Descrito aqui é um protocolo para a determinação de quatro metabólitos triptofanos diferentes gerados na via kynurenine (kynurenine, 3-hidroxikynurenine, ácido xanthurenic, ácido 3-hidroxyanthranilic) no meio coletado de culturas de células cancerosas analisadas por cromatografia líquida acoplada com uma única espectrometria de massa quadrupole.
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Artigo de método
Quantificação simultânea de kynureninas selecionadas analisadas por espectrometria de cromatografia líquida-massa em média coletada de culturas celulares cancerosas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O caminho da kynurenine e os catabólitos do triptofano chamados kynurenines têm recebido maior atenção por seu envolvimento na regulação imunológica e biologia do câncer. Um ensaio de cultura in vitro é frequentemente usado para aprender sobre a contribuição de diferentes catabólitos triptofanos em um mecanismo de doença e para testar estratégias terapêuticas. O meio de cultura celular rico em metabólitos secretos e moléculas de sinalização reflete o status do metabolismo triptofano e outros eventos celulares. Novos protocolos para a quantificação confiável de múltiplas kynureninas no complexo meio de cultura celular são desejados para permitir uma análise confiável e rápida de múltiplas amostras. Isso pode ser realizado com cromatografia líquida aliada à espectrometria de massa. Esta poderosa técnica é empregada em muitos laboratórios clínicos e de pesquisa para quantificação de metabólitos e pode ser usada para medir kynurenines.
Apresentado aqui é o uso de cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa quadrupole única (LC-SQ) para a determinação simultânea de quatro kynurenines, ou seja, kynurenine, 3-hidroxikynurenine, 3-hidroxyanthranilic, e ácido xanturnic no meio coletado de células cancerígenas in vitro cultivadas. O detector SQ é simples de usar e menos caro em comparação com outros espectrômetros de massa. Na análise SQ-MS, vários íons da amostra são gerados e separados de acordo com sua relação massa-carga específica(m/z),seguida pela detecção usando um modo de Monitoramento de Íons Únicos (SIM).
Este artigo chama a atenção sobre as vantagens do método relatado e indica alguns pontos fracos. É focado em elementos críticos da análise LC-SQ, incluindo preparação de amostras, juntamente com cromatografia e análise de espectrometria de massa. Também são discutidas as condições de controle de qualidade, as condições de calibração do método e os problemas de efeito matricial. Descrevemos uma simples aplicação de 3-nitrotyrosina como um padrão analógico para todos os analitos alvo. Como confirmado por experimentos com ovário humano e células cancerígenas de mama, o método LC-SQ proposto gera resultados confiáveis e pode ser ainda mais aplicado a outros modelos celulares in vitro.
Introdução
O caminho de kynurenine (KP) é a principal rota do catabolismo triptofano (Trp) em células humanas. Indoleamina-2,3-dioxygenase (IDO-1) em células extrahêspticas é a primeira enzima limitante de KP e converte Trp em N-formylkynurenine1. Outros passos dentro do KP geram outros metabólitos secundários, ou seja, kynurenines que exibem várias propriedades biológicas. Kynurenine (Kyn) é o primeiro catabólito Trp estável que mostra propriedades tóxicas e regula eventos celulares após a ligação ao receptor de hidrocarbonetos aryl (AhR)2. Posteriormente, Kyn é transformado em várias moléculas espontaneamente ou nos processos med....
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Protocolo
1. Preparação das soluções de estoque padrão 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standard
- Pesar os reagentes em um frasco com a maior precisão (0,3 mg cada). Para melhor precisão, dimensione os reagentes, ajustando o volume do solvente de acordo com a etapa 1.2.
- Dissolver os reagentes em 300 μL do solvente para obter uma solução de estoque de 1 g/L. Dissolver 3NT em 1% (v/v) ácido fórmico (FA) na água; Kyn, 3HAA e XA em sulfóxido de dimetil (DMSO); 3HKyn em água acidificada para pH 2.5 com ácido clorídrico (HCl).
ATENÇÃO: 3HAA irrita olhos, nariz, garganta e pulmões. É prejudicial quando inalado, em contato com a pele, e se engolido. Use proteção apropria....
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Resultados
A LC-MS apresenta vantagens indiscutíveis na quantificação de moléculas biologicamente ativas, embora alguns componentes de espécimes complexos causem os chamados efeitos matriciais e comprometam a ionização dos analitos. Leva à supressão de íons ou ao aprimoramento de íons, diminuindo fortemente a precisão e afetando um limite de detecção/quantificação de LC-MS, que é considerado como um ponto ''fraco' do método. Em nosso protocolo, os íons são gerados pela ionização eletrospray (ESI) no modo positivo, que também foi em.......
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Discussão
Este artigo apresenta um protocolo LC-SQ detalhado para a quantificação simultânea de quatro principais metabólitos Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) que são medidos em um meio a partir de células cancerígenas humanas in vitro cultivadas. Atenção especial é dada à preparação da amostra, procedimento de espectrometria cromatográfica/de massa e interpretação dos dados, os pontos mais importantes dentro da análise.
Em geral, a análise da LC-MS, devido à alta sensibilidade, requer os mais altos .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela União Europeia do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional no âmbito do Programa Operacional Desenvolvimento da Polônia Oriental 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), pela Faculdade de Biotecnologia e Ciências Ambientais da Universidade Católica John Paul II de Lublin (Young Scientists grant for Ilona Sadok), Centro Nacional de Ciências Poloneses, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 para Magdalena Staniszewska, Pesquisadora-Princípio). Os autores agradecem ao Prof. Agnieszka Ścibior, do Laboratório de Estresse Oxidativo, Centro de Pesquisa Interdisciplinar, JPII CUL por compartilhar os equipamentos para cultivo celular e quantificação de pro....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 3-hidroksy-DL-kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
| Ácido 3-hidroxiantranílico | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
| 3-nitro-L-tirosina | Sigma-Aldrich | N7389 | |
| Acetonitrila | Supelco | 1.00029 | hipergrade para LC-MS LiChrosolv |
| Carvão ativado | Supelco | 05105 | pó |
| Balança analítica | Ohaus | ||
| Coluna analítica | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 resolução rápida HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µ m) |
| de formato de amônio | Supelco | 7022 | para LC-MS, LiChropur, ≥ 99,0% |
| Albumina | Sigma | 1001887398 | |
| Caps para frascos cromatográficos | Agilent Technologies | 5185-5820 | tampas de rosca azul, PTFE / vermelho sil sepa |
| Placa de cultura de células | Ninho | 704004 | poliestireno, não pirogênico, estéril |
| Placa de cultura de células | Biologix | 07-6012 | 12 poços, não pirogênico, não citóxico, estéril |
| Incubadora de células | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Centrífuga | Eppendorf | modelo 5415R | |
| Centrífuga | Eppendorf | modelo 5428 | |
| Tubos de centrífuga | Bionovo | B-2278 | Tipo Eppendorf, 1,5 mL |
| Tubos de centrífuga | Bionovo | B-3693 | Tipo Falcon, 50 mL, PP |
| Dados cromatográficos software de aquisição e análise | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
| Frascos de inserção cromatográfica | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µ L |
| Frascos cromatográficos | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, vidro transparente |
| Dimetilsulfóxido | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
| Dubelcco' s Águia Modificada' s Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
| Medidor duplo pH/condutividade | Mettler Toledo | SevenMulti | |
| Evaporator | Genevac | modelo EZ-2.3 Elite | |
| Fetal soro bovino | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Ácido fórmico | Supelco | 5.33002 | para LC-MS LiChropur |
| Frasco de vidro para armazenamento de | reagentesBionovo | S-2070 | 50 mL, coluna de proteção de vidro transparente |
| Agilent | Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Coluna de Proteção de Furo Estreito (2.1 x 12.5 mm, 5 µ m) |
| Ácido clorídrico | Merck | 1.00317.1000 | |
| L-quinurenina | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥ 98% (HPLC) |
| Agitador magnético | Wigo | ES 21 H | |
| Microbalança | Mettler Toledo | modelo XP6 | |
| Sistema Milli-Q | Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV com bomba |
| Espectrômetro de massa quadrupolo | Agilent Technologies | G1948B | modelo 6120 |
| Penicilina-estreptomicina | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
| Leitor de placas | Bio Tek | Synergy 2 operado por Gen5 | |
| Cloreto de potássio | Merck | 1.04936.1000 | |
| Di-hidrogenofosfato de potássio | Merck | 1.05108.0500 | |
| Ensaio de proteína Concentrado de reagente de corante | BioRad | 500-0006 | |
| Balancim de gangorra | Stuart | SSL4 | |
| Pipeta sorológica | Nest | 326001 | 5 mL, poliestireno, não pirogênico, estéril |
| Cloreto de sódio | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Fosfato de sódio dibásico | Merck | 1.06346.1000 | |
| Filtro de entrada de solvente | Agilent Technologies | 5041-2168 | filtro de vidro, 20 μ m tamanho do poro |
| Reservatório de solvente (para LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, vidro transparente |
| Reservatório de solvente (para LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, vidro âmbar |
| Programa de planilha | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
| Barra de agitação | Bionovo | 6-2003 | revestido de teflon |
| Filtros de seringa para cultura filtração média | Bionovo | 7-8803 | celulose regenerada, Ø 30 mm, 0,45 µ m |
| Filtros de seringa para filtração de componentes de fase móvel | Bionovo | 6-0018 | nylon, Ø 30 mm, 0,22 µ m |
| Placas de cultura de tecidos | VWR | 10062-900 | 96 poços, estéril |
| Solução de tripsina-EDTA | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
| Sistema de cromatografia líquida de ultra-alto desempenho | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 O sistema Infinity consistia em amostrador automático (G1367D), desgaseificador (G1379B), bomba binária (G1312B), termostato de coluna (G1316C) |
| Banho de ultrassom | Polsonic | 104533 | modelo 6D |
| Vortex | Biosan | modelo V-1 mais | |
| ácido xanturênico | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |
Referências
- Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
- Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immun....
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Reimpressões e permissões
