Apresentado aqui está o protocolo para um ensaio in situ chemotaxis, um dispositivo microfluido recentemente desenvolvido que permite estudos de comportamento microbiano diretamente no ambiente.
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Artigo de método
In Situ Chemotaxis Assay para examinar o comportamento microbiano em ecossistemas aquáticos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Comportamentos microbianos, como motilidade e quimiotaxis (a capacidade de uma célula alterar seu movimento em resposta a um gradiente químico), são difundidos através dos domínios bacteriano e arqueológico. A quimiotaxis pode resultar em vantagens substanciais de aquisição de recursos em ambientes heterogêneos. Também desempenha um papel crucial nas interações simbióticas, doenças e processos globais, como o ciclismo biogeoquímico. No entanto, as técnicas atuais restringem a pesquisa de quimitaxis ao laboratório e não são facilmente aplicáveis no campo. Apresentado aqui é um protocolo passo-a-passo para a implantação do ensaio in situ chemotaxis (ISCA), um dispositivo que permite um interrogatório robusto de quimitaxis microbianas diretamente no ambiente natural. O ISCA é um dispositivo microfluido que consiste em uma matriz de 20 poços, na qual produtos químicos de interesse podem ser carregados. Uma vez implantados em ambientes aquosos, os produtos químicos difundem-se dos poços, criando gradientes de concentração que os micróbios sentem e respondem nadando nos poços via quimiotaxis. Os conteúdos do poço podem então ser amostrados e utilizados para (1) quantificar a força das respostas quimotacticas a compostos específicos através da citometria de fluxo, (2) microrganismos responsivos isolados e culturais, e (3) caracterizar a identidade e o potencial genômico das populações que respondem através de técnicas moleculares. O ISCA é uma plataforma flexível que pode ser implantada em qualquer sistema com uma fase aquosa, incluindo ambientes marinhos, de água doce e solo.
Introdução
Diversos microrganismos usam motilidade e quimiotaxis para explorar ambientes de nutrientes irregulares, encontrar hospedeiros ou evitar condições deletérios1,,2,3. Esses comportamentos microbianos podem, por sua vez, influenciar as taxas de transformação química4 e promover parcerias simbióticas entre os ecossistemas terrestres, de água doce e marinha2,,5.
A quimiotaxis tem sido extensivamente estudada em condições laboratoriais nos últimos 60 anos....
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Protocolo
Recomendamos executar a seção 1 antes de experimentos de campo para otimizar resultados.
1. Otimização laboratorial
NOTA: Os volumes descritos no procedimento de otimização são suficientes para um único ISCA (composto por 20 poços).
- Preparação do produto químico de interesse
NOTA: A concentração ideal para cada quimioattractant muitas vezes precisa ser determinada em condições laboratoriais antes das implantações de campo. O campo de concentração química diminuirá em magnitude com distância da fonte (poço ISCA), o que significa que a concentração experimentada por microrganismos no ambiente será meno....
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Resultados
Esta seção apresenta resultados laboratoriais usando o ISCA para testar a resposta quimotactica de micróbios marinhos a uma faixa de concentração de glutamina, um aminoácido conhecido por atrair bactérias do solo14. A concentração de glutamina que provocou a resposta quimotactica mais forte nos testes laboratoriais foi utilizada para a realização de um ensaio de quimiotaxis no ambiente marinho.
Para realizar os testes laboratoriais, as comunidades de água do mar amostra.......
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Discussão
Na escala dos microrganismos aquáticos, o ambiente está longe de ser homogêneo e muitas vezes é caracterizado por gradientes físicos/químicos que estruturam comunidades microbianas1,,15. A capacidade dos microrganismos motile de usar o comportamento (ou seja, quimiotaxis) facilita o forrageamento dentro desses microambientes heterogêneos1. Estudar quimiotaxis diretamente no ambiente tem o potencial de identificar importantes interações int.......
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Divulgações
Os autores não declaram conflito de interesses.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada em parte pela Iniciativa de Microbiologia Marinha da Fundação Gordon e Betty Moore, através da concessão GBMF3801 a J.R.S. e R.S., e um Prêmio investigador (GBMF3783) para a R.S., bem como uma Bolsa do Conselho de Pesquisa Australiano (DE160100636) para J.B.R., um prêmio da Simons Foundation para B.S.L. (594111), e uma bolsa da Simons Foundation (542395) para r.S. como parte dos Princípios dos Ecossistemas Microbianos (PriME) Colaborativo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cola acrílica | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Folha acrílica | McMaster-Carr | 8505K725 | Ou empresa diferente |
| Fita adesiva | Scotch | 3M 810 | Fita adesiva Scotch Magic |
| Autoclave | Systec | D-200 | Ou empresa diferente |
| Centrífuga de bancada | Fisher Scientific | 75002451 | Ou empresa diferente |
| Corda elástica | Paracord Planet | 667569184000 | Ou empresa diferente |
| Tubo de centrífuga - 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Tubo Eppendorf |
| Tubo de centrífuga cônico - 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Tubo Falcon |
| Tubo de centrífuga cônico - 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Tubo Falcon |
| Braço de implantação | Irwin | 1964719 | Ou empresa diferente |
| Plugue de gabinete de implantação | Fisher Scientific | 21-236-4 | Ver alternativas no manuscrito |
| Limpadores descartáveis | Kimtech - Fisher Scientific | 06-666 | Citômetro |
| de fluxo | Kimwipes Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldeído 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Ou empresa diferente |
| Corante fluorescente verde | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Verde I - diluição final 1:10.000 |
| Cartucho de filtro GP hidrofílico - 0,2 µ m | Filtro Merck | C3235 | Sterivex |
| Ensaio de quimiotaxia in situ (ISCA) | - | Entre em contato com os autores correspondentes | |
| Cortador a laser | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Ou empresa diferente |
| Luria Bertani Caldo | Sigma Aldrich | L3022 | Ou empresa diferente |
| Caldo marinho 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon parafusos de cabeça chata com fenda | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 &vezes; 4 &vezes; 8 mm |
| Conjunto de pipetas | Fisher Scientific | 05-403-151 | Ou empresa diferente |
| Pontas de pipeta - 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Ou empresa diferente |
| Pontas de pipeta - 20 µ L | Fisher Scientific | 21-236-4 | de empresas diferentes |
| - 200 µ L | Fisher Scientific | 21-236-1 | Ou empresa diferente |
| Sal marinho | Sigma Aldrich | S9883 | Para pipeta sorológica artificial de água do mar |
| - 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Ou empresa diferente |
| Filtro de seringa - 0,02 µ m | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Filtro de seringa - 0.2 µ m | Fisher Scientific | 10695211 | Ou empresa diferente |
| Seringa agulha 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0,4 × Seringas de 12 mm |
| - 1 mL | Codau | 329650 | Insulina Luer U-100 |
| Seringas - 10 mL | BD | 303134 | Ou empresa diferente |
| Seringas - 50 mL | BD | 15899152 | Ou empresa diferente |
| Tubo rack - 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Ou empresa diferente |
| Rack de tubos - 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Ou empresa diferente |
| Torneira de Uso Geral de Aço de Alta Velocidade Não Revestida | McMaster-Carr | 8305A77 | Ou empresa diferente |
| Filtro de vácuo - 0.2 µ m | Filtro Merck | SCGPS05RE | Steritop |
Referências
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., A....
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Reimpressões e permissões
