Ensaio baseado em fluxo para a identificação de moduladores de autofagia para osteoartrite

Resumo

Este artigo detalha o monitoramento do fluxo de autofagia para identificar novas moléculas por triagem de imagem baseada em células.

Resumo

A autofagia é um mecanismo central para regular a homeostase. Alterações da autofagia contribuem para doenças relacionadas ao envelhecimento. Métodos fenotípicos para identificar reguladores da autofagia podem ser usados para a identificação de novas terapêuticas. Este artigo descreve um fluxo de trabalho de triagem de imagem baseado em células desenvolvido para monitorar o fluxo autofágico usando LC3 como repórter de fluxo autofágico (mCherry-EGFP-LC3B) em condrócitos humanos. A aquisição de dados é realizada usando um microscópio automatizado de sistema de triagem de imagens de alto conteúdo. Um protocolo de análise de imagem automatizado baseado em algoritmo foi desenvolvido e validado para identificar moléculas que ativam o fluxo autofágico. Etapas críticas, notas explicativas e melhorias em relação aos protocolos atuais de monitoramento de autofagia são relatados. Abordagens de triagem fenotípica fisiologicamente relevantes para atingir as características do envelhecimento podem facilitar estratégias de descoberta de medicamentos mais eficazes para doenças musculoesqueléticas relacionadas à idade.

Introdução

Muitas doenças crônicas estão associadas às características do envelhecimento, incluindo autofagia defeituosa¹. A osteoartrite (OA) é a doença articular mais prevalente e tem um grande impacto na restrição das atividades cotidianas na população idosa, mas ainda não há medidas preventivas nem tratamentos modificadores da doença².

O envelhecimento articular e a OA estão associados a características que definem a progressão da degeneração da cartilagem, incluindo autofagia defeituosa e senescência ^3,4. O direcionamento da autofagia em tecidos musculoesqueléticos pode ajudar a encontrar inovações terapêuticas para doenças reumatológicas ^5,6. A modulação farmacológica da autofagia é um mecanismo promissor e relevante para intervenção em modelos de doenças pré-clínicas⁷. Na OA, a ativação da autofagia tem sido usada para prevenir a disfunção articular⁸. Métodos para monitorar a autofagia com base em protocolos robustos e reprodutíveis que permitem a análise quantitativa podem ser usados para identificar novos agentes e facilitar o direcionamento farmacológico das características do envelhecimento relevantes para a doença.

O fluxo de autofagia reflete a atividade de degradação e é uma medida relevante para identificar novas moléculas que ativam a autofagia⁹. Este estudo descreve um método desenvolvido para determinar o fluxo autofágico medindo a atividade de degradação autofágica usando uma linhagem celular repórter de autofagia em condrócitos humanos (TC28a2). A expressão transitória de mCherry-EGFP-LC3- permite o monitoramento simultâneo de eventos de formação e degradação de autolisossomos, quantificando as diferenças na sensibilidade ao pH entre os sinais GFP e mCherry LC3 nos lisossomos de células vivas¹⁰.

A adaptação deste método relatado por citometria de fluxo a um sistema de monitoramento de imagem de expressão estável em condrócitos vivos pode permitir a identificação de moléculas que ativam o fluxo autofágico no contexto da biologia da cartilagem.

Protocolo

1. Geração de linhagem celular repórter de autofagia de condrócitos humanos imortalizados

NOTA: A geração de uma linhagem celular repórter de autofagia por transfecção estável de pBABE-mCherry-GFP-LC3 por meio do estabelecimento de uma leitura quantitativa de citometria de fluxo foi descrita anteriormente¹¹. Duas linhagens celulares foram utilizadas na transfecção retroviral: HEK 293-T17 durante o processo de cotransfecção e T/C28a2 na etapa de infecção.

1. Processo de cotransfecção
   1. Prepare o meio de crescimento para células HEK 293-T17: 500 mL de meio essencial mínimo de Eagle (EMEM), 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina (P/S). Conservar o meio de cultura a 4 °C e aquecer a 37 °C antes de cada utilização.
   2. Semeie 1 x 10⁶ células HEK 293-T17 por poço em placas de cultura de células de 100 mm, incube a 37 ° C e 5% de CO₂ e certifique-se de que estejam a ~ 75% de confluência antes de iniciar o processo de cotransfecção.
   3. Remova o meio de cultura, enxágue com solução salina balanceada de Hank (HBSS) e adicione 8 mL de EMEM com 2% de FBS e 1% de P/S.
   4. Em um tubo cônico, adicione 10 μg, 3 μg e 7 μg de pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B, VSV. G, e pCL-Eco, respectivamente. Em seguida, adicione 200 μL de meio de soro reduzido a 1x (Tabela de Materiais). Adicione o reagente de transfecção (Tabela de Materiais) como uma mistura não lipossomal de lipídios para ter uma proporção de 1:3 (1 μg de DNA: 3 μg de reagente de transfecção; volume final = 60 μL).
      NOTA: Um total de 20 μg de mistura é preparado para cada placa celular de 10 cm a ser transfectada.
   5. Incube a mistura por 20 min em temperatura ambiente. Transfira cuidadosamente a mistura de transfecção gota a gota para as células de embalagem HEK 293-T17. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO₂ pelo menos 48 h antes de verificar a expressão de proteínas verdes e vermelhas por microscopia fluorescente.
      NOTA: Nessas condições, mais de 75% das células devem ser positivas para fluorescência. Certifique-se de que a eficiência da transfecção seja alta (por exemplo, mais de 75% das células são positivas). Use DNA plasmidial de alta qualidade (por exemplo, predominantemente superenrolado e livre de DNA genômico, RNA e proteína; altamente concentrado; livre de endotoxinas e sais), bem como culturas de células de alta qualidade (por exemplo, homogêneas, de baixa passagem, monocamada, transfectadas na fase de crescimento exponencial, livres de micoplasma).
2. No mesmo dia da cotransfecção, prepare os condrócitos T/C28a2.
   1. Prepare o meio de crescimento celular T / C28a2: 500 mL de meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), 10% de soro fetal de bezerro (FCS) e 1% P / S. Armazene o meio de crescimento a 4 ° C e aqueça a 37 ° C antes de cada uso.
   2. Semeie 2 x 10⁵ T/C28a2 condrócitos em duas multiplacas de 6 poços e incube por 48 h a 37 °C e 5% de CO₂.
3. Processo de infecção retroviral
   1. Aspirar o meio de cultura a partir de células de empacotamento retroviral HEK 293-T17 obtidas na etapa 1.1.5. Enxágue 1x com 4 mL de HBSS e aspire HBSS.
   2. Adicione 2 mL de tripsina e aguarde 2 min a 37 °C. Neutralize a tripsina adicionando 6 mL de meio de cultura HEK 293-T17 e células e meio de transferência em tubos cônicos de 15 mL.
   3. Centrifugue as células a 400 x g por 5 min. Transferir o sobrenadante para um filtro estéril através de uma membrana de 0,45 μm.
   4. Aspire o meio de cultura de condrócitos T / C28a2 das multiplacas de 6 poços. Infecte as células T / C28a2 adicionando 2 mL de suspensão viral (etapa 1.3.3) por poço em multiplacas de 6 poços. Use um poço para controle (ou seja, células não transfectadas), adicionando 2 mL de meio de crescimento de células T / C28a2 em vez de suspensão viral.
   5. Incubar durante 48 h a 37 °C e 5% de CO₂.
4. Para realizar o processo de seleção, use uma seleção antibiótica em células transfectadas para eliminar células não transfectadas e obter uma população de células homogênea.
   NOTA: O vetor retroviral pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B fornece resistência a antibióticos de mamíferos à puromicina, o que permite a seleção de uma cultura de células estável após a transfecção viral. Curvas de morte para concentração ideal de puromicina de condrócitos T / C28a2 devem ser estabelecidas com antecedência para estabelecer as condições apropriadas para selecionar os clones celulares que carregam o transgene com altos níveis de expressão.
   1. Prepare o meio de crescimento da linha celular estável T / C28a2-pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B: 500 mL de DMEM, 10% FCS, 1% P / S e 2,5 μL / mL de puromicina. Conservar médio a 4 °C e aquecer a 37 °C antes de cada utilização.
   2. Mude o meio. Para cada meio de cultura aspirado multiplaca de 6 poços, enxágue 1x com 2 mL de HBSS e aspire. Adicione 2 ml de meio e incube a 37 °C e 5% de CO₂. Este é o início do processo de seleção.
   3. Substitua o meio a cada 2 dias e observe as populações de células mortas e resistentes à puromicina. Compare os resultados com as células de controle não transfectadas, que não são resistentes à puromicina e morrem.
5. Para iniciar a seleção clonal, certifique-se de que as populações monoclonais cresçam. Para cada multiplaca de 6 poços:
   1. Adicione 200 μL de meio por poço em uma multiplaca de 96 poços.
      NOTA: Cada célula selecionada da multiplaca de 6 poços será revestida em poços individuais da multiplaca de 96 poços.
   2. Use um microscópio para identificar cada população monoclonal nas multiplacas de 6 poços. Colônias formadas a partir de células únicas podem ser observadas.
   3. Aspire o meio de cultura de multiplacas de 6 poços, enxágue 1x com 2 mL de HBSS e aspire HBSS.
   4. Adicione 10 μL de tripsina a cada população monoclonal para transferir células únicas em cada poço das 96 multiplacas de poços. Incubar durante 48 h a 37 °C e 5% de CO₂.
6. Após 48 h, substitua o meio por 100 μL de meio fresco por alvéolo. Repita este procedimento até que as colônias se formem devido à expansão de células individuais.
7. Uma vez que uma única célula tenha se expandido bem, coloque cada população monoclonal em poços individuais de 24 poços, 6 poços e 100 mm de placas de cultura de células.
8. Gere uma linhagem celular monoclonal estável usando um método de classificação de célula única.
   1. Aspirar o meio de cultura de placas de cultura de células de 100 mm. Enxágue 1x com 8 mL de HBSS e aspire.
   2. Adicione 2 mL de tripsina em cada placa e incube por 2 min a 37 °C. Neutralize a tripsina adicionando 8 mL de meio de cultura.
   3. Centrifugue as células a 252 x g durante 5 min e elimine o sobrenadante. Adicione 4 mL de HBSS a cada pellet celular, ressuspenda-o cuidadosamente e transfira-o para tubos de citometria.
   4. Injete cada amostra de célula em um citômetro de fluxo (Tabela de Materiais) com tecnologia de classificação de células e separe as células com alta fluorescência verde e vermelha.
   5. Transfira as células selecionadas para tubos cônicos de 15 mL e centrifugue as células a 252 x g por 5 min. Adicionar o sedimento celular a um balão T-25 com 9 ml de meio de crescimento estável da linha celular. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂.
      NOTA: Após a classificação celular, três populações monoclonais (Tabela 1) devem ser obtidas.
9. Após 24 h, remova o meio e adicione 8 mL de meio fresco. Repita este procedimento a cada 2 dias até que as células atinjam a confluência.
   NOTA: Para estudar o fluxo autofágico, dois controles podem ser usados: rapamicina como referência de sinal de alto fluxo autofágico e cloroquina como referência de sinal de baixo fluxo autofágico. Preparar uma solução-mãe de rapamicina a 10 mM em dimetilsulfóxido (DMSO) e uma solução-mãe de cloroquina a 30 mM em H₂O e conservar a -20 °C. Para selecionar a melhor população monoclonal testando a expressão mCherry e GFP, dois métodos podem ser usados: citometria de fluxo (etapa 1.10) ou análise de imagem fluorescente de alto conteúdo (etapa 1.11).
10. Citometria de fluxo
    1. Semear 2,5 x 10⁵ células por poço de cada população monoclonal em placas de 12 poços pelo menos 24 h antes do tratamento em 1 mL de meio de crescimento de linha celular estável e incubar a 37 ° C e 5% de CO₂.
    2. No dia do tratamento, remova o meio, adicione 1 mL de meio de crescimento de linha celular estável suplementado com 2% de FCS por poço. Adicionar 10 μM de rapamicina e 30 μM de cloroquina ao meio de crescimento estável da linhagem celular com 2% de FCS e incubar por 16 h a 37 °C e 5% de CO₂.
    3. Remova o meio, enxágue com 1 mL de HBSS por poço e aspire.
    4. Adicione 500 μL de tripsina em cada poço, incube 1 min a 37 °C e neutralize a reação adicionando 500 μL de meio de cultura. Raspe as células e transfira-as para tubos cônicos.
    5. Centrifugue as células a 252 x g por 5 min e aspire o sobrenadante. Enxágue os grânulos celulares com 500 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Centrifugue a 252 x g durante 5 min e elimine o sobrenadante.
    6. Adicione 500 μL de PBS, transfira as células para tubos de citometria e injete cada amostra no equipamento de citometria. Para cada condição, colete 10.000 eventos.
    7. Para selecionar a população monoclonal por citometria de fluxo, use um laser de 488 nm para excitar EGFP e um laser de 633 nm para mCherry. Em seguida, estabeleça uma proporção de fluorescência mCherry e EGFP para selecionar a população de células com alto e baixo fluxo autofágico.
11. Análise de imagem fluorescente de alto conteúdo
    1. Semear 4 x 10³ células de cada população monoclonal por poço em placas de 384 poços (parede preta/fundo transparente) em meio de crescimento suplementado com 10% FCS, 1% P/S e 2,5 μL/mL puromicina. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ durante 24 h antes do tratamento.
    2. Remova o meio e adicione 10 μM de rapamicina e 30 μM de cloroquina em 50 μL de meio de crescimento de linha celular estável suplementado com 2% de FCS por poço. Incubar durante 16 h a 37 °C e 5% de CO₂.
    3. Remova o meio, enxágue com 50 μL de HBSS por poço e aspire. Fixe as células com paraformaldeído (PFA) a 4% por 10 min a 37 °C. Remova o PFA e enxágue com 50 μL de HBSS por poço.
    4. Para identificar os núcleos celulares, coar com Hoechst 33342 (2,5 μg/ml) durante 10 min a 37 °C. Aspire o corante Hoechst 33342, enxágue com 50 μL de HBSS por poço e adicione 50 μL de PBS por poço.
    5. Realize a aquisição e análise de dados do fluxo autofágico obtido pela plataforma HTS, conforme descrito na seção 3.
       NOTA: O critério para selecionar a população monoclonal é baseado no aumento ou diminuição do fluxo autofágico com rapamicina ou cloroquina, respectivamente (Tabela 1). Clones com altos níveis de expressão de mCherry e GFP são mais apropriados para a quantificação precisa de análise de imagens fluorescentes de alto conteúdo do fluxo de autofagia.

2. Ensaio de fluxo autofágico baseado em imagem em condrócitos vivos

NOTA: Depois de selecionar um clone, inicie o ensaio para quantificar o fluxo autofágico.

1. Usando uma pipeta eletrônica portátil de 384 canais, semeie 4 x 10³ células do clone selecionado (etapa 1.11) por poço em placas de 384 poços (parede preta/fundo transparente) em 50 μL de meio de crescimento de linha celular estável suplementado com 10% FCS, 1% P/S e 2,5 μL/mL puromicina por poço. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ durante 24 h antes do tratamento.
2. No dia do experimento, prepare uma placa de intervalo para adição de composto.
   1. Adicione um volume de cada composto/controles e meio de crescimento de linha celular estável à placa de intervalo usando tecnologia acústica de manuseio de líquidos e uma pipeta eletrônica de 384 canais, respectivamente, para obter uma concentração de intervalo.
      NOTA: Os controles neste ensaio incluíram meio de crescimento de linha celular estável suplementado com 2% de FCS, 30 μM de cloroquina e 10 μM de rapamicina. As concentrações intervaladas dependerão da concentração final desejada. Por exemplo, neste ensaio, cloroquina e rapamicina foram adicionadas em 50 μL de meio de crescimento de linhagem celular estável por poço para obter uma concentração de intervalo de 300 μM e 100 μM, respectivamente.
   2. Usando um robô lavador de microplacas, aspire o meio da placa celular de forma automatizada e adicione 45 μL de meio de crescimento de linha celular estável suplementado com 2% de FCS por poço.
   3. Em seguida, transfira 5 μL por poço da placa de intervalo para a placa de ensaio para obter uma concentração final usando outra estação de trabalho automatizada de manipulação de líquidos.
3. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ por 16 h. Usando um robô lavador de microplacas, aspire o meio.
4. Fixe as células com 50 μL de PFA a 4% por poço por 10 min a 37 °C. Lavar com 50 μL de HBSS por alvéolo.
5. Manchar os núcleos com Hoechst 33342 (2,5 μg/ml) durante 10 min a 37 °C. Aspirar Hoechst 33342 e enxaguar com 50 μL de HBSS por alvéolo.
6. Adicione 50 μL de PBS por poço. A placa agora está pronta para leitura, coleta de dados e análise subsequente.
   NOTA: Este protocolo é descrito para triagem de alto rendimento (HTS). No entanto, se poucos compostos forem usados, eles podem ser adicionados manualmente, sem instrumentos automáticos. A manipulação mínima de células e sobrenadante usando instrumentos calibrados de manuseio de líquidos e/ou pipetas eletrônicas facilita a preparação bem-sucedida de monocamadas de cultura de células para quantificação do fluxo de autofagia por análise de imagem fluorescente de alto conteúdo.

3. Aquisição de dados e análise do fluxo autofágico

1. Para aquisição de dados, use um sistema de triagem de alto conteúdo (HCS) e um microscópio automatizado, que permite a aquisição e análise automatizada de imagens por algoritmo de processamento de imagens.
2. Para desenvolver um protocolo de aquisição, selecione vários canais e tempos de exposição (Tabela 2) para identificar os núcleos e a formação de autofagossomos e autolisossomos durante eventos de fluxo autofágico.
3. Para cada poço, colete imagens de quatro campos cobrindo a superfície do poço e em quatro pilhas a partir de 8 μm separadas por uma distância de trabalho de 0,2 μm. Capture as imagens usando uma objetiva de 60x para imagens celulares detalhadas.
4. Analise os dados usando o software de análise de imagem fornecido pelo microscópio HCS. Para desenvolver um algoritmo de protocolo de análise robusto para monitoramento de fluxo de autofagia, selecione o método mais apropriado para segmentação automatizada de imagens celulares e para detectar especificamente os speckles correspondentes à ativação de LC3. Execute a sequência de análise final adicionando métodos, etapas de segmentação celular e instruções de quantificação, conforme descrito abaixo:
   1. Clique no bloco de construção Localizar núcleos e escolha o canal de corante nuclear Hoechst 33342. Selecione Método e escolha os núcleos da população de saída.
   2. Clique no bloco de construção Localizar citoplasma e escolha o canal de corante citoplasmático Fluoresceína. Selecione o método | Limiar Individual.
   3. Clique no bloco de construção Localizar citoplasma (2) e escolha a RFP do canal de corante citoplasmático. Selecione o método | Limiar Individual.
   4. Clique no bloco de construção População e selecione os Núcleos da população do estudo . Selecione o método Filtros comuns (Remover objetos de borda) e escolha a população de saída Núcleos dentro das bordas.
   5. Clique no bloco de construção Localizar pontos e escolha o canal de marcador específico Fluoresceína. Selecione a população de estudo Núcleos dentro das bordas e selecione a região de estudo Citoplasma. Selecione Método e escolha a população de saída Pontos dentro das bordas.
   6. Clique no bloco de construção Localizar pontos (2) e escolha a RFP do canal do marcador específico. Selecione a população de estudo Núcleos dentro das bordas e selecione a região de estudo Citoplasma (2). Selecione Método e escolha a população de saída Pontos (2) Dentro das bordas.
   7. Clique no bloco de construção Calcular propriedades de intensidade e escolha o canal de marcador específico Fluoresceína. Selecione a população de estudo Núcleos dentro das bordas e selecione a região de estudo Spot. Selecione Método e escolha as propriedades de saída Intensidade Spot Fluoresceína Bordas internas.
   8. Clique no bloco de construção Calcular propriedades de intensidade e escolha a RFP específica do canal do marcador. Selecione a população de estudo Núcleos dentro das bordas e selecione a região de estudo Ponto (2). Selecione Método e escolha as propriedades de saída Intensidade Spot (2) RFP Inside Borders.
   9. Clique no bloco de construção Definir resultados , selecione Núcleos de população dentro das bordas, selecione Número de objetos de núcleos (média), selecione Fluoresceína de pontos de intensidade relativa – média por poço e selecione Pontos de intensidade relativa (2) – RFP – média por poço.
5. Para quantificar o fluxo autofágico, use o mesmo método descrito anteriormente para análise de citometria de fluxo¹¹. Estabelecer a relação mCherry/EGFP dos pontos de intensidade relativa.
   NOTA: As células com maior fluxo são menos verdes, o que aumenta a relação mCherry / EGFP na célula. Identificar e quantificar com precisão um número significativo de sinais relevantes provenientes dos eventos de fluxo de autofagia nas células é muito importante para estabelecer diferenças estatisticamente significativas.

Resultados

O fluxo autofágico pode ser monitorado nas células por modulação farmacológica ou por resposta ao estresse celular. Condrócitos humanos imortalizados (T/C28a2) foram empregados para desenvolver uma linhagem celular repórter de autofagia usando LC3 como repórter fluorescente (mCherry-EGFP-LC3B) para autofagia. A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho esquemático do ensaio de triagem começando com o desenvolvimento da linhagem celular repórter de autofagia em condrócitos humanos (mCherry-EGFP-LC3...

Discussão

A autofagia defeituosa é uma característica importante da degeneração articular relacionada ao envelhecimento, mas ainda não estão disponíveis tratamentos preventivos nem modificadores da doença direcionados à autofagia para a degeneração da cartilagem². Dada a sua relevância e implicações clínicas, a autofagia tornou-se um alvo de interesse para a descoberta e desenvolvimento de medicamentos, embora métodos para monitorar diretamente as mudanças nesse mecanismo c...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de cultura de células de 100 mm Placa	de cultura de células Corning 430167	Placa de cultura de células
de 12 poços Multiplate	Corning	353043	Placa de cultura de células
15 mL Tubo cônico de centrífuga	Falcon-Corning	352095	Tubo cônico
de 24 poços Multiplate	Corning
25 cm2 Frasco	de cultura de célulasFalcon-Corning	353014	Frasco de cultura de células
Multiplate de 384 poços Cell Carrier	Perkin Elmer 6007550		Placa de cultura de células Placa
de 6 poços Multiplate	Corning	351146	Placa
cultura de células	Corning	353077	96 poços
Tecnologia acústica de manuseio de líquidos	Labcyte	−	https://www.labcyte.com
Cloroquina	Sigma-Aldrich	C6628	inibidor de fluxo autofágico
Dimetil Sulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D2650	Disolvente
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Lonza, Basel, Switzerland	BE-604F	T/C28a2 meio de crescimento
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)	ATCC	30– 2003	HEK 293-T17 meio de crescimento
FACScalibur citômetro	Becton Dickinson, CA&	minus;	https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Soro Fetal Bovino (FBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	F9665	HEK 293-T17 serum
Fetal Calf Serum (FCS)	Gibco by Life Technologies, CA	26010– 074	Serum
FuGene	Promega	E2691	Uma mistura não lipossomal de lipídios como método de entrega de plasmídeo para criar autofagia relatada linha celular Pipeta
eletrônica portátil de 384 canais	Integra	−	https://www.integra-biosciences.com/united-states/en/electronic-pipettes/viaflo-96384#downloads
Solução salina balanceada de Hank (HBSS)	Sigma-Aldrich	H6648	Buffer
HEK 293-T17	ATCC	CRL-11268	Linha celular renal. As células foram usadas para facilitar o empacotamento retroviral
Sistema de Triagem de Alto Conteúdo	Perkin Elmer	−	https://www.perkinelmer.com/es/product/operetta-cls-system-hh16000000
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	62249	de Análise de Imagem para Coloração de DNA
	Perkin Elmer	−	https://www.perkinelmer.com/es/product/harmony-4-9-office-license-hh17000010
Estação de trabalho de manipulação de líquidos	Perkin Elmer	−	https://www.perkinelmer.com/es/category/janus-liquid-handler-workstations
Robô lavador de microplacas	Biotek	−	https://go.biotek.com/405tradein
Opti-MEM® (1x)	Thermo Fisher Scientific	11058	Meio de transfecção
Paraformaldeído (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Fixer
pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B	Addgene, Cambridge, MA	22418	Plasmídeo
pCL-Eco	Addgene, Cambridge, MA	12371	Plasmídeo
Penicilina-Estreptomicina (P/S)	Sigma-Aldrich	P0781	Antibiótico
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	MP Biomedicals	2810305	tampão
Puromicina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P8833	Antibiótico
Rapamicina	Calbiochem, Alemanha	5053210	ativador de fluxo autofágico
Software CellQuestPro	Becton Dickinson	−	https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Filtros de seringa 0,45 μ m	Corning	CLS431220	Filtro estéril
T/C28a2	−	&menos;	linha celular de condrócitos humanos
Tripsina	Gibco da Life Technologies, CA	15400054	Tripsina usada com células T / C28a2
Tripsina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SM-2002-C	Tripsina usada com células HEK 293-T17
VSV. G	Addgene, Cambridge, miliampère	14888	Plasmídeo