Otimização para Sequenciamento e Análise de Amostras de RNA FFPE-RNA degradadas

Yelena Levin; Keyur Talsania; Bao Tran; Jyoti Shetty; Yongmei Zhao; Monika Mehta

doi:10.3791/61060

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Artigo de método

Otimização para Sequenciamento e Análise de Amostras de RNA FFPE-RNA degradadas

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DOI:

10.3791/61060

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8 de junho de 2020

Yelena Levin^*¹ , Keyur Talsania^*¹^,² , Bao Tran¹ , Jyoti Shetty¹ , Yongmei Zhao¹^,² , Monika Mehta¹

¹NCI CCR Sequencing Facility, Frederick National Laboratory for Cancer Research, ²Advanced Biomedical and Computational Sciences, Frederick National Laboratory for Cancer Research

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este método descreve as etapas para melhorar a qualidade e a quantidade de dados sequenciais que podem ser obtidos a partir de amostras de RNA incorporadas à parafina fixa-formalina (FFPE). Descrevemos a metodologia para avaliar com mais precisão a qualidade das amostras de FFPE-RNA, preparar bibliotecas de sequenciamento e analisar os dados das amostras de FFPE-RNA.

Resumo

A análise da expressão genética pelo sequenciamento de RNA (RNA-seq) permite insights únicos em amostras clínicas que podem potencialmente levar à compreensão mecanicista da base de várias doenças, bem como mecanismos de resistência e/ou suscetibilidade. No entanto, os tecidos FFPE, que representam o método mais comum para preservar a morfologia tecidual em amostras clínicas, não são as melhores fontes para a análise de perfil de expressão genética. O RNA obtido a partir dessas amostras é muitas vezes degradado, fragmentado e quimicamente modificado, o que leva a bibliotecas de sequenciamento subótimo. Por sua vez, estes geram dados de sequência de baixa qualidade que podem não ser confiáveis para análise de expressão genética e descoberta de mutação. Para aproveitar ao máximo as amostras de FFPE e obter os melhores dados possíveis a partir de amostras de baixa qualidade, é importante tomar certas precauções enquanto planeja o projeto experimental, preparando bibliotecas de sequenciamento e durante a análise de dados. Isso inclui o uso de métricas apropriadas para controle preciso de qualidade de amostra (QC), identificando os melhores métodos para várias etapas durante a geração da biblioteca de sequenciamento e o QC cuidadoso da biblioteca. Além disso, a aplicação de ferramentas e parâmetros de software corretos para análise de dados de sequência é fundamental para identificar artefatos em dados RNA-seq, filtrar a contaminação e leituras de baixa qualidade, avaliar a uniformidade da cobertura genética e medir a reprodutibilidade dos perfis de expressão genética entre as réplicas biológicas. Essas etapas podem garantir alta precisão e reprodutibilidade para o perfil de amostras de RNA muito heterogêneas. Aqui descrevemos as várias etapas para a amostra QC, preparação da biblioteca e QC, sequenciamento e análise de dados que podem ajudar a aumentar a quantidade de dados úteis obtidos a partir de RNA de baixa qualidade, como o obtido a partir de tecidos FFPE-RNA.

Introdução

O uso de abordagens de sequenciamento de última geração nos permitiu obter uma riqueza de informações de vários tipos de amostras. No entanto, amostras antigas e mal preservadas permanecem inviáveis para os métodos comumente utilizados de geração de dados de sequência e muitas vezes requerem modificações em protocolos bem estabelecidos. Os tecidos FFPE representam um tipo de amostra que tem sido amplamente utilizado para as amostras clínicas^1,^,²^,³. Enquanto a preservação do FFPE mantém a morfologia tecidual, os ácidos nucleicos nos tecidos FFPE geralmente exibem uma ampla gam....