Usando citometria de fluxo para detectar e quantificar a formação sanguínea alterada no zebrafish em desenvolvimento

Resumo

Este ensaio é um método simples para quantificar células hematopoiéticas no desenvolvimento de zebrafish embrionário. As células sanguíneas de zebrafish dissociados são submetidas à análise de citometria de fluxo. Isso permite a detecção de defeitos sanguíneos em animais mutantes e após modificação genética.

Resumo

A diversidade de linhagens celulares que compõem sangue maduro em animais vertebrados decorre da diferenciação de células hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs). Este é um processo crítico que ocorre ao longo da vida útil dos organismos, e a interrupção das vias moleculares envolvidas durante a embriogênese pode ter consequências catastróficas a longo prazo. Por uma infinidade de razões, o zebrafish (Danio rerio) tornou-se um organismo modelo para estudar hematopoiese. Os embriões de zebrafish desenvolvem-se externamente, e em 7 dias a pós-fertilização (dpf) produziram a maioria dos subtipos de células sanguíneas definitivas que persistirão por toda a vida. Foram desenvolvidos ensaios para avaliar o número de células hematopoiéticas, utilizando principalmente manchas histológicas específicas, técnicas de hibridização in situ e microscopia de animais transgênicos que utilizam promotores específicos de células sanguíneas que conduzem a expressão de proteínas fluorescentes. No entanto, a maioria dos ensaios de coloração e técnicas de hibridização in situ não quantificam com precisão o número de células sanguíneas presentes; apenas grandes diferenças nos números de células são facilmente visualizadas. A utilização de animais transgênicos e a análise de indivíduos com microscopia fluorescente ou confocal podem ser realizadas, mas a quantitação desses ensaios depende da contagem manual ou do uso de softwares de imagem caros, ambos podem cometer erros. O desenvolvimento de métodos adicionais para avaliar o número de células sanguíneas seria econômico, mais rápido, e poderia até mesmo ser automatizado para avaliar rapidamente o efeito da modificação genética mediada pelo CRISPR, a redução da transcrição mediada por morfolino e o efeito de compostos medicamentosos que afetam a hematopoiese em larga escala. Este novo ensaio para quantificar as células sanguíneas é realizado pela dissociação de embriões inteiros de zebrafish e pela análise da quantidade de células sanguíneas fluorescentes rotuladas presentes. Esses ensaios devem permitir a elucidação de vias moleculares responsáveis pela geração, expansão e regulação das células sanguíneas durante a embriogênese, o que permitirá aos pesquisadores descobrir ainda mais novos fatores alterados durante doenças sanguíneas, bem como caminhos essenciais durante a evolução da hematopeiese vertebrada.

Introdução

A produção de sangue (hematopoiese) é um processo de desenvolvimento essencial que começa primeiro no embrião inicial. Esse processo começa gerando glóbulos vermelhos primitivos e macrófagos diretamente do mesoderme, e posteriormente muda para a produção de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs). Essas células-tronco, que são multipotentes, geram todas as variedades de células sanguíneas maduras no organismo. Capaz de auto-renovação, o sistema é continuamente reabastecido através desses HSPCs. Enquanto esse processo começa no início do desenvolvimento, a hematopoiese continua para a vida do animal, fornecendo a capacidade de transportar oxigênio para locais distantes do corpo, parar de sangrar após lesões e proteger o corpo de infecções. O desenvolvimento deste complexo sistema é controlado temporal e espacialmente durante o desenvolvimento e qualquer perturbação na produção de células sanguíneas pode ser catastrófica para o organismo, resultando em anemia, trombocitopenia, leucopenia e leucemia.

Um modelo animal popular usado para pesquisa hematopoiética é o zebrafish (Danio rerio) porque eles têm desenvolvimento sanguíneo semelhante quando comparados aos humanos. Na verdade, muitos dos genes e vias moleculares usados durante a hematopoiese são conservados ao longo da evolução dos vertebrados, permitindo-nos aprender sobre genes humanos estudando zebrafish. É importante ressaltar que os embriões de zebrafish se desenvolvem fora do corpo e em 7 dias geraram a maioria dos tipos de células sanguíneas maduras, permitindo a visualização direta do sistema hematopoiético em um curto espaço de tempo. Os zebrafish também são extremamente fecundos, o que permite aos pesquisadores observar um número maior de amostras em um curto espaço de tempo, o que também é importante para a geração de dados reprodutíveis. O tempo de curta geração e o desenvolvimento externo do zebrafish proporcionam uma manipulação e observação mais fáceis durante os estudos de mutagênese^1,2,3,4,5 e triagem de medicamentos^6,7,8,9,10. Isso permite que um painel de compostos terapêuticos promissores para distúrbios sanguíneos humanos seja testado de forma rápida e eficiente.

É importante ressaltar que os zebrafish também são geneticamente favoráveis, e o genoma é sequenciado e anotado. Essa tratobilidade permite que técnicas de genética reversa, como o knockdown mediado por morpholino e ablação genética mediada pelo CRISPR sejam realizadas. Os zebrafish também provaram sua utilidade como modelo para realizar telas genéticas avançadas; muitos genes e caminhos essenciais envolvidos na formação de sangue de vertebrados foram descobertos desta maneira. Numerosos métodos de observação de células sanguíneas também foram desenvolvidos em zebrafish. Embora existam técnicas tradicionais de coloração histológica, também é possível realizar hibridização in situ para transcrições específicas do sangue. É importante ressaltar que existem numerosas linhas transgênicas de peixes pelas quais as proteínas fluorescentes são expressas por promotores específicos da linhagem, permitindo a rotulagem de células sanguíneas específicas com proteínas fluorescentes¹¹. Isso permite que os pesquisadores realizem observação a ponto da gênese das células sanguíneas, expansão e regulação em um organismo vivo ao longo do tempo.

No geral, a conservação do sistema hematopoiético, a presença e o fácil desenvolvimento de linhas transgênicas, fácil visualização e tempo de geração curta tornaram o zebrafish um modelo econômico, rápido e adaptável de hematopoiese. Para melhorar a caixa de ferramentas de técnicas disponíveis para pesquisadores de zebrafish, desenvolvemos este ensaio para quantificar robustamente o número de células sanguíneas em embriões. O método envolve a digestão de animais transgênicos e a realização de citometria de fluxo para células sanguíneas fluorescentes. Desta forma, as células sanguíneas de animais mutantes, o efeito da modificação mo e crispr, e o efeito de pequenas moléculas podem ser analisados quantitativamente de forma rápida e reprodutível. Esses ensaios são formas fáceis de usar e econômicas para enumerar as células sanguíneas, permitindo o exame de sua geração, proliferação e manutenção ao longo do tempo.

Protocolo

O conselho consultivo do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Estadual da Califórnia, Chico, aprovou todos os métodos descritos abaixo.

NOTA: É aconselhável tratar embriões com 1-fenil 2-thiourea (PTU; Tabela 1) em 24 horas de pós-fertilização (hpf) para evitar pigmentação que afeta negativamente a discriminação por fluorescência por citometria de fluxo. Todos os procedimentos listados abaixo são aceitáveis para citometria de fluxo e classificação celular ativada por fluorescência (FACS). No entanto, se o objetivo é cultivar as células hematopoiéticas após o FACS, então adere às práticas estéreis ao processar amostras. O protocolo para branquear e preparar amostras de embriões de forma estéril foi descrito anteriormente¹².

1. Descorionação de embriões de zebrafish de 48 hpf

1. Com embriões (pelo menos 5, mas não mais do que 200 embriões) em uma placa de Petri de plástico de 10 cm, incline a placa para que os embriões afundem até a borda inferior.
   NOTA: É fácil inclinar a placa removendo sua tampa e colocando a tampa sob uma borda da placa de Petri.
2. Retire e descarte o máximo possível de meio E3(Tabela 1) e adicione 500 μL de protease de descorionação (10 mg/mL). Incubar em temperatura ambiente por 5 minutos.
3. Depois de 5 minutos, pegue a placa de Petri (mantendo todos os embriões na borda inferior da placa), e bata suavemente na lateral da placa de Petri, permitindo que os embriões esfreguem suavemente contra a parte inferior da placa para remover completamente os acordes.
4. Com uma garrafa de aperto, adicione ~20 mL de meio E3 para diluir a protease. Permita que os embriões se instalem e removam o meio E3 decantando.
5. Repita o passo 1.4 3x para remover todos os traços da protease de descorionação.
   NOTA: Para cada amostra individual analisar, são necessários pelo menos 5 embriões. Este procedimento de descorção pode acomodar até 200 embriões por placa de Petri. As amostras podem ser agrupadas nesta fase e separadas mais tarde, se desejarem. Alternativamente, a descorção manual pode ser realizada rasgando suavemente os acordes com fórceps do relojoeiro. Isso é vantajoso quando há um pequeno número de embriões. Normalmente, o zebrafish vai eclodir de seus acordes por 72 hpf. Embriões severamente malformados podem, no entanto, e exigirão descorção (manual ou químico) após esse tempo.

2. Preparação de amostras de embriões para dissociação

1. Usando uma pipeta P1000, coloque 5-10 embriões em um único tubo de microcentrifuge de 1,5 mL.
2. Remova o meio E3 com uma pipeta e descarte.
   ATENÇÃO: Pipeta com cuidado, pois os embriões podem ser facilmente descartados durante as seguintes etapas.
3. Adicione 1 mL de dithiothiothreitol de 10 mM (DTT) no meio E3 para remover o revestimento do muco em torno do zebrafish embrionário^11,12,13,14. Coloque o tubo de microcentrifuge horizontalmente e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos.

3. Dissociação do embrião

1. Lave os embriões 3x com 1 mL de salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS) com Ca²⁺ e Mg²⁺ para remover traços de DTT. Após a última lavagem adicione 500 μL de DPBS com Ca²⁺ e Mg²⁺ e 5 μL de 5 mg/mL (26 U/mL) protease de dissociação.
   NOTA: Outras soluções tamponadas isotônicas podem ser usadas, mas devem conter Ca²⁺ e Mg²⁺ para que a enzima dissociação funcione corretamente.
2. Incubar amostras a 37 °C em um agitador orbital horizontal a 185 rpm por 60 min. Embriões triturados com uma pipeta P1000 até que as amostras sejam totalmente dissociadas.
   ATENÇÃO: Tome cuidado para não exagerar nos embriões; algum tecido sólido deve estar presente, e não deve ser completamente homogêneo. É possível exagerar, o que destruirá as células sanguíneas alvo a serem observadas no citômetro de fluxo(Figura Suplementar 1).
   NOTA: Este procedimento funciona melhor para embriões de 48-72 hpf. Estágios posteriores podem exigir maior incubação com protease de dissociação. O tempo para diferentes estágios deve ser determinado empiricamente. Existem métodos alternativos mais rápidos para dissociar tecido embrionário, mas é encontrado empiricamente que este método, embora leve 60 minutos, é suave e minucioso o suficiente para permitir o isolamento eficiente das células hematopoiéticas vivas.

4. Preparação de embriões dissociados para citometria de fluxo

1. Pipeta os 5 embriões dissociados no reservatório superior de um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL com uma tampa de coador celular de 35 μmM.
2. Enxágüe as células adicionando 4 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) sem Ca²⁺ ou Mg²⁺ à tampa do filtro do tubo de poliestireno de 5 mL contendo as células filtradas.
   NOTA: Outras soluções tamponadas isotônicas também podem ser usadas, mas elas devem não ter Ca²⁺ ou Mg²⁺ para diluir e tornar a enzima dissociação ineficaz.
3. Tubos centrífugas a 4 °C e 300 x g por 5 min para pelotar as células. Com uma pipeta, remova e descarte o supernaspeso. Resuspense as células em 500 μL de PBS (sem Ca²⁺ ou Mg²⁺).

5. Citometria de fluxo

1. Vórtice suavemente da suspensão celular e adicione 1:1.000 mancha de célula morta vermelha(Tabela de Materiais).
   NOTA: A mancha de célula morta vermelha é um corante permeável celular que permite a exclusão de células mortas e detritos de células-alvo e é uma excelente escolha de corante para discriminação de células mortas, pois é animado pelo laser de 633 nm, que é diferente do laser de 488 nm usado para excitar fluoroforos comuns como proteína fluorescente verde (GFP) e DsRed. Desta forma, não há sobreposição espectral de células mortas e células sanguíneas transgênicas. O iodeto de propidium (PI) a 1 mg/mL é uma alternativa barata à mancha de célula morta vermelha, mas certifique-se de reservar algumas amostras manchadas apenas com PI, bem como amostras apenas com o fluorohore de interesse para definir a compensação do instrumento. Caso contrário, os sinais de PI e fluoroforos como o GFP se sobreporão, resultando em resultados falso-positivos. Se o citómetro de fluxo também tem um laser de 405 nm, outros corantes como a mancha de célula azul pai também são uma excelente escolha.
   ATENÇÃO: Ao analisar os glóbulos, observe que após 30 min certos tipos de células começarão a fagocitar a mancha de células mortas vermelhas. Mantenha as células protegidas da luz e do gelo até a análise e realize a citometria de fluxo dentro de 30 minutos da adição do corante.
2. Análise de citometria de fluxo
   NOTA: Cada citómetro de fluxo é um pouco diferente, mas as etapas seguintes ajudarão na preparação de amostras para análise na maioria das máquinas. Para usuários novos para fluir citometria, procure o conselho de alguém que seja um especialista no equipamento específico. As seguintes instruções dizem respeito ao citômetro de fluxo BD FACSAria Fusion.
   1. Ligue o cítômetro e deixe os lasers aquecerem por 20 minutos. Tanque de resíduos vazio, encha tanque de baia com solução apropriada (varia de acordo com o citômetro de fluxo) e inicie o sistema fluido.
      NOTA: Geralmente há um procedimento de inicialização específico para cada tipo de citómetro de fluxo; siga esse procedimento de inicialização cuidadosamente.
   2. No software de análise, desenhe cinco parcelas(Figura 1A).
      1. Tenha a primeira medida de gráfico de ponto para frente dispersão (FSC) no eixo x e dispersão lateral (SSC) no eixo y. Defina o FSC como linear e SSC como log.
         NOTA: FSC é uma medição do tamanho da célula, e SSC é uma medida de granularidade; isso permitirá a discriminação de células de detritos. As populações de células sanguíneas de zebrafish embrionários não se separam por tamanho e granularidade da mesma forma que as células sanguíneas de zebrafish adultos descritas anteriormente¹⁵. Em vez disso, eles aparecerão na mesma população com todas as outras células embrionárias digeridas.
      2. Defina o segundo plot para examinar a altura do FSC (H) versus a largura FSC (W). Defina o terceiro plot para medir SSC (H) versus SSC (W).
         NOTA: Esta etapa é usada para excluir doublets (células que ficam presas juntas quando passam pelo laser).
      3. Defina o quarto gráfico de pontos para medir a mancha de célula morta vermelha no eixo x (dependendo do cítmetro, isso geralmente é equivalente ao filtro usado para alofilia [APC]) e SSC no eixo y. Isso permitirá a discriminação de células vivas de células mortas.
         NOTA: Os conjuntos de filtros de cada címetro podem ser diferentes. Certifique-se de usar o filtro de detecção correto para o corante de discriminação celular morto.
      4. O quinto lote mede o fluoróforo de escolha. Visualize isso como um histograma do fluorohore(Figura 1) ou use um gráfico de pontos(Figura Suplementar 2).
         NOTA: Ao examinar mais de um fluoróforo no mesmo animal, recomenda-se usar um gráfico de pontos para visualizar ambos os parâmetros ao mesmo tempo. Se houver alguma chance de que os fluoroforos tenham sobreposição espectral entre si(Figura Suplementar 2),um gráfico de pontos também é recomendado. Use as configurações da Área (A) para calcular a área sob a curva gerada pelo pulso laser do citômetro para todos os parâmetros, pois são mais precisas.
   3. Carregue a amostra e reduza a taxa de fluxo para que a amostra não se escora rapidamente. Ajuste as configurações FSC e SSC para que a maior parte da população celular possa ser claramente vista(Figura 1A).
   4. Desenhe um portão em torno da população celular e rotule-o de células. Certificando-se de que o segundo lote de pontos esteja fechado em células, exclua os doublets primeiro gating no FSC e, em seguida, nos singlets SSC.
   5. No quarto lote ajuste as configurações da mancha de células mortas vermelhas para que haja claramente uma população negativa. Desenhe um portão ao redor dessas células, e rotule-as de células vivas. No quinto enredo, portão em células vivas e examinar células fluoróforas negativas e positivas. Desenhe um portão ao redor das células positivas.
      NOTA: Esta estratégia hierárquica de gating examina fluorforas₊ células que residem no portão de células vivas, que também residem no portão da cela. Tome cuidado para definir os portões corretamente. Esses portões podem ser personalizados dependendo do experimento.
   6. Execute cada amostra, coletando pelo menos 25.000 eventos de células vivas.
   7. Siga o procedimento de desligamento para desligar os fluidos. Reabastecer o tanque de baia e esvaziar o tanque de lixo.
      NOTA: Muitas vezes é difícil visualizar células fluoróforas⁺ quando a expressão proteica é baixa, ou a população celular é rara. Para garantir que os parâmetros sejam ajustados corretamente, os embriões fluorforeiros^- irmãos devem ser preparados juntamente para desenhar adequadamente os portões e ajustar as tensões a laser(Figura Suplementar 2). Se a população de células-alvo for rara, colecione mais de 25.000 eventos. Com 5-10 animais digeridos, deve-se ser capaz de coletar milhões de eventos. O número total de células fluoróforas⁺ também pode ser obtido com esses dados. Basta contar o número total de células na amostra com um hemótmetro e multiplicar a porcentagem de células fluoroforas⁺ para obter o número absoluto de fluorforoto⁺ células por peixe.

Resultados

Para enumerar glóbulos vermelhos em zebrafish embrionários, foraminjetados 16 embriões de¹⁶ ng no estágio de uma célula com PBS, 7,0 ng/nL ism1 MO, ou 7,0 ng/nL ism1 MO com 7,0 ng ism1 mRNA¹². Com 48 cvf foram digeridos e submetidos à análise de citometria de fluxo. Após analisar a porcentagem de GFP⁺ glóbulos vermelhos de cada amostra (cada amostra é de 5 embriões selecionados aleatoriamente; <...

Discussão

Zebrafish é um excelente sistema modelo para estudar hematopoiese vertebral primitiva e definitiva. Ao longo das últimas décadas, vários ensaios foram desenvolvidos e refinados, permitindo que o zebrafish se tornasse um modelo rápido e econômico para testar drogas, gerar e testar mutantes genéticos, e, em geral, permitir que os pesquisadores analisassem caminhos moleculares essenciais para a hematopoiese. Este protocolo utiliza zebrafish embrionários que permite a coleta rápida de dados, o uso de menos espaço físico do q...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo MCF de 1,5 ml	FisherBrand	05-408-129
Placa de Petri de poliestireno de 10 mm	Corning Falcon	351008
Tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 ml com tampa de filtro de célula	Corning Falcon	352235
BD FACSAria Citômetro de fluxo de fusão	BD Biosciences
Dithiolthreitol (DTT)	Sigma-Aldrich
DPBS (10x) com Ca2+ e Mg2+	Life Technologies	14080-055
FBS 500 mL	Gemini Bio-Products	100-108
HyClone PBS (1x)	GE Healthcare Life Sciences	sh30256.01
Librease	Roche Sigma-Aldrich	5401119001	protease
de dissociaçãoPronase	Roche Sigma-Aldrich	11459643001	protease de decorionação
SYTOX Red Dead Cell Stain	Invitrogen	S34859