Geração rápida e perfeita de vírus de varíola recombinante usando faixa de host e seleção visual

Summary

Este é um método para gerar vírus de vaccinia recombinante "sem scarless" usando seleção de alcance de host e identificação visual de vírus recombinantes.

Abstract

O vírus da vaccinia (VACV) foi fundamental na erradicação do vírus variola (VARV), o agente causador da varíola, da natureza. Desde sua primeira utilização como vacina, o VACV tem sido desenvolvido como vetor para vacinas terapêuticas e como um vírus oncolítico. Essas aplicações aproveitam o genoma facilmente manipulado do VACV e a ampla gama de hospedeiros como uma excelente plataforma para gerar vírus recombinantes com uma variedade de aplicações terapêuticas. Vários métodos foram desenvolvidos para gerar VACV recombinante, incluindo métodos de seleção de marcadores e seleção dominante transitória. Aqui, apresentamos um refinamento de um método de seleção de alcance de host, juntamente com a identificação visual de vírus recombinantes. Nosso método aproveita a pressão seletiva gerada pelo hospedeiro da proteína antiviral kinase R (PKR) juntamente com um gene de fusão fluorescente expressando mCherry-tagged E3L, um dos dois antagonistas VACV PKR. O, incluindo o gene de interesse e a fusão mCherry-E3L é ladeado por seqüências derivadas do genoma VACV. Entre o gene de interesse e mCherry-E3L é uma região menor que é idêntica aos primeiros ~150 nucleotídeos do braço de 3', para promover a recombinação homóloga e a perda do gene mCherry-E3L após a seleção. Demonstramos que este método permite uma geração eficiente e perfeita de rVACV em uma variedade de tipos de células sem exigir seleção de medicamentos ou triagem extensiva para vírus mutantes.

Introduction

O vírus da vaccinia (VACV) foi fundamental para a primeira erradicação bem sucedida de um patógeno humano, o vírus variola (VARV), da natureza. Desde o extermínio do vírus variola, os vírus da varíola, incluindo o VACV, continuam a ser vírus terapêuticos úteis para a medicina humana e animal. Por exemplo, uma vacina contra o vírus da raiva baseada em VACV tem sido muito eficaz na prevenção da transmissão da raiva silvestre na Europa¹ e nos Estados Unidos². Mais recentemente, os vírus da varíola recombinantes que expressam uma variedade de moléculas antitumorais (por exemplo, anticorpos de cadeia única ou eritropoietina h....

Protocol

1. Gerar o vetor de recombinação

1. Projete primers para gerar o de seleção. Projete cada amplicon individual com seqüências sobrepostas com amplicons vizinhos e o vetor para facilitar a montagem enzimática isotérmica de moléculas de DNA, também chamada de montagem gibson, usando qualquer uma das várias ferramentas de design de primer on-line.
   NOTA: Este protocolo também pode ser concluído usando métodos tradicionais de clonagem baseadaem endonuclease. Nesse caso, os primers de design com os locais de restrição apropriados em vez de com seqüências sobrepostas.
2. Utilizando os primers projetados na etapa 1.1, o PCR amplifica os seguintes elementos em ....

Results

Utilizou-se o procedimento diagramado na Figura 1 para gerar um VACV sem antagonistas PKR E3L e K3L, substituindo E3L por EGFP em um vírus já excluído para K3L (vP872). A Figura 2 apresenta placas fluorescentes vermelhas em células RK13 competentes do PKR indicativas de expressão viral de mCherry-E3L, bem como EGFP expressas em células RK13+E3L+K3L confirmando a perda de E3L e o colapso do marcador de seleção mCherry-E3L. A Figura 3.......

Discussion

Aqui apresentamos uma variação de uma estratégia transitória de seleção de marcadores ³² para gerar vírus de vaccinia recombinantes sem reter DNA estranho no vírus recombinante final. Nossa estratégia usa pressão seletiva mediada pelo PKR de proteína antiviral hospedeira em vez de outras formas de pressão seletiva, como antibióticos. O uso de genes antivirais hospedeiros elimina a possibilidade de alterações pheotípicas quimicamente induzidas nas células, ou aumento do risco de mutação devido a dr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2X-Q5 Master Mix	NEB	M0492L	Polimerase de alta fidelidade usada em PCR
Ampicilina	ThermoFisher Scientific	11593027	Agente seletivo bacteriano
Raspadores de células descartáveis	ThermoFisher Scientific	08-100-242	Raspador de células para colher células infectadas
EVOS FL Auto 2 Sistema de imagem celular	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Microscópio fluorescente
EVOS Light Cube, GFP	ThermoFisher	AMEP4651	GFP Cube
EVOS Light Cube, RFP	ThermoFisher	AMEP4652	RFP Cube
GenJet	SignaGen Laboratories	SL100489	Reagente de transfecção
Luria Bertani (LB) Caldo	Gibco	10855021	Meio de crescimento
bacteriano Kit de extração de	gel de DNA monarcaNEB	T1020L	Kit de purificação de gel usado para purificar amplicons e vetores linearizados
Kit Miniprep de plasmídeo monarca	NEB	T1010L	Kit Miniprep usado para purificar plasmídeos
NanoDrop One	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W	Espectrofotômetro usado para medir a concentração de RNA e DNA
NEBuilder Master Mix	NEB	E2621L	Kit de montagem enzimática isotérmica utilizado para gerar o vetor de recombinação
Q500 Sonicator Qsonica		Q500-110	Sonicator para lisados de vírus
Células RK13	ATCC	CCL-37	Células renais de coelho
VWR Placas de cultura de células multipoços	VWR	10062-892 Placas de	cultura de células