Artigo de método

Uma plataforma lab-on-a-chip para estimular a mecanotransdução de osteócitos e analisar resultados funcionais da remodelagem óssea

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DOI:

10.3791/61076

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21 de maio de 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, The University of Akron

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos protocolos para analisar a remodelagem óssea dentro de uma plataforma lab-on-a-chip. Um dispositivo de carregamento mecânico impresso em 3D pode ser emparelhado com a plataforma para induzir a mechanostransdução de osteócitos, deformando a matriz celular. A plataforma também pode ser usada para quantificar os resultados funcionais de remodelação óssea de osteoclastos e osteoblastos (reabsorção/formação).

Resumo

A remodelagem óssea é um processo bem regulado que é necessário para o crescimento e reparo esquelético, bem como adaptação às mudanças no ambiente mecânico. Durante esse processo, os osteócitos mecanosensíveis regulam as respostas opostas entre os osteoclastos catabólicos e osteoblastos anabólicos. Para entender melhor as vias de sinalização altamente intrincadas que regulam esse processo, nosso laboratório desenvolveu uma plataforma fundacional lab-on-a-chip (LOC) para analisar resultados funcionais (formação e reabsorção) de remodelação óssea dentro de um sistema de pequena escala. Como a remodelagem óssea é um processo demorado que ocorre na ordem de semanas a meses, desenvolvemos protocolos de culturing celular de longo prazo dentro do sistema. Os teoblastos e osteoclastos foram cultivados em substratos de atividade funcional dentro do LOC e mantidos por até sete semanas. Posteriormente, os chips foram desmontados para permitir a quantificação da formação e reabsorção óssea. Além disso, projetamos um dispositivo de carregamento mecânico impresso em 3D que combina com a plataforma LOC e pode ser usado para induzir mecanotransdução de osteócitos, deformando a matriz celular. Otimizamos protocolos de cultivo celular para osteócitos, osteoblastos e osteoclastos dentro da plataforma LOC e abordamos preocupações de esterilidade e citotoxicidade. Aqui, apresentamos os protocolos para fabricação e esterilização do LOC, semeamento de células em substratos funcionais, indução de carga mecânica e desmontagem do LOC para quantificar os resultados do ponto final. Acreditamos que essas técnicas estabelecem as bases para o desenvolvimento de um verdadeiro órgão-em-um-chip para a remodelagem óssea.

Introdução

Osso é um tecido altamente dinâmico que requer uma coordenação intrincada entre os três principais tipos de células: osteócitos, osteoblastos e osteoclastos. As interações multicelulares entre essas células são responsáveis pela perda óssea que ocorre durante a paralisia e a imobilidade a longo prazo e pela formação óssea que ocorre em resposta ao crescimento e exercício. Os osteócitos, o tipo de célula óssea mais abundante, são altamente sensíveis a estímulos mecânicos aplicados ao osso. A estimulação mecânica altera a atividade metabólica dos osteócitos e leva a um aumento nas moléculas de sinalização chave1,2. Através desse processo, conhecido como mecanotransdução, os osteócitos podem coordenar diretamente as atividades de osteoblastos (células formadoras ósseas) e osteoclastos (células de resorização óssea). A manutenção da homeostase óssea requer uma regulação rigorosa entre a formação óssea e as taxas de reabsorção óssea; no entanto, interrupções nesse processo podem resultar em estados da doença, como osteoporose ou osteopetrose.

A complexidade das interações entre esses três tipos de células se presta bem à investigação utilizando tecnologias microfluidas e lab-on-a-chip (LOC). Para isso, nosso laboratório estabeleceu recentemente a prova do conceito de uma plataforma LOC para análise de reabsorção e formação óssea (resultados funcionais) no processo de remodelação óssea. A plataforma pode ser usada para o estudo de interações celulares, ambientes de carregamento alterados e triagem de medicamentos investigacionais. Nos últimos anos, vários dispositivos microfluidos foram desenvolvidos para investigar as vias de sinalização molecular que regulam a remodelagem óssea; no entanto, muitos desses sistemas quantificam a remodelação através de marcadores indiretos que são indicativos de atividade funcional3,4,5,6,7. Uma vantagem do nosso sistema é que ele pode ser usado para quantificação direta de resultados funcionais. A remodelagem óssea é um processo de longo prazo. Como tal, a quantificação direta da reabsorção e formação óssea requer um sistema de cultivo que pode ser mantido por um mínimo de várias semanas a meses8,,9,,10,,11. Assim, ao desenvolver a plataforma LOC, estabelecemos protocolos de cultivo de longo prazo necessários para formação e reabsorção e mantivemos células dentro do sistema por até sete semanas11. Além disso, incorporamos substratos de cultivo apropriados para ambos os tipos de células na plataforma; osteoclastos foram cultivados diretamente no osso, e os osteoblastos, que são conhecidos por serem adeptos de plástico, foram cultivados em discos de poliestireno. Além disso, abordamos questões relativas à esterilidade, citotoxicidade a longo prazo e desmontagem de chips para análise de remodelagem11,12.

A plataforma LOC também pode ser usada para induzir mecanotransdução de osteócitos através da deformação matricial. Um dispositivo de carregamento mecânico impresso em 3D foi desenvolvido para emparelhar com o LOC e aplicar uma distensão estática fora do plano para esticar as células13. Para acomodar esta carga mecânica, a profundidade do poço dentro do LOC foi aumentada. Este dispositivo de carregamento mecânico simples e de pequena escala pode ser facilmente produzido por laboratórios com experiência de engenharia limitada, e já compartilhamos desenhos dos componentes impressos em 3D13. No trabalho atual, demonstramos algumas das novas técnicas necessárias para o uso bem-sucedido do LOC. Especificamente, demonstramos fabricação de chips, semeamento celular em substratos funcionais, carga mecânica e desmontagem de chips para remodelação da quantificação. Acreditamos que a explicação dessas técnicas se beneficia de um formato visual.

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Protocolo

1. Preparação da máscara de chip

NOTA: As etapas 1.1 - 1.3 só precisam ser realizadas uma vez após o recebimento inicial da máscara do chip. Garantem que a máscara não se curva durante o uso. O desenho das máscaras microfluidas foi descrito anteriormente11,14. As máscaras foram projetadas internamente e fabricadas comercialmente usando estereótografia de alta resolução(Figura 1A).

  1. Cubra a superfície superior da máscara com folhas plásticas para proteger esta superfície do adesivo. Fixe a máscara do chip a uma folha de acrílico igualmente dimensionada usando adesivo de spray. Aperte as peças durante a noite para permitir que o adesivo cure completamente. Depois que o adesivo estiver seco, remova o lençol plástico da parte superior da máscara.
  2. Conecte a parte inferior da folha de acrílico a uma caixa de nivelamento impresso em 3D(Figura Suplementar 1, Arquivos Suplementares 1-4) usando fita dupla face. Pressione firmemente para garantir uma ligação apertada.
  3. Sele quaisquer pequenas aberturas perto da parede destacável da caixa de nivelamento com um selante impermeável. Deixe o selante curar por 24 h.
  4. Limpe a superfície da máscara com 70% de etanol (EtOH). Coloque a caixa de nivelamento com a máscara de chip desejada no forno. Use um trator digital para garantir que a parte superior da máscara esteja nivelada. Ajuste os parafusos de nivelamento, se necessário.

2. Fabricação pdms

NOTA: Um design de chip de poço raso (1 mm) é usado para ensaios de atividade funcional (formação e reabsorção) e um projeto de chip de poço profundo (10 mm) é usado para estudos de carregamento mecânico. A parte inferior do poço profundo é formada pela fixação de uma membrana PDMS fina separada(Figura 1B).

  1. Camada da tampa (Camada 1)
    1. Combine 63 g de pré-polímero PDMS e 6,3 g de agente de cura (proporção 10:1) em um copo plástico. Misture bem com uma espátula de célula descartável e degas em um dessecador a vácuo por 30 min.
    2. Despeje lentamente a mistura na caixa de nivelamento preparada. Deixe o PDMS sentar por 30 min e depois asse a 45 °C por 18 h.
    3. Solte as bordas do PDMS com uma espátula de laboratório afilada e remova a folha de polímero da caixa de nivelamento.
    4. Corte as tampas individuais ao tamanho (70 mm x 34 mm) usando um bisturi e um modelo impresso em 3D.
    5. Perfurar furos de acesso através de cada tampa com um soco de biópsia (1 mm de diâmetro).
    6. Limpe as tampas com fita adesiva.
      NOTA: Se as tampas não estiverem sendo usadas imediatamente, enrole cada uma na fita de embalagem e armazene à temperatura ambiente (RT).
  2. Camada de bem e microcanal (Camada 2)
    1. Combine o pré-polímero PDMS e o agente de cura (proporção 10:1) em um copo plástico. O design de poço raso requer 43 g de pré-polímero e 4,3 g de agente de cura, e o projeto de poço profundo requer 227 g de pré-polímero e 22,7 g de agente de cura. Misture o polímero vigorosamente e degas por 30 min.
      NOTA: Isto pressupõe uma dimensão de máscara de 152,4 mm x 152,4 mm.
    2. Despeje lentamente a mistura sobre a máscara pré-nivelada apropriada. Deixe o PDMS sentar por 30 min e depois asse a 45 °C por 18 h.
    3. Solte as bordas do PDMS com uma espátula de laboratório catrantes e retire cuidadosamente o polímero da máscara. Use um bisturi e um modelo impresso em 3D para cortar chips individuais.
      NOTA: Para estudos de carregamento é importante que as dimensões do chip (70 x 34 mm) sejam precisas e que o poço esteja localizado no centro do chip.
    4. Limpe a superfície do PDMS com fita adesiva.
      NOTA: Se os chips não estiverem sendo usados imediatamente, enrole cada chip na fita de embalagem e armazene em RT.
  3. Membrana PDMs fina (Camada 3)
    NOTA: Esta camada é usada apenas para o design de poços profundos.
    1. Adicione 12,7 g de pré-polímero PDMS e 1,3 g de agente de cura (proporção 10:1) a um copo plástico. Misture vigorosamente e degas por 30 min.
    2. Despeje lentamente o polímero na caixa de nivelamento preparada e raspe completamente o copo de plástico para remover o máximo de PDMS possível.
    3. Use espátula celular para espalhar PDMS por toda a superfície.
      NOTA: Se o polímero não for distribuído manualmente, a tensão superficial será suficiente para evitar que o polímero forme uma folha uniforme.
    4. Deixe o PDMS sentar por 30 min e depois asse a 45 °C por 18 h.
    5. Solte as bordas do PDMS com uma espátula afilada e remova cuidadosamente a folha PDMS da caixa de nivelamento. Corte membranas individuais que correspondam às dimensões da camada 2.
    6. Meça a espessura da membrana no centro da membrana usando pinças. Descarte quaisquer membranas que estejam fora da espessura desejada (0,5 mm ± 0,1 mm).
    7. Limpe cuidadosamente as membranas com fita adesiva e coloque em um pedaço de filme de parafina.
      NOTA: Se as membranas não estiverem sendo utilizadas imediatamente, cubra a parte superior da membrana com fita adesiva e armazene em RT.

3. Substratos da atividade funcional

NOTA: Os discos de poliestireno e os wafers ósseos devem ser anexados ao fundo dos poços que serão utilizados para culturas de osteoblasto e osteoclast, respectivamente.

  1. Discos de poliestireno(Figura 1C)
    1. Coloque fita adesiva na parte de trás de uma cultura de tecido tratada deslizamento de cobertura de poliestireno. Corte os discos circulares da lâmina usando um borer de cortiça afiado (5,4 mm de diâmetro). Submergir os discos em 70% de EtOH e sair durante a noite.
    2. Esfregue suavemente a superfície superior do disco com um aplicador de ponta de algodão embebido em 70% de EtOH. Certifique-se de que a borda externa do disco está completamente limpa.
    3. Usando dois pares de fórceps, segure o disco e remova o backup da fita adesiva. Coloque o disco tratado lado para baixo e limpe a parte traseira com um aplicador de ponta de algodão.
    4. Mergulhe a extremidade de madeira de um aplicador de algodão em uma mistura desgasesada de PDMS não curado e coloque uma pequena quantidade do polímero na parte inferior do poço desejado.
      NOTA: O PDMS não curado pode ser armazenado a -20 °C.
    5. Coloque o disco de poliestireno, tratado de lado para cima, no poço e pressione suavemente para baixo no disco com um cotonete. Certifique-se de que nenhum PDMS não curado entre em contato com o lado tratado do disco.
      NOTA: Se o PDMS entrar em contato com a superfície tratada do disco, remova o disco do poço e repita as etapas 3.1.4 e 3.1.5 com um novo disco.
    6. Deixe o chip sentar em uma superfície nivelada por 30 min e depois asse a 65 °C por 4 h.
  2. Bolachas ósseas
    1. Use fórceps para colocar um wafer ósseo (6 mm de diâmetro, 0,4 mm de espessura) na parte inferior de um prato de 100 mm. Segure o wafer firme com os fórceps e etch suavemente um 'X' na parte de trás do wafer com um bisturi.
      NOTA: Durante o processo de imagem, o 'X' é usado para distinguir entre a parte de trás do wafer e a superfície em que as células foram semeadas.
    2. Use a extremidade de madeira de um aplicador de ponta de algodão para adicionar uma pequena quantidade de PDMS não curado ao fundo do poço desejado. Coloque o wafer ósseo, marcado de lado para baixo, no poço e use um aplicador de ponta de algodão para pressionar o wafer para baixo.
    3. Deixe o chip sentar em uma superfície nivelada por 30 min e depois asse a 65 °C por 4 h.

4. Montagem e esterilização de chips

  1. Ative as superfícies da camada 1 e da camada 2 com um limpador de plasma para 30 s usando uma configuração de potência de média radiofrequência (RF) (equivalente a aproximadamente 10,2 W).
  2. Alinhe os orifícios de acesso na camada 1 com os microcanais na camada 2 e pressione firmemente as duas camadas juntas.
  3. Para o design de poço profundo, repita a etapa 4.1 com a camada 2 e a camada 3. Durante o tratamento plasmático, use fita dupla face para anexar a película de parafina da camada 3 a uma superfície plana.
  4. Use um bisturi para cortar o excesso de material da membrana PDMS. Retire cuidadosamente a folha de filme de parafina da parte inferior do chip
  5. Asse o chip a 65 °C por 10 min para aumentar a força de ligação entre as camadas pDms.
  6. Insira pontas de distribuição em ângulo (18 Gauge, 0,5 em, 90°) nos orifícios de acesso na tampa. Segure as pontas de distribuição na tampa com um epóxi de duas partes. Use uma ponta de micropipeta para aplicar o epóxi em torno de cada ponta de distribuição.
  7. Depois que o epóxi tiver curado completamente, limpe a superfície do chip com 70% de EtOH e coloque em um armário de biossegurança. Execute todas as etapas subseqüentes dentro do gabinete de biossegurança.
  8. Conecte uma seringa de 5 mL às pontas de distribuição com tubos de silicone estéreis (1/32'' ID, ~10 cm de comprimento) e encha o chip inteiro com 70% de EtOH para pelo menos 30 s. Para o projeto de poçor-raso, administre todos os líquidos com uma bomba de seringa definida a uma taxa de fluxo de 4 mL/h. Para o projeto do poço profundo, administre todos os líquidos dispensando lentamente a seringa manualmente.
  9. Remova o EtOH do chip e esterilize o chip com luz UV durante a noite.
  10. Lave o chip 3 vezes com dH2O. Encha o chip com dH2O, retire a tubulação das pontas de distribuição e incuba por pelo menos 48 h a 37 °C.

5. Conjunto de dispositivos de carregamento mecânico

NOTA: Os processos de projeto e fabricação do dispositivo de carregamento mecânico impresso em 3D(Figura 2A-C)foram previamente descritos e todos os arquivos de design para componentes impressos foram previamente fornecidos13.

  1. Autoclave todos os componentes do dispositivo de carregamento por 30 min a 121 °C.
    NOTA: Para evitar a derção dos componentes impressos, enrole cada peça individualmente em papel alumínio e coloque sobre uma superfície plana dura durante o processo de autoclaving. O hardware de metal pode ser embrulhado. Complete todas as etapas subseqüentes dentro de um gabinete de biossegurança.
  2. Coloque uma mola de compressão ao redor do eixo da placa e insira a placa no orifício central na parte inferior da base(Figura 2D).
  3. Conecte o bloco de discagem à parte inferior da base usando quatro parafusos de auto-toque.
  4. Coloque uma segunda mola de compressão ao redor do parafuso central. Insira o parafuso no orifício em forma de hexagonal na parte inferior do mostrador e aparafusar o conjunto no orifício rosqueado no centro do bloco de discagem.
  5. Dane-se quatro impasses entre homens e mulheres na parte inferior da base.
  6. Remova a folga do dispositivo girando o mostrador no sentido anti-horário até que a parte superior da placa esteja abaixo da parte superior da base. Em seguida, gire lentamente o mostrador no sentido horário até que o topo da placa esteja nivelado com o topo da base.

6. Experimentação

NOTA: Os protocolos para experimentos de atividade funcional foram previamente fornecidos11,12.

  1. Estudos de carregamento (Figura 3)
    1. Seguindo o passo 4.9, use uma seringa de 5 mL para remover o dH2O do chip de poço profundo. Cubra a parte inferior do poço com 200 μL de 0,15 mg/mL tipo I de colágeno (CTI) em 0,02 M ácido acético por 1 h.
    2. Enxágüe o chip três vezes com o salino tamponado de fosfato de Dulbecco com cálcio e magnésio (DPBS++).
    3. Coloque o chip no porta-chip e a semente com osteócitos MLO-Y4 a uma densidade de 2 x 104 células/mL em meio alfa essencial mínimo (MEMα) suplementado com soro de bezerro de 5%, 5% de soro bovino fetal e 1% de penicilina/estreptomicina.
    4. Retire o tubo das pontas de distribuição e coloque o chip em um prato de cultura de poço profundo (150 mm x 25 mm). Incubar células a 37 °C e 5% CO2 por 72 h.
    5. Conecte tubos estéreis às pontas de distribuição e use uma seringa de 5 mL para remover o meio de cultura gasto do chip. Dispense lentamente em meio de cultura fresca para reabastecer o chip.
    6. Coloque o suporte do chip na inseta retangular na parte superior da base do dispositivo de carregamento. Alimente o tubo através das ranhuras localizadas na tampa do dispositivo de carregamento e fixe a tampa na base com quatro parafusos de cabeça de panela e porcas de cânume.
      NOTA: Para garantir que a tampa permaneça nivelada, primeiro fixe dois parafusos que estão localizados diagonalmente um do outro antes de fixar os dois parafusos restantes.
    7. Aplique carga nas células girando o mostrador no sentido horário até que o deslocamento de chapa desejado seja alcançado.
      NOTA: O dispositivo foi projetado para que uma rotação do mostrador equivale a um deslocamento de placa de 1 mm. O campo de tensão gerado na parte superior da membrana PDMS foi previamente modelado em função do deslocamento de chapas utilizando análise de elementofinte (FEA)13.
    8. Coloque o dispositivo de carregamento em uma caixa de ponta de micropipete P1000 vazia. Incubar as células com a carga aplicada por 15 min.
      NOTA: O período de tempo de carregamento utilizado aqui serve de exemplo. Podem ser utilizados tempos de carregamento alternativos.
    9. Após a incubação, remova a carga das células girando o mostrador no sentido anti-horário até que a placa retorne à posição inicial original. Remova a tampa do dispositivo e coloque o suporte do chip na placa de cultura do poço profundo. Incubar as células por um período de recuperação de carga pós-carga de 90 min.
      NOTA: Mais uma vez, o período de tempo de recuperação utilizado aqui serve de exemplo. Tempos de recuperação alternativos podem ser usados. Para estudos de longo prazo, as células de alimentação a cada 72 horas.
    10. Use uma seringa de 5 mL para remover o meio condicionado do chip.
      NOTA: Este meio pode ser salvo e armazenado a -80 °C.
    11. Remova o chip do suporte do chip e use uma espátula afilada para quebrar a ligação entre a tampa PDMS e a camada do poço.
      NOTA: Os ensaios celulares agora podem ser realizados seguindo qualquer protocolo estabelecido para uma placa de cultura celular.

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Resultados

A configuração de poço raso pode ser usada para analisar a atividade funcional de osteoblastos e osteoclastos. A formação óssea através de osteoblastos e reabsorção através de osteoclastos requer tempo de cultivo na ordem de várias semanas a meses. A formação óssea dos pré-osteoblastos MC3T3-E1 foi quantificada utilizando manchas de alizarina vermelha e von Kossa11,15. No dia 49, a área média da superfície manchada com vermelho al...

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Discussão

Este artigo descreve as bases para a fabricação de uma plataforma LOC remodelante óssea para cultivar osteócitos, osteoclastos e osteoblastos. Alterando a profundidade e o tamanho do poço dentro do chip, várias configurações foram desenvolvidas para estimular osteócitos com carga mecânica e quantificar os resultados funcionais da remodelagem óssea(Figura 1B).

Durante a montagem do chip, a otimização do protocolo de oxidação plasmática foi fundamen...

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Divulgações

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência sob o Título de Fundação Nº 1060990 e EBMS 1700299. Além disso, este material é baseado no trabalho apoiado pelo Programa de Bolsas de Pós-Graduação da Fundação Nacional de Ciência sob bolsa nº (2018250692). Quaisquer opiniões, conclusões, conclusões ou recomendações expressas neste material são as dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da Fundação Nacional de Ciência.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Folha acrílicaOptix--3,175 mm de espessura
Pontas de distribuição angularesJensen GlobalJG18-0.5X-90Remova o conector de plástico antes de usar
Punção de biópsiaRobbins InstrumentsRBP-101 mm de diâmetro
Bolachas ósseasBoneslices.com0,4 mm de espessuraOsso cortical bovino Soro
bezerrobovino Hyclone
CalipersGlobal IndustrialT9F534164
Cell espátulaTPP99010
Máscara de chipProtoLabsProjetado sob medidaMaterial de impressão: Accura SL 5530
Broca de cortiçaFisher Scientific07-865-10B
Aplicador com ponta de algodãoPuritan806-WCL
Culture prato (100 mm)Corning430591Estéril, Não tratado com cultura de tecidos
Prato de cultura (150 mm)Corning430597Estéril, Não tratado com cultura de tecidos
Fita dupla face3M CompanyScotch 237
Soro fetal bovinoHycloneSH30910
FórcepsFisher Scientific22-327379
Caixa de nivelamentoFeito sob medida-Fita adesiva impressa em 3D
3M CompanyScoth 2600
MC3T3-E1 pré-osteoblastosATCCCRL-2593Subclone 4
Dispositivo de carregamento mecânicoFeito sob medida-Impresso em 3D
Mínimo essencial alfa meioGibco12571-063
MLO-Y4 osteócitos----Presente da Dra. Lynda Bonewald
Fita de embalagemDuck Brand-Fita de embalagem padrão
Filme de parafinaBemis ParafilmPM999
Penicilina / estreptomicinaInvitrogenp4333
Limpador de plasmaHarrick PlasmaPDC-001Limpador de plasma expandido
Kit de polidimetilsiloxanoDow CorningSylgard 184
Lamínulas de poliestirenoNunc Thermanox174942Estéril, tratado com cultura de tecidos
FornoQuincy Lab12-180
RAW264.7 pré-osteoclastosATCCTIB-71
BisturiBD Medical372611
Tubo de siliconeSaint-Gobain TygonABW00001 ID: 1/32" (0,79 mm), OD: 3/32" (2,38 mm)
Software SolidWorksDassault Systè mes--Usado para gerar modelos impressos em 3D e realizar
o adesivoSpray Loctite2323879adesiva multiuso
(5 ml)BD Medical309646Bomba de
seringaAparelho Harvard70-2213Bomba 11 Pico Plus
Espátula de laboratório cônicaFisher Scientific21-401-10
Duas partes expoxyLoctite13953915 minutos de conjunto rápido
Tipo I colágenoCorning354236Cauda de rato colágeno
Dessecador a vácuoBel-ArtF42010-0000
Selante impermeávelGorilla8090001100% selante de silicone
de SH30072 FEA Seringa estéril

Referências

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