. Centrífuga a ≥14.000 x g por 5 min a 4 °C.
   13. Transfira a camada aquosa (~100 μL) para um novo tubo de microcentrifuagem.
       NOTA: Evite a camada orgânica e o material na interface.
   14. RNA precipitado com um volume igual (ou seja, 100 μL) de isopropanol.
   15. Incubar a -20 °C por pelo menos 30 min, mas de preferência durante a noite.
       NOTA: O experimento pode ser pausado aqui e o RNA pode ser armazenado a -20 °C.
   16. Pelota o RNA por centrifugação a ≥14.000 x g para ≥30 min a 4 °C.
   17. Remova o máximo possível do supernante sem perturbar a pelota.
       NOTA: A pelota será pequena e pode não ser visível. A pelota pode não aderir firmemente ao lado do tubo, por isso é necessário cautela para evitar deslocá-la.
   18. Lave a pelota com 250 μL de 70% de etanol gelado feito com H₂O sem RNase.
   19. Centrífuga a ≥14.000 x g para ≥5 min a 4 °C.
   20. Remova o máximo de supernasce possível sem perturbar a pelota.
   21. Faça uma rotação rápida no RT para remover qualquer etanol restante de 70%.
   22. Seque a pelota deixando os tubos abertos na RT o tempo necessário; tipicamente, pelo menos 20 min. Os tubos podem ser cobertos com um tecido livre de fiapos ou folha de alumínio para evitar contaminação.
   23. Resuspend a pelota em 20 μL de RNase-free H₂O.
   24. Determine a concentração de RNA usando um pequeno espectrofotômetro de volume (2 μL).
       NOTA: O experimento pode ser pausado aqui e o RNA pode ser temporariamente armazenado a menos de -20 °C.
5. Remova o DNA residual incubando com dNase I. Recomenda-se usar um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) e seguir as instruções do fabricante.
   1. Com este kit, prepare uma reação de 20 μL com 500 ng de RNA e 1 μL de DNase I em um banho de água de 37 °C por 30 min.
   2. Adicione 2,5 μL de reagente de inativação DNase (incluído no kit) a cada amostra e incubar em RT por 5 minutos com movimentos/vórtices ocasionais.
   3. Gire a 14.000 x g por 2 min.
   4. Sem perturbar a pelota branca, transfira 15 μL de supernante para um microtubo fresco para síntese de CDNA.
6. Conduzir a síntese cDNA. Recomenda-se usar um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) e seguir as instruções do fabricante.
   1. Com o kit, prepare uma reação de 20 μL com 15 μL de RNA tratado por DNase da etapa anterior e 1 μL de transcriptase reversa.
   2. Use o seguinte programa para síntese de cDNA: 25 °C para 5 min, 46 °C para 20 min, 95 °C para 1 min, 4 °C de espera.
   3. Diluir cDNA adicionando 80 μL de H 2 O sem RNase_diretamenteà amostra.
   4. Brevemente vórtice, em seguida, gire para baixo e armazene a -20 °C até que seja necessário.
7. Executar qPCR. Recomenda-se usar um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) e seguir as instruções do fabricante.
   1. Com o kit, prepare uma reação de 25 μL contendo 2 μL de cDNA e 200 nM (cada) de primers dianteiros e invertidos em um poço de uma placa de 96 poços.
   2. Sequências de primer para medir os genes de choque térmico, hsp-70 e hsp-16.2, e 18S rRNA (para um controle de normalização) estão listadas na Tabela de Materiais. Múltiplos controles de normalização podem ser usados conforme desejado.
   3. Diluir amostras de cDNA 50x antes da medição de 18S para garantir que o ensaio esteja na faixa linear. As condições apropriadas de qPCR variam de acordo com o kit e os primers utilizados (ver Resultados Representativos).
   4. Use um sistema de detecção de PCR em tempo real (ver Tabela de Materiais) para qPCR com 40 ciclos de 95 °C para denaturação de 5 s, 58 °C para 30 s de ressaramento e 72 °C para extensão de 30 s.
      NOTA: As temperaturas de ressarcial ideais podem variar de acordo com os primers e condições.
   5. Quantifique usando o ΔΔCt ou o método de curva padrão¹².

4. Ensaio de termorecoveria para medir hsr no nível organismo

1. Sincronize os worms (seção 1.2) e mantenha a 20 °C até o estágio de desenvolvimento desejado. Para os vermes N2, vermes adultos jovens que ainda não atingiram a maturidade reprodutiva são gerados 60 h após a sincronização de ovos.
   NOTA: O tempo de desenvolvimento varia de acordo com cada cepa e a temperatura em que os vermes são levantados. É importante ressaltar que a magnitude da indução de HSR diminui aproximadamente 2-4x após o início da maturidade reprodutiva (ver Discussão).
2. Choque térmico dos vermes como descrito na etapa 2.2 por 6 h.
3. Retire as placas do banho de água, remova o filme de parafina e permita que os vermes se recuperem por incubação a 20 °C por 48 h.
4. Conte o número de vermes que podem imediatamente rastejar para longe após a estimulação mecânica sem movimento de carne seca ou paralisia.
   NOTA: A incubação de 6 h é ideal para examinar condições que reduzem a diversidade, mas podem ser necessários tempos de exposição mais longos para procurar condições que melhorem a diversidade.

Usando os protocolos descritos neste manuscrito, a indução de HSR foi medida usando repórteres fluorescentes, RT-qPCR, e ensaios de termorecovery. Em cada caso, o procedimento na seção 1.2 foi utilizado para gerar vermes adultos jovens sincronizados que não atingiram a maturidade reprodutiva.

Para visualizar a indução de HSR no nível celular, foram analisadas as cepas de repórter fluorescente AM446 (hsp-70p::gfp) e CL2070(hsp-16.2p::gfp)as cepas de repórter fluorescentes após a seção 2 do protocolo. Nas amostras de controle negativo sem choque térmico, o repórter hsp-16.2 só mostrou autofluorescência normal, mas o repórter hsp-70 teve fluorescência constitutiva no músculo depressor anal como relatado anteriormente4 (Figura 1A). Após 1h de choque térmico a 33 °C, foi observada fluorescência robusta em ambos os repórteres; no entanto, o padrão de expressão foi distinto dependendo de qual repórter foi utilizado(Figura 1B). O repórter hsp-70 era mais brilhante no intestino e espermatozoide, enquanto o repórter hsp-16.2 era mais brilhante na faringe. Além disso, o repórter hsp-16.2 tinha um alto grau de variabilidade worm-to-worm na quantidade de indução como descrito anteriormente, mas o repórter hsp-70 não13.

Uma variação comumente usada da seção 2 é realizar o choque térmico em uma incubadora seca em vez de um banho de água circulante. Por isso, também foi testada a diferença entre as duas metodologias. Verificou-se que ambos os protocolos resultaram em indução robusta dos dois repórteres fluorescentes usando nossas condições, embora um banho de água circulante seja recomendado como uma melhor prática (ver Discussão) (Figura 1B).

Para testar a dependência dos repórteres no fator de transcrição HSF-1, a alimentação RNAi foi usada para derrubar o HSF-1 antes da indução do repórter ser medida. Verificou-se que a fluorescência de ambas as cepas foi severamente reduzida após o knockdown do HSF-1, indicando que esses repórteres são dependentes de HSF-1, conforme descrito na literatura4 (Figura 2). No entanto, observou-se também que a fluorescência faringeal persistiu em ambos os repórteres sobre o knockdown hsf-1, o que é consistente com relatos anteriores de que o músculo faringeal é resistente ao RNAi por alimentação14.

Para quantificar a indução total do verme do HSR no nível molecular, dois HSPs endógenos foram medidos com RT-qPCR usando a seção 3 do protocolo. As amostras foram medidas em triplicado, uma curva padrão foi gerada para cada um dos primers, e uma curva de derretimento foi analisada para cada amostra para controle de qualidade. Verificou-se que um choque térmico de 33 °C por 1 h resultou em um aumento de mais de 2.000x na expressão relativa para dois genes de choque térmico, hsp-70 e hsp-16.2 (Figura 3). Estes resultados mostram que ambos os genes endógenos são adequados para medir a indução de HSR e que um choque térmico de 33 °C por 1 h é suficiente para gerar uma resposta substancial. No entanto, deve-se ter cuidado na interpretação do grau absoluto de indução do choque térmico, pois os níveis de mRNA na ausência de choque térmico são muito baixos.

Para analisar uma resposta fisiológica ao choque térmico, um ensaio de termorecoveria organismo foi testado usando a seção 4 do protocolo. Verificou-se que a exposição de vermes a um choque térmico de 6h a 33 °C levou a uma redução de 20% nos vermes com movimento normal após uma recuperação de 48 horas(Figura 4A). A dependência deste ensaio sobre o fator de transcrição HSF-1 foi testada usando a alimentação RNAi para derrubar hsf-1 antes de expor os vermes ao estresse. Verificou-se que o knockdown do hsf-1 causou uma queda drástica no movimento normal, com >95% dos vermes mostrando movimento ou paralisia depois de serem empurrados com uma picareta de fio de platina.

Comparamos este ensaio de termarreceridade com um ensaio organismoal alternativo amplamente utilizado comumente referido como termotolerância. No ensaio termotolerância, os vermes são expostos a uma temperatura contínua de 35 °C usando uma incubadora seca, e a porcentagem de vermes vivos são medidos em vários pontos de tempo. Utilizando este ensaio, verificou-se que vermes de controle continuamente expostos a 35 °C morreram após aproximadamente 8h de exposição(Figura 4B). No entanto, quando a dependência deste ensaio no HSF-1 foi testada por nocaute rnai, verificou-se que a inibição do hsf-1 não causou uma diminuição na termotolerância. Resultados semelhantes foram mostrados anteriormente usando mutações HSF-1 (ver Discussão). Portanto, o uso do ensaio termotolerância para medir o HSR não é recomendado, e a termanceridade é o método preferido para examinar o HSR no nível do organismo.

Figura 1: Indução de HSR medida com repórteres fluorescentes. (A) A expressão basal e (B) indutível de calor de hsp-70p::gfp e hsp-16.2p::gfp repórter cepa após 1h de choque térmico a 33 °C em banho de água ou incubadora. Os vermes foram criados em bactérias OP50 por 64 h, o calor chocou e depois recuperou-se a 20 °C por 8 h antes da imagem. Para referência, os vermes de choque térmico em (A) foram renormalizados em (B) para corresponder ao alcance e saturação dos vermes chocados pelo calor. Imagens representativas de duas réplicas experimentais são mostradas. Barra de escala = 250 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A indução de HSR medida com repórteres fluorescentes depende do HSF-1. As cepas contendo as placas hsp-70p::gfp e hsp-16.2p::gfp repórteres foram elevadas no controle (vetor vazio L4440) ou placas hsf-1 RNAi por 64 h, expostas a um choque térmico de 1h a 33 °C em um banho de água, e depois recuperadas a 20 °C por 8h antes da imagem. Imagens representativas de duas réplicas experimentais são mostradas. Barra de escala = 250 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Indução de HSR medida com RT-qPCR. Os vermes N2 foram criados em bactérias HT115 por 60 h e, em seguida, o calor chocou por 1 h em um banho de água de 33 °C. Os níveis relativos de mRNA de hsp-70 (C12C8.1) e hsp-16.2 são mostrados normalizados para o controle sem choque térmico. Os valores traçados são a média de quatro réplicas biológicas e as barras de erro representam ± SEM. A significância estatística foi calculada utilizando-se o teste t de um aluno não remunerado. **p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: A diversidade, mas não a termotolerância, depende do HSF-1. Os vermes N2 foram levantados no controle (L4440) ou placas hsf-1 RNAi por 60 h e depois deslocados para: (A) Um banho de água de 33 °C por 6h e recuperado a 20 °C por 48 h antes de marcar para o movimento normal (thermorecovery), ou (B) Uma incubadora seca de 35 °C e removida a cada 2h até morrer (termotolerance). Cada ensaio foi feito com n ≥ 30 indivíduos em 2 dias independentes. A média é mostrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.