Artigo de método

Quantificando partículas semelhantes a vírus norovírus humanos ligando-se a bactérias commensal usando citometria de fluxo

DOI:

10.3791/61048

⸱

29 de abril de 2020

 , 
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

Neste artigo

Resumo

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O objetivo deste protocolo é quantificar a ligação do norovírus humano eucaiótico às bactérias. Após a realização de um teste inicial de fixação vírus-bactéria, a citometria de fluxo é usada para detectar bactérias viralmente ligadas à população.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As bactérias commensal são bem estabelecidas para impactar a infecção de vírus eucaióticos. A ligação direta entre o patógeno e o microbioma hospedeiro é responsável por alterar a infecção para muitos desses vírus. Assim, caracterizar a natureza da ligação vírus-bactérias é um passo fundamental necessário para elucidar os mecanismos pelos quais as bactérias alteram a infecção viral. Para norovírus humano, bactérias commensal aumentam a infecção celular B. O vírus se liga diretamente a essas bactérias, indicando que essa interação direta está envolvida no mecanismo de aumento da infecção. Uma variedade de técnicas pode ser usada para quantificar interações entre bactérias e vírus, incluindo a contagem de cintilação de vírus rotulados por radiorótulos e reação em cadeia de polimerase (PCR). Ambos os métodos requerem o uso de vírus vivo, que pode precisar ser gerado em laboratório. Atualmente, nenhum dos sistemas de cultura in vitro estabelecidos disponíveis para norovírus humano são robustos o suficiente para permitir a geração de estoques virais altamente concentrados. Em vez de vírus vivos, partículas semelhantes a vírus (VLPs) têm sido usadas para caracterizar as interações entre norovírus e bactérias. Aqui, um método de citometria de fluxo é descrito com o uso de anticorpos específicos do vírus para quantificar a ligação VIP a bactérias gram-negativas e gram-positivas. A inclusão de controles apenas de bactérias e isótipo permitiu a otimização do ensaio para reduzir a ligação de anticorpos de fundo e a quantificação precisa do apego VIP às bactérias testadas. Altas relações de VLP:bactérias resultam em VLPs vinculando-se a grandes percentuais da população bacteriana. No entanto, quando as quantidades de VIP são diminuídas, o percentual de bactérias ligadas também diminui. Em última análise, esse método pode ser empregado em experimentos futuros elucidando as condições específicas e componentes estruturais que regulam o norovírus: interações bacterianas.

Introdução

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Os norovírus humanos (HuNoVs) são a principal causa de doenças gastrintestinais em todo o mundo, responsáveis por 685 milhões de infecções e mais de 200.000 mortes a cada ano1. Assim como outros vírus entéricos, a presença de bactérias commensal tem sido demonstrada para aumentar a infecção deste patógeno, bem como seu vírus substituto, murine norovirus2,3. Há também relatos conflitantes de que as bactérias podem inibir a infecção por norovírus humano4,5,6. Para vários vírus, a interação direta entre o vírus e as bactérias parecem estar por trás dos mecanismos que impactam a infecção viral2,7,8,9,10, e tem sido mostrado através da microscopia eletrônica que os norovírus humanos se ligam diretamente às superfícies das bactérias11,12. Portanto, caracterizar essas interações tornou-se fundamental para determinar os mecanismos pelos quais as bactérias impactam a infecção viral. Essa caracterização começou de forma clássica com a quantificação da ligação viral a uma matriz de espécies bacterianas componentes do microbioma hospedeiro7,,12,13. Esses ensaios de apego não apenas revelam a quantidade de vírus ligado às bactérias, mas também ajudam a determinar o impacto dessa interação na aptidão viral e na sobrevivência.

Para quantificar o apego viral, os métodos tradicionalmente utilizados incluem ensaios baseados em PCR que quantificam genomas virais12 ou a geração de vírus rotulados por radiovém e o uso da contagem de cintilação para quantificar partículas virais7,,8,9,13. O uso desses métodos geralmente requer acesso a estoques de vírus de alto título e técnicas de cultivo in vitro com as quais gerá-los. Embora existam agora vários sistemas de cultura para norovírus humano2,14,15, nenhum suporta a replicação robusta necessária para gerar esses estoques altamente concentrados que restringe ou elimina o uso de PCR e contagem de cintilação para quantificar as interações norovírus/bacterianas humanas.

Para contornar esse problema, partículas semelhantes a vírus (VLPs) podem ser usadas como substituto para o vírus vivo para investigar interações entre norovírus humano e bactérias16,17. VIPs são partículas não infecciosas que se assemelham ao vírus do qual são derivados. No caso do norovírus humano, essas partículas são geradas a partir da expressão da proteína VP1 (e às vezes a VP2), que se auto-monta para criar capsídeos virais intactos sem material genético (ou seja, RNA para norovírus). Estes VIPs têm sido bem caracterizados, são estruturalmente e antígenicamente semelhantes aos vírus do tipo selvagem dos quais são derivados18,,19,20,21,22,23. Portanto, os VIPs servem como substituto ideal para investigar as interações superficiais entre norovírus humano e bactérias commensal. Dado que os VIPs não possuem material genético, os ensaios baseados em PCR não podem ser usados para quantificar a ligação viral. Um método de citometria de fluxo baseado em anticorpos foi previamente descrito e capaz de detectar baixos níveis de ligação VIP a bactérias de forma semi-quantitativa16. Este método foi otimizado para permitir a quantificação precisa da ligação vip de norovírus humano tanto para as bactérias gram-negativas quanto gram-positivas16.

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Protocolo

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NOTA: As condições de crescimento bacteriano descritas no protocolo são condições de cultura padrão para Enterobacter cloacae e Lactobacillus gasseri. Para realizar o ensaio de apego de bactérias com outras espécies bacterianas, as bactérias escolhidas devem ser cultivadas em condições padrão adequadas para a bactéria.

1. Preparando o meio de crescimento bacteriano

  1. Enterobacter cloacae mídia de crescimento
    1. Preparar o meio líquido dissolvendo 10 g de tripptone, 5 g de extrato de levedura e 10 g de cloreto de sódio (NaCl) em 1 L de água desionizada (DI) (ver Tabela de Materiais). Misture todas as mídias cuidadosamente e esterilize por autoclaving por 30 min.
    2. Prepare o meio sólido dissolvendo 10 g de tripptone, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl e 15 g de ágar em 1 L de água DI. Misture todas as mídias cuidadosamente e esterilize por autoclaving por 30 min.
  2. Mídia de crescimento lactobacillus gasseri
    1. Prepare o meio líquido dissolvendo 55 g de De Man, Rogosa e Sharpe (MRS; ver Tabela de Materiais) em pó em 1 L de água DI. Use o meio dentro de um mês de preparação. Para esterilizar, aqueça médio por 15 min até ferver seguido de autoclaving por 15 min.
    2. Prepare o meio sólido dissolvendo 55 g de pó de MRS e 15 g de ágar em 1 L de água DI. Para esterilizar, aqueça médio por 15 min até ferver seguido de autoclaving por 15 min.

2. Estabelecer uma curva padrão correlacionando densidade óptica (OD) e concentração de bactérias

  1. Inoculados 5 mL de meio líquido apropriado com uma única colônia isolada a partir de uma placa de ágar(E. cloacae) ou diretamente do estoque de glicerol congelado(L. gasseri).
  2. Cultivar a bactéria durante a noite, em condições atmosféricas adequadas (Enterobacter cloacae: 37 °C com agitação aeróbica a 200 rpm; L. gasseri: Banho de água de 37 °C sem tremer em um recipiente hermético).
  3. Transfira as alíquotas de 2 x 1,3 mL da cultura noturna em dois tubos de centrífuga separados de 1,5 mL e bactérias centrífugas a 10.000 x g por 5 min.
  4. Remova o sobrenadante e lave as amostras com 1 mL de soro tampão de fosfato estéril de 1x (PBS). Repita esta etapa de lavagem para um total de 2 lavos.
  5. Centrifugar as amostras novamente a 10.000 x g por 5 min, remover o sobrenadante e resuspender em 1,3 mL de 1x PBS estéril.
  6. Começando com 0,5 mL de cultura lavada, diluir seriamente as bactérias em 1x PBS de 10-1 a 10-4.
  7. Utilizando um espectrofotômetro, meça a densidade óptica da cultura lavada e não diluída e cada uma das quatro diluições a 600 nm (OD600).
  8. Realize diluições seriais de 10 vezes em 1x PBS para cada diluição a partir do passo 2.6. Espalhe a placa 100 μL das últimas 3 diluições para cada série em meio sólido apropriado para determinar o número de unidades formadoras de colônia por mililitro (UFC/mL) de cada amostra. Emplacacada diluição em triplicado.
  9. Deixe as placas secarem à temperatura ambiente por 5 min. Inverta as placas e incuba-se sob as condições atmosféricas adequadas (E. cloacae: aeróbica a 37 °C, incubar placas durante a noite; L. gasseri: anaeróbico a 37 °C, incubar placas por 48 h em um recipiente hermético com sachês de ar anerobico (ver Tabela de Materiais)).
    NOTA: Use 1 sachê de ar anaeróbico por frasco de 2,5 L ou 3 sachês por frasco de 7,0 L (ver Tabela de Materiais).
  10. Contagem de placas de uso para determinar CFU/mL para cada uma das 5 amostras (ou seja, não diluídas, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4). Gerar uma curva padrão comparando OD600 vs CFU/mL. A equação para esta linha será usada em ensaios de fixação de bactérias VIP para determinar CFU/mL com base em OD600.

3. Ensaio de fixação de bactérias VIP

ATENÇÃO: Os VIPs de norovírus humanos são um nível de biossegurança (BSL)-2 de risco e todo o trabalho envolvendo VIPs deve ser realizado em um gabinete de biossegurança. A preparação das culturas bacterianas, antes do ensaio de fixação, deve ser realizada utilizando condições de segurança adequadas ao organismo.

  1. Preparação de reagente
    1. 1x solução tamponada de fosfato (PBS)
      1. Prepare 1 L de 10x PBS dissolvendo um pacote inteiro em 1 L de água DI.
      2. Solução autoclave para 30 min.
      3. Prepare uma solução 1x diluindo a solução acima 1:10 em água DI.
      4. O filtro esteriliza a solução passando-a através de um filtro de 0,22 μm e armazena a temperatura ambiente.
    2. 5% BSA
      1. Adicione 5 g de pó de albumina de soro bovino (BSA) a 100 mL de PBS para gerar uma solução de 5% (w/v).
      2. Misture a solução por vórtice ou em uma placa de agitação usando uma barra de agitação metálica até que as aglomerações tenham dissolvido.
      3. Filtrar o filtro utilizando um filtro de 0,22 μm.
      4. Armazene a solução a 4 °C.
    3. Tampão de mancha de citometria de fluxo (FCSB)
      1. Filtro comprado FCSB (ver Tabela de Materiais) através de um filtro de 0,22 μm.
      2. Armazene a solução restante a 4 °C.
    4. Buffer de bloqueio de 5% (BB)
      NOTA: Prepare-se fresco cada vez.
      1. Adicione 0,5 g de BSA a 10 mL de FCSB estéril.
      2. Vórtice para misturar totalmente a amostra e deixar no gelo até o uso.
  2. Conjugação de anticorpos
    1. Conjugar anticorpo de norovírus humano GII (ver Tabela de Materiais) com r-phycoeryrin (PE) usando um kit de rotulagem de anticorpos R-PE de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
    2. Armazene o anticorpo conjugado no escuro a 4 °C para uso futuro na análise de ensaio de fixação de bactéria VLP.
      NOTA: O anticorpo primário deve ser titulado antes de ser usado no ensaio de fixação de bactérias VIP para determinar a concentração adequada necessária para a análise da citometria do fluxo. A titulação de anticorpos deve ser realizada toda vez que a reação de conjugação é realizada e para cada bactéria usada no ensaio de fixação.
  3. Titulação de anticorpos
    1. Diluir o anticorpo xiovírus gii conjugado 100 vezes, com uma diluição inicial de 1:100 e uma diluição final de 1:600 (seis diluições no total).
    2. Realizar um ensaio de fixação de vírus conforme descrito abaixo com a seguinte exceção: na etapa 3.5.7 resuspender a pelota bacteriana em 350 μL de 5% BB.
    3. Divida a amostra em sete alíquotas de 50 μL.
    4. Adicione 50 μL de cada diluição de anticorpos a um tubo.
    5. Adicione 50 μL de 5% bb ao sétimo tubo como um controle não manchado.
    6. Realize citometria de fluxo em todas as amostras conforme descrito abaixo.
    7. Compare amostras de anticorpos diluídos com controles não manchados e entre si. A menor concentração de anticorpos que não resulta em diminuição ou perda de sinal positivo deve ser escolhida para uso em ensaios subsequentes.
  4. Preparação de bactérias
    1. Cultivar as bactérias em 40 mL de meio líquido apropriado em condições atmosféricas apropriadas até que as bactérias estejam em fase estacionária.
      1. Cultivar culturas E. cloacae aerobicamente durante a noite em Luria Broth a 37 °C, agitando a 200 rpm para chegar à fase estacionária.
      2. Cultivar culturas L. gasseri em caldo MRS em tubos de tampa de parafuso preto sem tremer em um banho de água definido para 37 °C por 18 horas para chegar à fase estacionária.
    2. Transfira culturas de fase estacionária para limpar tubos cônicos de 50 mL e amostras de centrífuga a 2.288 x g por 10 min para pellet as bactérias.
    3. Remova o sobrenadante e resuspenda em 13 mL de 1x PBS estéril. Repita esta etapa de lavagem para um total de duas laves.
    4. Centrifugar novamente as amostras, remover o sobrenadante e resuspender amostras em 20 mL de 1x PBS.
      NOTA: Se a pelota celular for pequena, o volume de resuspensão pode ser reduzido.
    5. Meça oOD 600 da cultura.
    6. Utilizando a curva padrão previamente preparada, determine o FUPor mL da cultura lavada.
    7. Diluir as bactérias conforme necessário com 1x PBS para ajustar a concentração de cultura a 1 x 108 UFC/mL.
    8. Transfira 1 mL da cultura bacteriana 1 x 108 CFU/mL para o número necessário de tubos de centrífuga de 1,5 mL.
    9. Centrifugar os tubos a 10.000 x g por 5 min.
    10. Ressuspensão da pelota bacteriana em 1 mL de BSA estéril de 5%.
    11. Incubar os tubos por 1 h a 37 °C com rotação constante.
  5. Anexo de vírus
    1. Trabalhando dentro de um gabinete de biossegurança BSL-2, adicione 10 μg de VIPs HuNoV (ver Tabela de Materiais) a cada tubo contendo bactérias resuspensas em PBS e misture completamente por pipetting.
      NOTA: A concentração de VIP difere de cada preparação VIP. Portanto, o volume adicionado às bactérias variará entre os lotes de preparação e deve ser ajustado de acordo para que 10 μg sejam adicionados a cada tubo no experimento. Para controles de bactérias apenas (por exemplo, amostras sem VIP), adicione um volume de PBS que equivale ao volume de VIP adicionado às amostras experimentais.
    2. Incubar tubos por 1 h a 37 °C com rotação constante.
      NOTA: Um revólver de tubo (ver Tabela de Materiais) definido a 40 rpm é usado durante a incubação.
    3. Após a incubação, centrifugar as amostras a 10.000 xg por 5 min.
    4. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota bacteriana em 1 mL de PBS.
    5. Repita os passos de lavagem 3.5.3 e 3.5.4.
    6. Centrifugar as amostras a 10.000 xg por 5 min.
    7. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota bacteriana em 150 μL de 5% BB.
  6. Coloração de anticorpos
    1. Prepare fresco 5% BB.
      NOTA: Todo o trabalho utilizando o anticorpo marcado fluorescentemente deve ser realizado no escuro e o anticorpo, BB e FCSB devem ser mantidos no gelo.
    2. Diluir o anticorpo GII de norovírus humano 1:125 para amostras de E. cloacae e 1:150 para amostras de L. gasseri em 5% BB, preparando 50 μL de anticorpo diluído por amostra.
    3. Diluir o anticorpo isótipo da mesma forma que o anticorpo gii norovírus humano foi diluído para cada bactéria em 5% BB, preparando 50 μL de controle de isótipo diluído por amostra.
    4. Divida cada amostra de ensaio de anexo do passo 3.3.7 em três alíquotas de 50 μL, transferindo-as para tubos de centrífuga de 1,5 mL limpos.
    5. Ao primeiro conjunto de amostras, adicione 50 μL de BB. Este conjunto será o controle não manchado (Uns).
    6. Ao segundo conjunto, adicione 50 μL da diluição do anticorpo GII. Isso resulta em uma concentração final de anticorpos de 1:250 para E. cloacae e 1:300 para L. gasseri. Este conjunto de amostras serão as amostras manchadas (AB).
    7. Ao terceiro conjunto, adicione 50 μL do anticorpo isótipo diluído. Este conjunto será os controles de isótipo (IC). Misture bem por pipetting. Incubar as amostras no gelo e no escuro por 30 min.
    8. Centrifugar todas as amostras a 10.000 xg por 5 min.
    9. Descarte o sobrenadante e resuspenda as amostras em 100 μL de FCSB.
    10. Centrifugar todas as amostras a 10.000 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante e resuspenda as amostras em 100 μL de FCSB.
    11. Centrifugar todas as amostras a 10.000 xg por 5 min.
    12. Descarte o sobrenadante e resuspenda as amostras em 150 μL de FCSB.
    13. Transfira cada amostra para um tubo FCSB contendo 400 μL de tampão FCSB para um volume total de 550 μL.
    14. Mantenha as amostras a 4 °C até que sejam analisadas por citometria de fluxo.
      NOTA: A citometria de fluxo é realizada dentro de 4h de coloração de anticorpos.

4. Citometria do fluxo

NOTA: As configurações de tensão descritas abaixo são baseadas no citómetro de fluxo e software listados na Tabela de Materiais e provavelmente variarão com diferentes citómetros de fluxo. As configurações devem ser otimizadas para cada bactéria. Certifique-se de que os eixos para todos os gráficos estão em fase biexponencial.

  1. Configuração do espaço de trabalho
    NOTA: A configuração para parcelas utilizadas para estabelecer o espaço de trabalho difere das utilizadas no gating e na análise de dados. O objetivo da criação do espaço de trabalho é visualizar a população celular, garantir que não haja desintegração excessiva das células bacterianas que possam impactar a análise a jusante e distinguir entre células manchadas e não manchadas enquanto os dados são coletados.
    1. Para garantir que as bactérias não se agrupe, configure uma série de parcelas de densidade.
      1. Gerar uma área de dispersão para frente (FSC-A) versus área de dispersão lateral (SSC-A) para visualizar a população total.
      2. Configure plots para avaliar células individuais versus aglomerados de células, criando dois gráficos que comparam tanto a largura de dispersão para a frente (FSC-W) quanto a largura de dispersão lateral (SSC-W) para a frente (FSC-H) e a altura de dispersão lateral (SSC-H), respectivamente.
      3. Criar um gráfico que mostre apenas a população pe positiva (PE-A vs. SSC-A).
    2. Coloque a tensão da linha de base para 500 para E. cloacae e 340 para L. gasseri. Estes serão ajustados mais tarde.
    3. Definir o total de eventos contados para 10.000 eventos.
  2. Executando amostras
    1. Crie três tramas histogramas separadas que mostram a contagem plotada contra SSC-A, FSC-A ou PE-A.
    2. Coloque uma amostra não manchada no citómetro de fluxo e adquira os eventos amostrais, garantindo que o pico máximo no histograma para SSC-A esteja dentro de 102 a 103 e o pico máximo no histograma para FSC-A esteja entre 104 e 105 no eixo x. Caso não, os picos não se enquadram nas faixas especificadas, ajuste as tensões FSC e SSC em conformidade.
    3. Coloque uma amostra manchada (AB) no citómetro de fluxo e ajuste a tensão PE para fazer o pico máximo após 103 no eixo x.
    4. Com base nessas medidas, defina o portão PE positivo e defina o portão no gráfico de densidade PE-A versus SSC-A.
    5. Execute todas as amostras sob as configurações determinadas em baixa ou média velocidade.

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Resultados

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As estratégias de gating utilizadas para quantificar a ligação do norovírus humano à bactéria commensal são mostradas na Figura 1. O ponto de densidade representativa fornece uma visão geral de como as amostras foram fechadas para eliminar detritos celulares e aglomerados celulares para que o anexo VIP fosse determinado em populações únicas(Figura 1A). Histogramas representativos demonstram baixos níveis de sinal...

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Discussão

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A capacidade de quantificar a ligação de vírus entéricos às bactérias é um primeiro passo crítico para elucidar os mecanismos pelos quais essas bactérias alteram a infecção viral. Os métodos descritos aqui foram otimizados para medir as interações do norovírus humano COM e. cloacae (bactéria gram-negativa) e L. gasseri (uma bactéria gram-positiva), mas podem ser adaptados para uso com qualquer vírus mamífero e bactéria de interesse. Embora os VIPs sejam uma alternativa i...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer a Sutonuka Bhar e Chanel Mosby-Haundrup por sua revisão crítica do manuscrito escrito, bem como A favor de Alfonso Carrillo pela assistência na geração de curvas padrão bacterianas. Este trabalho é financiado em parte por uma bolsa do Instituto Nacional de Saúde (R21AI140012) e por uma bolsa semente da Universidade da Flórida, Instituto de Ciências Alimentares e Agrícolas.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de fundo redondo de polistreno de 5 ml com tampa de filtro de célulaCorning352235Após a coloração do anticorpo, a amostra é transferida para tubos para análise de citometria de fluxo.
ÁgarSigmaA7002Usado para preparação de meios
AnaeroPackThermo ScientificR681001Pacote de gás anaeróbico usado para cultura de Lactobacillus gasseri
Software
BD LSR Citômetro
Albumina de soro bovino FisherBiorreagentesBP1605Usado para citometria de fluxo
Tampão de Mancha de Citometria de Fluxo (FCSB)BD Biosciences554657Usado para citometria de fluxo
Controle de Isotipo IgG2b kappa de Camundongo (eBMG2b), PE, eBioscienceThermo Fisher Scientific12473281Controle de Isotipo. Este anticorpo é adquirido na forma conjugada do fabricante.
MRS PóBD Biosciences288130Usado para preparação de meios e cultura de Lactobacillus gasseri.
Anticorpo monoclonal G2 do capsídeo de norovírus (L34D)Thermo Fisher ScientificMA5-18241Anticorpo de norovírus GII. Este anticorpo está disponível apenas na forma não conjugada e, portanto, deve ser conjugado com fluorescência antes do uso nos ensaios de citometria de fluxo descritos. Neste protocolo, o PE foi o fluor escolhido, no entanto, outras moléculas fluorescentes podem ser escolhidas como melhor se adequam ao citômetro de fluxo que está sendo utilizado pelo pesquisador.
Norovírus GII.4 VLPBioestrutura CriativaCBS-V700vírus norovírus humano como partícula, VLPs foram gerados usando o sistema baculovírus e ressuspensos em solução salina tamponada com fosfato com 10% de glicerol. Os autores realizaram uma análise independente de rastreamento nanosight para determinar a concentração de partículas dos VLPs. A concentração é de aproximadamente 1011 VLPs por mililitro. Com base na concentração de proteína das VLPs, aproximadamente 200 partículas são adicionadas por bactéria em ensaios de fixação de VLP.
PBS 10XFisher BioreagentsBP665Diluir para 1X antes de usar.
Kit de rotulagem de anticorpos SiteClick R-PEThermo Fisher ScientificS10467Kit de conjugação usado para rotular anticorpos não conjugados.
Cloreto de sódioFisher ScientificS271Usado para preparação de meios
TriptonaOxóideLP0042Usado para preparação de meios
Revólver de tuboThermoFisher Scientific88881001Usado em vírus: ensaio de fixação de bactérias. Defina para a velocidade máxima (40 rpm).
Extrato de leveduraBD Biosciences212750Usado para preparação de meios
BD FacsDivade fluxo Fortessa

Referências

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