Quantificação simultânea de kynureninas selecionadas analisadas por espectrometria de cromatografia líquida-massa em média coletada de culturas celulares cancerosas

Summary

Descrito aqui é um protocolo para a determinação de quatro metabólitos triptofanos diferentes gerados na via kynurenine (kynurenine, 3-hidroxikynurenine, ácido xanthurenic, ácido 3-hidroxyanthranilic) no meio coletado de culturas de células cancerosas analisadas por cromatografia líquida acoplada com uma única espectrometria de massa quadrupole.

Abstract

O caminho da kynurenine e os catabólitos do triptofano chamados kynurenines têm recebido maior atenção por seu envolvimento na regulação imunológica e biologia do câncer. Um ensaio de cultura in vitro é frequentemente usado para aprender sobre a contribuição de diferentes catabólitos triptofanos em um mecanismo de doença e para testar estratégias terapêuticas. O meio de cultura celular rico em metabólitos secretos e moléculas de sinalização reflete o status do metabolismo triptofano e outros eventos celulares. Novos protocolos para a quantificação confiável de múltiplas kynureninas no complexo meio de cultura celular são desejados para permitir uma análise confiável e rápida de múltiplas amostras. Isso pode ser realizado com cromatografia líquida aliada à espectrometria de massa. Esta poderosa técnica é empregada em muitos laboratórios clínicos e de pesquisa para quantificação de metabólitos e pode ser usada para medir kynurenines.

Apresentado aqui é o uso de cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa quadrupole única (LC-SQ) para a determinação simultânea de quatro kynurenines, ou seja, kynurenine, 3-hidroxikynurenine, 3-hidroxyanthranilic, e ácido xanturnic no meio coletado de células cancerígenas in vitro cultivadas. O detector SQ é simples de usar e menos caro em comparação com outros espectrômetros de massa. Na análise SQ-MS, vários íons da amostra são gerados e separados de acordo com sua relação massa-carga específica(m/z),seguida pela detecção usando um modo de Monitoramento de Íons Únicos (SIM).

Este artigo chama a atenção sobre as vantagens do método relatado e indica alguns pontos fracos. É focado em elementos críticos da análise LC-SQ, incluindo preparação de amostras, juntamente com cromatografia e análise de espectrometria de massa. Também são discutidas as condições de controle de qualidade, as condições de calibração do método e os problemas de efeito matricial. Descrevemos uma simples aplicação de 3-nitrotyrosina como um padrão analógico para todos os analitos alvo. Como confirmado por experimentos com ovário humano e células cancerígenas de mama, o método LC-SQ proposto gera resultados confiáveis e pode ser ainda mais aplicado a outros modelos celulares in vitro.

Introduction

O caminho de kynurenine (KP) é a principal rota do catabolismo triptofano (Trp) em células humanas. Indoleamina-2,3-dioxygenase (IDO-1) em células extrahêspticas é a primeira enzima limitante de KP e converte Trp em N-formylkynurenine¹. Outros passos dentro do KP geram outros metabólitos secundários, ou seja, kynurenines que exibem várias propriedades biológicas. Kynurenine (Kyn) é o primeiro catabólito Trp estável que mostra propriedades tóxicas e regula eventos celulares após a ligação ao receptor de hidrocarbonetos aryl (AhR)². Posteriormente, Kyn é transformado em várias moléculas espontaneamente ou nos processos med....

Protocol

1. Preparação das soluções de estoque padrão 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standard

1. Pesar os reagentes em um frasco com a maior precisão (0,3 mg cada). Para melhor precisão, dimensione os reagentes, ajustando o volume do solvente de acordo com a etapa 1.2.
2. Dissolver os reagentes em 300 μL do solvente para obter uma solução de estoque de 1 g/L. Dissolver 3NT em 1% (v/v) ácido fórmico (FA) na água; Kyn, 3HAA e XA em sulfóxido de dimetil (DMSO); 3HKyn em água acidificada para pH 2.5 com ácido clorídrico (HCl).
   ATENÇÃO: 3HAA irrita olhos, nariz, garganta e pulmões. É prejudicial quando inalado, em contato com a pele, e se engolido. Use proteção apropria....

Results

A LC-MS apresenta vantagens indiscutíveis na quantificação de moléculas biologicamente ativas, embora alguns componentes de espécimes complexos causem os chamados efeitos matriciais e comprometam a ionização dos analitos. Leva à supressão de íons ou ao aprimoramento de íons, diminuindo fortemente a precisão e afetando um limite de detecção/quantificação de LC-MS, que é considerado como um ponto ''fraco' do método. Em nosso protocolo, os íons são gerados pela ionização eletrospray (ESI) no modo positivo, que também foi em.......

Discussion

Este artigo apresenta um protocolo LC-SQ detalhado para a quantificação simultânea de quatro principais metabólitos Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) que são medidos em um meio a partir de células cancerígenas humanas in vitro cultivadas. Atenção especial é dada à preparação da amostra, procedimento de espectrometria cromatográfica/de massa e interpretação dos dados, os pontos mais importantes dentro da análise.

Em geral, a análise da LC-MS, devido à alta sensibilidade, requer os mais altos .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-hidroksy-DL-kynurenina	Sigma-Aldrich	H1771
Ácido 3-hidroxiantranílico	Sigma-Aldrich	148776	97%
3-nitro-L-tirosina	Sigma-Aldrich	N7389
Acetonitrila	Supelco	1.00029	hipergrade para LC-MS LiChrosolv
Carvão ativado	Supelco	05105	pó
Balança analítica	Ohaus
Coluna analítica	Agilent Technologies	959764-902	Zorbax Eclipse Plus C18 resolução rápida HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µ m)
de formato de amônio	Supelco	7022	para LC-MS, LiChropur, ≥ 99,0%
Albumina	Sigma	1001887398
Caps para frascos cromatográficos	Agilent Technologies	5185-5820	tampas de rosca azul, PTFE / vermelho sil sepa
Placa de cultura de células	Ninho	704004	poliestireno, não pirogênico, estéril
Placa de cultura de células	Biologix	07-6012	12 poços, não pirogênico, não citóxico, estéril
Incubadora de células	Thermo Fisher Scientific		HERAcell 150i
Centrífuga	Eppendorf		modelo 5415R
Centrífuga	Eppendorf		modelo 5428
Tubos de centrífuga	Bionovo	B-2278	Tipo Eppendorf, 1,5 mL
Tubos de centrífuga	Bionovo	B-3693	Tipo Falcon, 50 mL, PP
Dados cromatográficos software de aquisição e análise	Agilent Technologies		LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Frascos de inserção cromatográfica	Agilent Technologies	9301-1387	100 µ L
Frascos cromatográficos	Agilent Technologies	5182-0714	2 mL, vidro transparente
Dimetilsulfóxido	Supelco	1.02950	Uvasol
Dubelcco' s Águia Modificada' s Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-41450
Medidor duplo pH/condutividade	Mettler Toledo		SevenMulti
Evaporator	Genevac		modelo EZ-2.3 Elite
Fetal soro bovino	Sigma-Aldrich	F9665
Ácido fórmico	Supelco	5.33002	para LC-MS LiChropur
Frasco de vidro para armazenamento de	reagentesBionovo	S-2070	50 mL, coluna de proteção de vidro transparente
Agilent	Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse Plus-C18 Coluna de Proteção de Furo Estreito (2.1 x 12.5 mm, 5 µ m)
Ácido clorídrico	Merck	1.00317.1000
L-quinurenina	Sigma-Aldrich	K8625	≥ 98% (HPLC)
Agitador magnético	Wigo		ES 21 H
Microbalança	Mettler Toledo		modelo XP6
Sistema Milli-Q	Millipore	ZRQSVPO30	Direct-Q 3 UV com bomba
Espectrômetro de massa quadrupolo	Agilent Technologies	G1948B	modelo 6120
Penicilina-estreptomicina	Sigma-Adrich	048M4874V
Leitor de placas	Bio Tek		Synergy 2 operado por Gen5
Cloreto de potássio	Merck	1.04936.1000
Di-hidrogenofosfato de potássio	Merck	1.05108.0500
Ensaio de proteína Concentrado de reagente de corante	BioRad	500-0006
Balancim de gangorra	Stuart	SSL4
Pipeta sorológica	Nest	326001	5 mL, poliestireno, não pirogênico, estéril
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Fosfato de sódio dibásico	Merck	1.06346.1000
Filtro de entrada de solvente	Agilent Technologies	5041-2168	filtro de vidro, 20 μ m tamanho do poro
Reservatório de solvente (para LC-MS)	Agilent Technologies	9301-6524	1 L, vidro transparente
Reservatório de solvente (para LC-MS)	Agilent Technologies	9301-6526	1 L, vidro âmbar
Programa de planilha	Microsoft Office		Microsoft Office Excel
Barra de agitação	Bionovo	6-2003	revestido de teflon
Filtros de seringa para cultura filtração média	Bionovo	7-8803	celulose regenerada, Ø 30 mm, 0,45 µ m
Filtros de seringa para filtração de componentes de fase móvel	Bionovo	6-0018	nylon, Ø 30 mm, 0,22 µ m
Placas de cultura de tecidos	VWR	10062-900	96 poços, estéril
Solução de tripsina-EDTA	Sigma-Aldrih	T4049-100 mL
Sistema de cromatografia líquida de ultra-alto desempenho	Agilent Technologies	G1367D, G1379B, G1312B, G1316C	1200 O sistema Infinity consistia em amostrador automático (G1367D), desgaseificador (G1379B), bomba binária (G1312B), termostato de coluna (G1316C)
Banho de ultrassom	Polsonic	104533	modelo 6D
Vortex	Biosan		modelo V-1 mais
ácido xanturênico	Sigma-Aldrich	D120804	96%