Um modelo modificado de rato de dois rins um clipe de regulação de renin em estenose da artéria renal

Resumo

Um modelo modificado de 2 rim 1 (2K1C) O modelo de rato Goldblatt foi desenvolvido usando tubos de poliuretano para iniciar a estenose da artéria renal, induzindo um aumento na expressão de renin e lesão renal. Aqui, descrevemos um procedimento detalhado de preparação e colocação da braçadeira na artéria renal para gerar um modelo de mouse 2K1C reprodutível e consistente.

Resumo

A estenose da artéria renal é uma condição comum em pacientes com doença vascular coronariana ou periférica onde o sistema de aldosterona renin angiotensin (RAAS) é superativado. Nesse contexto, há um estreitamento das artérias renais que estimulam o aumento da expressão e liberação de renin, a protease que limita a taxa no RAAS. O aumento resultante da expressão de renin é um conhecido condutor da hipertensão renovascular, frequentemente associada a lesões renais e danos nos órgãos finais. Assim, há um grande interesse em desenvolver novos tratamentos para essa condição. O mecanismo molecular e celular do controle de renin na estenose da artéria renal não é totalmente compreendido e merece uma investigação mais aprofundada. Para induzir estenose da artéria renal em camundongos, foi desenvolvido um modelo de rato Goldblatt modificado de 2 rins 1 (2K1C). O rim direito foi estenoso em camundongos do tipo selvagem e camundongos operados por vergonha foram usados como controle. Após estenose da artéria renal, determinamos expressão de renin e lesão renal. Os rins foram colhidos, e cortices frescos foram usados para determinar a expressão proteica e mRNA de renin. Este modelo animal é reprodutível e pode ser usado para estudar respostas fiofoficológicas, vias moleculares e celulares envolvidas na hipertensão renovascular e lesão renal.

Introdução

A estenose da artéria renal (RAStenosis) é um problema intratável que afeta cerca de 6% das pessoas com mais de 65 anos e em até 40% das pessoas com doença vascular coronariana ou periférica ^1,2. Os tratamentos atuais para a doença são limitados; portanto, há uma necessidade crítica de desenvolver novas terapias para tratar hipertensão renovascular ou hipertensão resistente induzida por RAStenosis. O sistema de aldosterona de angiotensina renin (RAAS) é o caminho-chave envolvido na patogênese da hipertensão induzida por RAStenose ou hipertensão renovascular ^3,4. Terapias conhecidas voltadas para o RAAS, como inibidores de ACE ou bloqueadores de receptores de angiotensina, aliviam a hipertensão, mas precisam de um exame próximo para insuficiência renal e hipercalemia ^5,6,7. Renin catalisa o passo limitante de taxas no RAAS; converte angiotensinogênio em angiotensina I. Na aterosclerose, a formação da placa provoca o estreitamento da artéria renal que impulsiona a secreção de renin, resultando em hipertensão renovascular e danos nos rins⁸. Vários estudos relataram aumento dos níveis de estresse oxidativo durante a hipertensão renovascular em humanos, que foram corroborados com o modelo de dois camundongos de um rim (2K1C), bem como outros modelos animais hipertensos 2,9,10,11,12,13,14,15,16 . O mecanismo molecular de controle de expressão de renin durante a hipertensão renovascular induzida por RAStenosis não é bem compreendido e merece uma investigação mais aprofundada.

Modelos animais experimentais que recapitulam RAStenosis de forma confiável e reprodutiva são importantes na elucidação dos mecanismos celulares e moleculares do controle de expressão de renin para o desenvolvimento de novas terapias. O modelo de camundongo 2K1C é um modelo experimental bem estabelecido para estudar a patogênese da hipertensão renovascular 17,18,19,20. Este modelo é gerado pela constrição da artéria renal utilizando um clipe 17,20,21, produzindo assim oclusão da artéria renal que resulta em um aumento na expressão de renin e hipertensão 17,19,20,21. No entanto, não há relatórios técnicos disponíveis, que descrevam um procedimento passo a passo para gerar estenose da artéria renal em modelos animais.

Clipes de prata convencionais em forma de U, tubos de poliuretano e outros clipes têm sido usados para restringir a artéria renal para induzir estenose da artéria renal. Alguns estudos têm demonstrado que o design e o material do clipe são fundamentais para obter dados confiáveis e reprodutíveis com o modelo animal 2K1C. De acordo com Lorenz et al., o uso de clipes de prata convencionais projetados por U induz uma baixa taxa de sucesso de hipertensão (40-60%)²¹. Devido ao desenho do clipe, a artéria renal é pressionada lateralmente, desencadeando algumas constrições e maior probabilidade de ser desalojada da artéria renal. Maleabilidade prateada e ductilidade podem permitir alterações nas larguras do clipe; portanto, causando diferentes níveis de hipertensão entre camundongos. Os dióxidos de prata no clipe podem causar inflamação perivascular, proliferação intimal e granulação tecidual, alterando o diâmetro da artéria renal²². Devido à variabilidade nos níveis de hipertensão obtida com o clipe de prata u-design convencional, Warner et al. e Lorenz et al. usaram com sucesso um tubo de poliuretano de design arredondador para iniciar a estenose da artéria renal em camundongos, gerando uma indução mais confiável e consistente dos dois rins um clipe modelo animal^20,21.

Neste relatório, descrevemos um protocolo cirúrgico para gerar RAStenosis experimental em camundongos, usando a tubulação de poliuretano para restringir a artéria renal. O manguito de design redondo de poliuretano é um clipe mais reprodutível, confiável e de baixo custo para gerar estenose no mouse. O objetivo deste modelo experimental é estudar e definir o mecanismo molecular e celular do controle da expressão de renin durante a estenose da artéria renal. Confirmamos o sucesso do modelo de camundongos RAStenosis medindo a expressão de renin e o marcador de lesão renal neutrófilo gelatinase-associado lipocalina (N-GAL).

Protocolo

Os camundongos foram alojados e atendidos na Divisão de Cuidados com Animais do Centro Médico da Universidade Vanderbilt (VUMC) seguindo as diretrizes do National Institutes of Health (NIH) e o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA. Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da VUMC antes do início dos experimentos.

1. Preparação e dissecção animal

1. Ligue o germinador e a bomba de água da almofada de aquecimento cerca de 30 minutos antes de iniciar a cirurgia.
2. Corte tubo de poliuretano de 0,5 mm de comprimento com um bisturi afiado. Remova 0,2 mm da circunferência fazendo um corte longitudinal para fazer uma braçadeira.
   NOTA: Esta é uma parte crítica do procedimento de estenose da artéria renal que requer extrema precisão, atenção aos detalhes e paciência. Tente cortar vários pedaços de tubos de poliuretano de cada vez. Realize todo este procedimento sob microscópio.
3. Antes de prosseguir, coloque luvas cirúrgicas estéreis e uma máscara cirúrgica.
4. Use ratos C57BL/6 (WT) de 6-8 semanas. Use um número igual de ratos machos e fêmeas para evitar qualquer viés sexual.
5. Grave o peso dos camundongos antes de realizar a cirurgia. O peso ideal para realizar estenose da artéria renal com tubo de poliuretano é de 18 a 22 g. Manuseie os ratos suavemente e não se agite ao injetar a anestesia. Administrar analgesia pré-operatória (Ketofgen, 5 mg/kg de musculação corporal).
   NOTA: Ao transferir os ratos de sua sala de alojamento para a sala de cirurgia, leve-os com grande gentileza e cuidado para evitar agitação. Carregar gaiolas de ratos nas mãos em vez de um carrinho é altamente recomendado.
6. Anestesiar os camundongos com uma mistura de cetamina (100 mg/kg BW) e xilazina (10 mg/kg BW) através de injeções intraperitoneais (I.P.).
7. Coloque o mouse de volta dentro da gaiola até anestesiar completamente. Leva cerca de 4-5 minutos antes que o rato esteja totalmente inconsciente. Aperte a cauda ou o dedo do pé com fórceps para verificar se o rato está totalmente inconsciente e pronto para a cirurgia.
8. Coloque o rato de costas em uma toalha de papel. Remova o cabelo do abdômen lateral usando um cortador de cabelo elétrico seguindo a direção oposta do crescimento capilar. Após raspar o local cirúrgico, limpe a área com um esfoliante cirúrgico contendo iodo (ou clorexidina), seguido de uma lavagem com 70% de etanol (ou soro fisiológico estéril).  Repita 3 vezes.
   NOTA: O procedimento de depilação deve ser realizado a alguma distância ou preferencialmente em um banco diferente do banco do procedimento cirúrgico para evitar qualquer interferência capilar e contaminação capilar durante o procedimento cirúrgico.
9. Cubra a almofada de aquecimento com uma folha estéril. Leve o mouse para o banco cirúrgico e coloque na folha estéril, de frente para o lado lateral direito do mouse em direção ao microscópio. Mantenha uma temperatura constante da almofada de 37 °C com água circulante.
10. Abra o saco esterilizado contendo todo o equipamento cirúrgico. Usando um microscópio dissecando e uma tesoura afiada estéril, faça uma pequena incisão flanco (perto da costela torácica de^13º , a última costela no rato) e cerca de 0,5 cm de distância das vértebras. Prossiga ao longo das vértebras lombares e faça uma incisão de 1 polegada.
11. Puxe a pele e o músculo para expor o rim.
12. Limpe e remova a gordura circundante usando cotonetes estéreis para isolar a artéria renal. Isole o nervo renal da artéria renal usando fórceps curvos.
13. Ao realizar a cirurgia falsa, aplique suturas para fechar a pele e aplicar antibiótico na ferida fechada, em seguida, prossiga para cuidados pós-operatórios. Se não, prossiga com a seguinte seção para stenose a artéria.
    NOTA: Todo experimento deve ter animais falsos como controles do procedimento cirúrgico. Animais falsos consistem em camundongos que passaram pelo procedimento cirúrgico de expor a artéria renal sem colocar uma braçadeira sobre ela.

2. Estenose da artéria renal direita

1. Coloque duas suturas de nylon sob a artéria renal direita, faça nós soltos e, em seguida, coloque o manguito ao redor da artéria renal principal aproximadamente equidistante entre o rim e a bifurcação da aorta
2. Feche a braçadeira usando as suturas de nylon. Faça quatro nós para cada sutura para evitar a probabilidade de perder as suturas após a cirurgia.
3. Feche a incisão no músculo aplicando uma sutura contínua simples.
4. Faça suturas simples interrompidas para fechar a pele.
5. Administrar analgésicos aprovados pela IACUC.
   NOTA: Ferramentas cirúrgicas autoclave antes de cada uso. Se mais de uma cirurgia estiver sendo realizada de uma só vez, limpe todas as ferramentas usadas com um medidor de álcool estéril e coloque-as em germinadores quentes para 15-30 s após cada cirurgia. Troque luvas estéreis também para cada rato.

3. Cuidados pós-operatórios

1. Voltem os ratos para sua gaiola e deixem a gaiola meio em frente, meio fora, uma almofada de aquecimento de água circulante por 2 - 3 horas. Adicione alimentos de recuperação da dieta gel dentro da gaiola.
2. Administrá-lo com analgésico (cetoprofeno) intraperitoneal (dose: 5 mg/kg BW) no dia seguinte.
3. Pesar os ratos pelos próximos dois dias; se alguns camundongos perderem mais de 20% de seu peso consultar o veterinário e decidir se o animal precisa ser eutanizado após o procedimento autorizado pela IACUC.
4. Monitore os camundongos diariamente para avaliar vermelhidão, inchaço, dor ou infecção.
5. Procure consulta veterinária para complicações pós-operatórias de acordo com as políticas institucionais da IACUC..

4. Colheita de tecidos

1. Colher tecido 3 semanas após o procedimento cirúrgico. Grave o peso de cada rato.
2. Eutanize o mouse com um procedimento aprovado pela IACUC.
3. Coloque o mouse em uma plataforma estéril em posição supina para dissecar.
4. Segure e estenda os membros para limitar o movimento.
5. Pulverize minuciosamente os ratos com 70% de etanol.
6. Faça uma incisão midline para abrir o abdômen e a área do peito usando uma tesoura afiada.
7. Puxe a pele e a parede peritoneal.
8. Exponha cuidadosamente o coração e perfure o ventrículo direito e exsanguine o rato.
9. Remova ambos os rins usando fórceps. Os rins estão localizados na parte de trás dos ratos.
   NOTA: Não misture os dois rins. Esteja ciente dos rins estenosed, falso e contralateral.
10. Remova a cápsula renal, limpe-as de qualquer gordura e grave o peso de cada rim separadamente.
11. Corte uma seção longitudinal de ambos os rins e fixada em 4% pfa durante a noite a 4 °C para ser posteriormente processada para incorporação de parafina, para realizar em situ hibridização (ISH) e imunohistoquímica (IHC). Siga os protocolos ISH e IHC conforme relatado^23,24.
12. Isole o córtex do rim restante e o flash congele em nitrogênio líquido para realizar a mancha ocidental. Armazene amostras a -80 °C até a análise.
13. Quantifique expressões de renin, e N-GAL com mancha ocidental como descrito na literatura^23,24.

5. Estatísticas

1. Use ANOVA unidirecional ou bidirecional para experimentos com três ou mais condições seguidas de testes pós-hoc bonferroni para comparações entre grupos individuais. Considere um valor p igual ou inferior a 0,05 significativo. Use software (por exemplo, GraphPad Prism 8.2) para realizar todas as análises estatísticas.

Resultados

A constrição da artéria renal aumenta a expressão de renin no rim estenoso enquanto reprime a expressão no rim contralateral. O dois rim um clipe (2K1C) ou modelo Goldblatt de estenose induz aumento da expressão renin e lesão renal. Este é reconhecido como o melhor modelo representativo de estenose unilateral da artéria renal em humanos.

A expressão de renin e prorenina (precursora da renin) foram medidas utilizando-se imunoblotting. Os dados mostram que a expressão de renin e prorenina aument...

Discussão

A estenose da artéria renal é uma importante causa de hipertensão secundária ou resistente, e lesão renal ^1,29. O modelo goldblatt de dois rins (2K1C) foi empregado para estudar a hipertensão renovascular induzida por RAStenosis 1,17,18,19. Vários estudos anteriores utilizando vários modelos de animais mostraram que a estenose na artéri...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Diet Gel	Clear H2O	Diet-Gel 76A	Dieta de recuperação cirúrgica
EMC Almofada dura aquecida	Hallowell	000A2788B	Almofadas de aquecimento foram usadas para manter os ratos aquecidos
Sutura de Nylon	Ethilon Ethicon	662G	4-0 (métrica 1.5), Esta sutura foi usada para fechar o peritônio e a pele
Sutura de Nylon	Ethilon Ethicon	2815 G	8-0 (0,4 métrica), Esta sutura foi usada para fechar o manguito para amarrar e contrair a artéria
Germinator 500	Braintree Scientific Inc.	GER 5287	Esterilize ferramentas cirúrgicas entre cirurgias
Cetoprofeno	Zoetis	Ketofen	Analgésico
Poliuretano	Braintree Scientific Inc.	MRE-025	Este tubo foi usado para iniciar a estenose
Cotonetes anti-sépticos de iodopovidona	Medline	MDS093901	Foi aplicado após depilação e cirurgia na pele
Reflex 7 Clip Applier	Roboz Surgical Instrument Co	204-1000	Este aplicador de clipe foi usado para aplicar o clipe no caso de uma ou mais suturas saírem
Cortinas de toalha estéreis	Dynarex	4410	Foi usado como lençol para ratos durante a cirurgia
Pomada antibiótica tripla	Medi-First	22312
Bomba de água	Stryker	T/pump Professionals	Usado para aquecer e circular água na almofada dura de aquecimento para manter os ratos aquecidos durante e pós-cirurgia