Summary
Präsentiert wird hier ein Protokoll zur primären monozyten Isolation des menschlichen Blutes sowie deren Differenzierung in Makrophagen und dendritische Zellen und die Zusammenstellung mit Epithelzellen zu einem mehrzelligen menschlichen Lungenmodell. Biologische Reaktionen von Kokulturen, die sich aus Immunzellen zusammensetzen, die sich entweder von frisch isolierten oder aufgetauten Monozyten unterscheiden, werden bei Exposition gegenüber proinflammatorischen Reizen verglichen.
Abstract
Ein menschliches Alveolar-Zell-Kokulturmodell wird hier für die Simulation der alveolären Epithelgewebebarriere beschrieben, die aus alveolaren Epithel-Typ-II-Zellen und zwei Arten von Immunzellen besteht (d. h. menschliche Monozyten-abgeleitete Makrophagen [MDMs] und dendritische Zellen [MDDCs]). Ein Protokoll zur Zusammenstellung des mehrzelligen Modells wird bereitgestellt. Alveolare Epithelzellen (A549-Zelllinie) werden unter getauchten Bedingungen auf durchlässigen Inserts in Zweikammerbrunnen angebaut und differenziert und dann mit differenzierten MDMs und MDDCs kombiniert. Schließlich werden die Zellen für mehrere Tage einer luft-flüssigen Schnittstelle ausgesetzt. Da menschliche primäre Immunzellen von menschlichen Buffy-Schichten isoliert werden müssen, werden Immunzellen, die sich von frischen oder aufgetauten Monozyten unterscheiden, verglichen, um die Methode auf der Grundlage experimenteller Bedürfnisse anzupassen. Die dreidimensionalen Modelle, die aus alveolären Zellen mit entweder frisch isolierten oder aufgetauten Monozyten-abgeleiteten Immunzellen bestehen, zeigen eine statistisch signifikante Zunahme der Zytokin-Freisetzung (Interleukins 6 und 8) bei Exposition gegenüber proinflammatorischen Reizen (Lipopolysaccharid und Tumornekrosefaktor) im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Andererseits gibt es keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen der zytokinen Freisetzung, die in den Kokulturen beobachtet wird. Dies zeigt, dass das vorgestellte Modell auf proinflammatorische Reize in Gegenwart von MDMs und MDDCs reagiert, die sich von frischen oder aufgetauten peripheren Blutmonozyten (PBMs) unterscheiden. Somit ist es ein leistungsfähiges Werkzeug für Untersuchungen der akuten biologischen Reaktion auf verschiedene Substanzen, einschließlich aerosolisierter Medikamente oder Nanomaterialien.
Introduction
In-vitro-Lungenzellkulturen bieten kostengünstige, robuste und gut kontrollierte Plattformen zur Beurteilung der Gefahren von Aerosolen1. Als Modellzellsystem für humane Alveolarpneumozyten wird häufig die epitheliale A549-Zelllinie verwendet, die aus einem pulmonalen Adenokarzinom isoliert ist2. Diese Zellen stellen Plattenepitheltyp II Epithelzellen aus dem Alveolarbereich3 dar und sind eine weit verbreitete Lungenzelllinie für die Gefahren- und Toxizitätsbewertung1,4,5,6,7,8,9,10. Die A549-Zelllinie besitzt relevante Merkmale von Alveolarepithel-Typ-II-Zellen, wie das Vorhandensein charakteristischer Lamellarenkörper, die dicht gepackte Phospholipideenthalten 3.
Es hat sich gezeigt, dass, wenn die Zellen an einer luft-flüssigen Schnittstelle (ALI) kultiviert werden, Tensid auf der apikalen Seite von luftexponierten Epithelzellen freigesetzt wird, wodurch die Oberflächenspannung11,12,13reduziert wird. Diese Eigenschaft ist besonders wichtig bei Untersuchungen von Atemwegsgefahren und Toxizitätdurchforschungen im Nanomaterial. Sobald inhalierte Nanomaterialien/Toxische Stoffe in der Alveolarregion abgelagert sind, interagieren sie zunächst mit pulmonalen Tensidunden und werden durch Benetzungskräfte in die wässrige Hypophase verdrängt, wo die Wechselwirkung mit Lungenzellen stattfindet14,15. Obwohl A549-Zellen eine Monoschicht bilden (die zu späteren Zeitpunkten in Mehrschichten überwuchern kann, wenn sie bei ALI kultiviert werden) und Tensid produzieren, ist ein Nachteil ihre unzureichende enge Knotenbildung, was zu niedrigen transepitheliaalen elektrischen Widerstandswerten führt, aber dennoch eine funktionelle Barriere gegen interzelluläre (Nano-)Partikeltranslokation16,17,18darstellt.
In der Lunge gibt es eine Vielzahl von Immunzellpopulationen, einschließlich phagozytärer und professioneller Antigen-präsentierender Zellen (d. h. Makrophagen und dendritische Zellen), die direkt durch Zell-Zell-Kontakt oder interzelluläre Signalisierung kommunizieren, um Homöostase zu kontrollieren und aufrechtzuerhalten. Makrophagen und dendritische Zellen sind kritische angeborene Immuneffektoren und Initiatoren der adaptiven Immunantwort19. Dendritische Zellen, die sich innerhalb oder unter dem Epithel befinden, können Vorsprünge über das Epithel zum Lumen bilden, um Antigene zu fangen. Alveolar-Makrophagen befinden sich auf der apikalen Oberfläche des Epithels und fungieren als Sentinelzellen, die die erste zelluläre Abwehr gegen Fremdmaterial sowie bakterielle, virale und Pilzinfektionen darstellen. Ihre phätotypische Plastizität ermöglicht eine schnelle Induktion von proflammatorischen Reaktionen als Reaktion auf solche Reize sowie die Verschiebung in auslösende entzündungshemmende (d.h. hemmende) Reaktionen20.
Um die menschliche Alveolaren-Epithel-Gewebebarriere zu simulieren, haben wir ein dreifaches Kokulturmodell mit A549-Zellen etabliert, die mit humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDMs) und dendritischen Zellen (MDDCs) auf den apikalen bzw. basalen Seitenergänztwurden. Der Anbau dieses Modells bei ALI wurde bereits gemeldet16, sogar bis zu 72 h nach der Exposition21. Akute Immunantworten auf Kohlenstoff-Nanoröhren-Expositionen wurden in der Zellkultur, die dem ALI ausgesetzt war, im Vergleich zu den untergetauchten Bedingungen signifikant verbessert22. Das Cokulturmodell, das bei ALI kultiviert und verschiedenen Materialien ausgesetzt wurde, wurde zuvor zur Untersuchung von Zytotoxizität, oxidativem Stress und Entzündungsreaktionen bei Exposition gegenüber Zinkoxid,23 Graphen-bezogenen Materialien24, Gold-Nanopartikel25,26, Kohlenstoff-Nanoröhren21und Vulkanasche- und Dieselabgaspartikeln27verwendet.
Darüber hinaus wurde die wichtige Rolle von Makrophagen und dendritischen Zellen als Immuneffektorzellen in einem in vitro menschlichen Lungenmodell bestätigt. Insbesondere wurde eine erhöhte entzündungshemmende Reaktion im Modell nur in Gegenwart von Immunzellen im Vergleich zu Monokultursystemen beobachtet7. Mögliche Nachteile der Verwendung primärer Monozyten-abgeleiteter Immunzellen sind die begrenzte Zugänglichkeit von PBM sowie die Variation von Spender zu Spender. Als Lösung für diese potenziellen Nachteile wird hier ein Protokoll vorgestellt, das die Kryokonservierung frisch isolierter PBMs28 für die Zellkulturmodellbaugruppe einführt. Ziel dieser Studie ist es, die 3D-Epithelgewebemodellbaugruppe des menschlichen Alveolar-Alveolens zu demonstrieren, einschließlich der Isolierung von PBM von menschlichen Buffy-Coats. Die Reaktionsfähigkeit auf proinflammatorische Reize wird mit dem Modell verglichen, das aus MDMs und MDDCs besteht, die sich von frischen PBMs oder von eingefrorenen/aufgetauten PBMs unterscheiden.
Die Arbeit mit nicht getesteten menschlichen Blutproben erfordert eine spezifische Sorgfalt, um die mögliche Übertragung von Infektionskrankheiten wie HIV (menschliches Immundefizienzvirus), Hepatitis B und Hepatitis C zu verhindern. Daher ist die Verwendung persönlicher Schutzmaßnahmen wie Handschuhe, Kleider, Masken und Augenschutz von entscheidender Bedeutung und muss den Grundsätzen der guten Laborpraxis entsprechen. Diese Schutzmaßnahmen reduzieren das Risiko, die Haut oder Schleimhäute potenziell infektiösen Flüssigkeiten auszusetzen. Darüber hinaus ist für diejenigen, die mit buffy Mänteln und PBMs zu tun haben, eine Impfung gegen das Hepatitis-B-Virus obligatorisch, und der Bluttiterspiegel von Antikörpern gegen Hepatitis B muss über 100 I.E./L liegen (länderspezifische gesetzliche Anforderungen müssen berücksichtigt werden). Darüber hinaus müssen alle Arbeiten in Laboratorien der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt werden (länderspezifische gesetzliche Anforderungen müssen berücksichtigt werden). Bei der Durchführung des gesamten Protokolls sollten Standardvorkehrungen im Zusammenhang mit der Arbeit in einer Laborumgebung und dem Umgang mit Säugetierzellen, einschließlich des Umgangs mit Abfällen, getroffen werden.
Protocol
Die Arbeit mit aus menschlichem Blut isolierten Primärmonozyten wurde vom Ausschuss des Bundesamtes für Gesundheit Schweiz (Referenznummer: 611-1, Meldung A110635/2) für das Adolphe Merkle Institut genehmigt.
1. Isolierung von peripheren Blutmonozyten (PBMs) von menschlichen Buffy-Coats
HINWEIS: Der folgende Abschnitt beschreibt die Isolierung von Immunzellen aus einem 50 ml Beutel eines buffy Mantels, der vom Swiss Transfusion Centre in Bern, Schweiz, erworben wurde.
- Herstellung von Reagenzien
- 100 ml magnetischer Trennpuffer pro Buffy-Mantel vorbereiten: 0,5% [w/v] Rinderserumalbumin (BSA; in phosphatgepufferter Kochchen [PBS]) mit 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und auf pH = 7,2, steriler Filter mit 0,22 m Porengröße einstellen. Während des gesamten Verfahrens bei 4 °C aufbewahren.
- Bereiten Sie das Zellkulturmedium (CCM): RPMI 1640 mit 10% [v/v] fetalem Rinderserum (FBS), 1% [v/v] L-Glutamin (hier, 2 mM L-Glutamin) und 1% [v/v] Penicillin-Streptomycin (hier 100 Einheiten/mL Penicillin und 100 g/ml Streptomycin) vor.
HINWEIS: Die erforderliche Menge jedes Reagenzes hängt von der Anzahl der Zellen ab, die in den folgenden Schritten gesät werden sollen.
- Isolierung von PBM
HINWEIS: Alle Glas- und Kunststoffwaren müssen vor dem Gebrauch sterilisiert werden. Aus Sicherheitsgründen wird die Verwendung von Kunststoffen beim Umgang mit menschlichen Blutproben empfohlen, um das Verletzungsrisiko mit Glaswaren zu reduzieren.- Verwenden Sie eine Schere, um das Schlauchende der Tasche mit dem buffy Mantel zu schneiden.
- Verteilen Sie den buffy Mantel, indem Sie den Inhalt der Tasche durch den Kanal der Tasche direkt in zwei konische Zentrifuge 50 ml Rohre (ca. 25 ml pro Stück) gießen.
- Gießen oder Pipette PBS vorsichtig in die Rohre gießen, um 50 ml Volumen zu erreichen. Mischen Sie den Inhalt, indem Sie das Rohr sanft auf den Kopf stellen 3x.
- Teilen Sie die buffy Mantel-PBS-Mischung in vier neue 50 ml konische Zentrifugenrohre, indem Sie 25 ml der Mischung in jedes frische Rohr pipetieren.
- Langsam 13 ml Dichtegradientenmedium unter dem buffy Coat-PBS-Gemisch mit einer 10 ml serologischen Pipette legen. Lösen Sie die gefüllte Pipette vom Pipettenhalter und stecken Sie sofort die obere Öffnung der Pipette mit einem Daumen, um ein zusätzliches Auslaufen des Dichtegradientenmediums in das buffy coat-PBS-Gemisch zu verhindern.
ANMERKUNG: Halten Sie die obere Öffnung mit dem Daumen, legen Sie die gefüllte Pipette an der Unterseite des konischen Zentrifugenrohrs, so dass das Dichtegradientenmedium langsam unter das buffy Coat-PBS-Gemisch fließt und etwa 1 ml des Dichtegradientenmediums in der Pipette zurückbleibt. - Wiederholen Sie Schritt 1.2.5 mit den anderen drei Tuben, die die buffy Mantel-PBS-Mischung enthalten.
- Zentrifugieren Sie alle vier Rohre, die die Gemische für 20 min bei 1.000 x g und 25 °C bei langsamer Bremsung enthalten. Verwenden Sie Halter mit Schutzdeckeln für die Zentrifugation.
- Öffnen Sie den Deckel jedes Rohres, entfernen Sie die obere Schicht, die Plasma und Blutplättchen enthält, mit einer serologischen Pipette und entsorgen Sie sie in einem Biohazard-Flüssigkeitsabfallbehälter.
- Verwenden Sie eine serologische Pipette zur Erfassung der peripheren mononukleären Blutzellschicht, die als weißlich-trübe kleine Fraktion (2–3 mm Dicke) zwischen dem Plasma und den dichtegradienten mittleren Schichten erscheint. Das Pellet enthält rote Blutkörperchen am Boden. Vermeiden Sie die Übertragung von Erythrozyten, die die unterste Schicht bilden. Wiederholen Sie dies für alle vier Röhren.
HINWEIS: Periphere mononukleäre Blutzellen bestehen aus PBMs und Lymphozyten. PBMs werden später während der magnetischen CD14+-Trennung von Lymphozyten getrennt. - Bündeln Sie periphere mononukleäre Blutzellen aus vier Röhren in zwei 50 ml-Röhren.
- Füllen Sie die beiden Rohre mit PBS auf 50 ml und decken Sie sie mit einem Deckel ab.
- Entsorgen Sie die übrig gebliebenen Erythrozyten und das Plasma aus den ursprünglichen vier Röhren in einem Biohazard-Flüssigkeitsabfallbehälter.
- Zentrifugieren Sie die beiden Rohre für 8 min bei 500 x g und 18–20 °C bei normaler Zentrifugengeschwindigkeit.
- Nach der Zentrifugation den Überstand mit einer serologischen Pipette entfernen und in einem Biohazard-Flüssigkeitsabfallbehälter entsorgen.
- Unterbrechen Sie die Zellen mit 5 ml PBS mit einer serologischen Pipette.
- Die Zellsuspensionen in einem 50 ml konischen Zentrifugenrohr bündeln und mit PBS auf 50 ml füllen.
- Verwenden Sie 5 L der Zellsuspension, um die Zellen mit einem Zellzähler mit der Trypan blue (45 -L) Ausschlussmethode zu zählen.
- Pipette 10 l der Trypan Blue-PBMs-Lösung in eine Zellzählerkammer und zählen sie die Anzahl der Zellen nach dem Standardzählprotokoll. Verwenden Sie Gleichung 1, um die Gesamtzahl der Zellen zu berechnen, CT.
- Zentrifugieren Sie nach dem Zählen der Zellen das 50 ml-Rohr wie in Schritt 1.2.13.
- CD14 positive Auswahl
- Öffnen Sie vorsichtig den Deckel jedes Rohres, dann entfernen und entsorgen Sie den Überstand mit einer serologischen Pipette, ohne das Pellet zu stören.
- Fügen Sie die berechnete Menge (Gleichung 2) des magnetischen Trennpuffers hinzu (hier 80 l Puffer pro 1 x 107 Gesamtzellen) und setzen Sie das Zellpellet wieder auf, indem Sie die Lösung nach oben und unten pipetieren.
- Berechnen Sie mit Gleichung 3 (hier 10 l pro 1 x 107 Gesamtzellen) das entsprechende Volumen von CD14+ Magnetperlen und Pipette das entsprechende Volumen.
- Gut mischen, indem Sie nach oben und unten pfeifen, den Deckel schließen und die Lösung bei 4 °C für 15 min inkubieren.
- Nach der Inkubation das Rohr bis zu 50 ml mit einem magnetischen Trennpuffer füllen.
- Zentrifuge wie in Schritt 1.2.13.
- Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand mit einer serologischen Pipette, ohne das Zellpellet zu stören.
- Pipette die entsprechende Menge an magnetischem Trennpuffer (Gleichung 4; hier, 500 l Puffer pro 1 x 108 Zellen) und sanft mischen durch Pipetieren nach oben und unten 3x.
- Desinfizieren Sie die magnetische Trennstation, indem Sie sie mit einem Sterilisationsmittel besprühen und abwischen. Zur magnetischen Trennung in die laminare Durchflusshaube zusammen mit der Säule legen.
- Legen Sie die magnetische Trennsäule in das Magnetfeld und legen Sie ein leeres 50 ml kegelförmiges Zentrifugenrohr direkt unter die Säule, um die Wasch- und unbeschrifteten Zellen (d. h. Abfall) zu sammeln.
- Spülen Sie die magnetische Trennsäule, indem Sie 3 ml magnetischen Trennpuffer in die Säule pipetieren. Lassen Sie die Säule während des gesamten Verfahrens nicht austrocknen.
- Bereiten Sie ein 15 ml kegelförmiges Zentrifugenrohr und eine Pipette 1 ml magnetischen Trennpuffer vor.
- Tragen Sie die Zellsuspension (vorbereitet in Schritt 1.3.8) auf die magnetische Trennsäule auf. Sammeln Sie im 50 ml konischen Zentrifugenrohr unter dem Filter unbeschriftete Zellen, die durchgegangen sind.
HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 2 x 109 Zellen pro Spalte, um eine Blockierung der Spalte zu vermeiden. - Sobald das Säulenreservoir leer ist (d. h. wenn die Zellen durch die Säule gegangen sind), wenden Sie 3 ml magnetischen Trennpuffer mit einer serologischen Pipette auf und lassen Sie es durch die Säule gehen. Wiederholen Sie diese 3x.
- Entfernen Sie die magnetische Trennsäule aus dem magnetischen Separator, indem Sie sie vorsichtig mit den Händen ziehen, und legen Sie sie dann in ein 15 ml-Rohr, das vorpipetted 1 ml magnetischen Trennpuffer enthält (vorbereitet in Schritt 1.3.12).
- Fügen Sie der Säule 5 ml magnetischen Trennpuffer hinzu und spülen Sie die magnetisch beschrifteten Zellen aus, indem Sie den Kolben fest in die Säule drücken.
- Reagenzpräparat zur MDM- und MDDC-Differenzierung
- Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler mit der Trypan blue Exclusion-Methode wie in Schritt 1.2.17.
- Berechnen Sie die erforderlichen Volumina von CCM oder FBS für weitere Schritte wie folgt: entweder das Volumen von CCM, das einer Zelldichte von 1 x 106 Zellen/ml entspricht (Schritt 1.5.1), oder das Volumen von FBS, das einer Zelldichte von 6 x 106 Zellen pro 0,9 ml FBS entspricht (Schritt 1.6.3).
- Schließen Sie den Deckel, legen Sie das Rohr in die Zentrifuge und Zentrifuge wie in Schritt 1.2.13. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Fahren Sie mit Schritt 1.5 für die Zellaussaat oder Schritt 1.6 für das Einfrieren von Zellen fort.
- PBM-Saat und Differenzierung in MDMs und MDDCs
- Setzen Sie das Zellpellet im berechneten CCM-Volumen, wie in Schritt 1.4.2 berechnet (hier eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml), durch Pipettieren von 3x nach oben und unten aus.
- Pipette die Anzahl der Zellen, die in MDMs und MDDCs in separaten konischen Zentrifugenrohren mit einer serologischen Pipette differenzieren sollen.
- Pipettendifferenzierungsfaktoren zum CCM mit PBMs und gut durch Pipettieren nach oben und unten mischen. Die Differenzierungsfaktoren werden wie folgt angewendet:
- Bei MDDCs: Endkonzentration von 10 ng/ml Interleukin-4 (IL-4) und 10 ng/ml Granulozyt-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF).
- Für MDMs: Endkonzentration von 10 ng/ml Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF).
- Pipette die Zellsuspensionen in CCM mit den hinzugefügten Differenzierungsfaktoren in 6 Wellplatten durch Verteilung von 3 ml der Suspension pro Bohrung (entspricht 3 x 106 Zellen/Well, d.h. 1 x 106 Zellen/ml).
- Legen Sie die 6 Brunnenplatten in einen Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5% CO2) und lassen Sie sie 6 Tage lang unterscheiden, ohne den CCM zu erfrischen.
HINWEIS: Die Differenzierung reicht von 5 bis 8 Tagen, abhängig von der lokalen Verfügbarkeit von Buffy-Coats und dem Versuchsaufbau, vorausgesetzt, dass die Differenzierungseffizienz mit den entsprechenden Techniken bestimmt wird (siehe Diskussionsabschnitt).
- PBM-Einfrieren
- Setzen Sie das Zellpellet in einem kryoprotektiven Medium (hier FBS und Dimethylsulfoxid [DMSO; zytotoxisch]) im Verhältnis 9:1 (v/v) durch Pipettieren eines Volumens von vorgewärmten FBS aus. Dies entspricht einer endgültigen Zellkonzentration von 6 x 106 Zellen/ml, wobei eine weitere Zugabe von 10% DMSO (v/v) berücksichtigt wird.
- Markieren Sie die gewünschte Anzahl von Kryovials in der laminaren Durchflusshaube (d. h. erfassen Sie das Datum, den Isolationscode und die Anzahl der Zellen).
- Pipette 0,9 ml Zellsuspension in reinem FBS (hier 6 x 106 Zellen in 0,9 ml FBS) zu jedem Kryovial. Anschließend langsam Pipette 0,1 ml DMSO und mischen Sie die Suspension gut durch Drehen der Kryovials nach oben und unten 3x.
- Die Kryovials in einen Zellgefrierbehälter geben und sofort auf -80 °C für 24 h einstellen.
- Nach 24 h die Kryovials aus dem -80 °C Gefrierschrank und -Behälter entfernen und in den für die Zelllagerung geeigneten Flüssigstickstofftank legen.
- PBM-Auftauen und Differenzierung in MDMs und MDDCs
- Erwärmen Sie alle erforderlichen Reagenzien auf 37 °C in einem Wasserbad (ca. 20–30 min).
- Bereiten Sie die entsprechende Anzahl von 6 Brunnenplatten vor, die der Anzahl der aufgetauten Zellen entsprechen (hier eine Platte pro 1,8 x 107 Zellen, d.h. 3 Kryovials). Pipette 2 ml CCM zu jedem Brunnen unter aseptischen Bedingungen. Legen Sie DiePlatten 15 min in den Inkubator (5 %CO2, 37 °C), damit der pH-Wert ausgeglichen werden kann.
- Nehmen Sie die erforderliche Menge an Kryovials mit gefrorenen Zellen aus einem flüssigen Stickstofftank und wirbeln Sie sie vorsichtig in einem 37 °C Wasserbad (1–2 min), um ein gleichmäßiges Auftauen der Zellsuspension zu gewährleisten.
- Entfernen Sie den Kryovial aus dem Wasserbad und dekontaminieren Sie mit einem Sterilisationsmittel, um sicherzustellen, dass das Mittel nicht mit dem Deckel und dem O-Ring interagiert.
HINWEIS: Hierbei müssen alle Schritte unter aseptischen Bedingungen abgeschlossen sein. - Bereiten Sie die entsprechende Anzahl von 15 ml konischen Zentrifugenröhren vor, die der Anzahl der aufgetauten Kryovials entsprechen (hier 6 x 106 Zellen/Rohr). Pipette 9 ml vorgewärmtCCM in jedes Rohr.
- Pipette langsam (Drop-by-Drop) den Inhalt der Kryovial in eine Röhre mit CCM. Schließen Sie den Deckel, wiederholen Sie für jedes Rohr, und Zentrifuge bei 200 x g für 5 min bei einer normalen Zentrifugengeschwindigkeit.
- Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
- Setzen Sie das Pellet aus jedem Rohr (das Zellen aus einem Kryovial enthält) in 2 ml vorgewärmtem CCM wieder auf, indem Sie mit einer serologischen Pipette (Zelldichte von 3 x 106 Zellen/ml) nach oben und unten pfeifen.
- Aus jedem Rohr pipette die resuspendierten Zellen in zwei Brunnen (1 ml pro Brunnen) einer 6-Well-Platte mit 2 ml zuvor vorbereitetem CCM, um eine Zelldichte von 3 x 106 Zellen/Well zu erreichen (entsprechend einer Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml). Wiederholen Sie dies für alle anderen Rohre.
- Fahren Sie mit der Differenzierung gemäß Abschnitt 1.5.3 fort.
- Legen Sie die 6 Brunnenplatten in einen Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5% CO2) und lassen Sie sie 6 Tage lang unterscheiden, ohne den CCM zu erfrischen.
2. Dreifachzell-Cokulturmodell des menschlichen Alveolar-Epithelgewebes
HINWEIS: Dieser Abschnitt enthält Anweisungen zu Volumen und Zellennummern, die 12 Wellplatteneinsätzenentsprechen. Abbildung 1 fasst einen vorgeschlagenen Zeitplan für die Modellbaugruppe zusammen.
- Epithelzelle (A549-Zelllinie) Aussaat
- Kultur der Epithelzellen nach den Empfehlungen des Lieferanten (ATTC). Kurz gesagt, subkulturieren Sie die Zellen in CCM bei 80% Zellkonfluenz (ungefähr, 2x–3x pro Woche).
HINWEIS: Subkultur A549 für mindestens vier Passagen vor der Zusammensetzung des Cokulturmodells unter Verwendung von A549-Zellen in einem Durchgangsbereich von 5–25. - Pipette 1,5 ml vorgewärmtCCM in 12 Brunnenplatten (die Anzahl der Bohrungen entspricht der gewünschten Anzahl von Modellen).
- Legen Sie einzelne 12 Brunnenzellkultureinsätze mit sterilisierter Pinzette in Brunnen einer 12-Well-Platte.
- Lösen Sie die Zellen gemäß dem Subkultivierungsprotokoll von einem Kolben (d. h. entfernen Sie den Wirkstoff mit Hilfe eines Trennmittels durch Zentrifugation, wie in Schritt 1.2.13). Resuspend in dem entsprechenden Volumen von CCM entsprechend der endgültigen Zellkonzentration von A549 (hier 50 x 104 Zellen/ml; 0,5 ml Zellsuspension pro Einsatz, d.h. 25 x 104 Zellen/Einsatz, was einer Saatdichte von 27,8 x 104 Zellen/cm2entspricht).
- Pipette 0,5 ml der Zellsuspension (d. h. 25 x 104 Zellen/Einsatz) in die apikale Seite des Einsatzes mit einer 1 ml Pipette.
- Bedecken Sie die Platten mit Deckeln und legen Sie sie 4 Tage lang in einen Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2).
HINWEIS: Überprüfen Sie regelmäßig die Konfluenz von A549-Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop.
- Kultur der Epithelzellen nach den Empfehlungen des Lieferanten (ATTC). Kurz gesagt, subkulturieren Sie die Zellen in CCM bei 80% Zellkonfluenz (ungefähr, 2x–3x pro Woche).
- MDDC-Saat
- Aspirieren Sie CCM mit nicht angeschlossenen Zellen in den 6 Wellplatten, die MDDCs enthalten.
- Fügen Sie 1 ml frisch vorgewärmten CCM zu jedem Brunnen hinzu.
- Verwenden Sie einen Zellschaber, lösen (Scrape) anhaftende MDDCs von jedem Brunnen, waschen Sie die Brunnen vorsichtig mit den vorhandenen 1 ml CCM 3x und kombinieren Sie sie zu einem konischen Zentrifugenrohr.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler mit der Trypan-Blau-Ausschlussmethode mit 10 L Zellsuspension und 10 L Trypan-Blau-Lösung.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension wie in Schritt 1.2.13.
- Berechnen Sie das CCM-Volumen, das für die Resuspension erforderlich ist (Gleichung 5):
Erforderliche MDDC-Dichte = 42 x 104 Zellen/ml; Jeder Einsatz benötigt 6,3 x 104 Zellen, was einer Samenzelldichte von 7 x 104 Zellen/cm2 entspricht (hier 150 'L auf 0,9 cm2 in Schritt 2.2.10.) hinzugefügt).
CCM-Volumen für die Zellresuspension (Vm; Gleichung 5):
- Das CCM mit wachsendem A549 auf den Einsätzen vorsichtig ansaugen und entsorgen.
- Legen Sie die Einsätze mit A549-Zellen in einer umgedrehten Position in eine sterile Petrischale mit sterilisierter Pinzette. Bereiten Sie ein konisches Zentrifugenrohr (50 ml) mit PBS vor und befeuchten Sie einen Zellschaber.
- Abkratzen Sie A549-Zellen von der Grundfläche des Inserts (d. h. dem oberen Teil an der umgedrehten Position), der durch die Poren der Einsätze wachsen sollte.
HINWEIS: Spülen Sie den Schaber mit PBS (in einem Rohr zubereitet) zwischen dem Abkratzen einzelner Proben und halten Sie ihn während des gesamten Verfahrens nass. - Bei der Zentrifugation (Schritt 2.2.5) den Überstand ansaugen und entsorgen, dann das MDDC-Pellet in der berechneten Menge an CCM (Schritt 2.2.6) und Pipette nach oben und unten 3x neu dispergieren.
- Pipette 150 l der Zellsuspension auf jedem Einsatz, so dass die gesamte Basalfläche des Einsatzes gleichmäßig mit der Flüssigkeit bedeckt ist und keine Blasen enthält.
- Bedecken Sie die Schale mit einem Deckel und legen Sie sie 70 min in einen Zellkultur-Inkubator. Aspirieren Sie das CCM von den Zellkulturplatten (wo die Einsätze ursprünglich platziert wurden), entsorgen Sie es in einem biogefährlichen flüssigen Abfall und Pipette 1,5 ml frische CCM in jeden Brunnen. Bedecken Sie die Platte mit einem Deckel und legen Sie sie in den Zellinkubator (37 °C, 5%CO2).
HINWEIS: Überschreiten Sie nicht den oben genannten Zeitraum, um das Austrocknen der Zellen zu vermeiden. - Halten Sie nach der Inkubation jeden Einsatz sorgfältig mit einer sterilisierten Pinzette fest und legen Sie sie an die Platten, die CCM enthalten, in einer gewöhnlichen Position. Bedecken Sie die Platte mit einem Deckel und geben Sie sie an den Zellinkubator zurück (37°C, 5%CO2).
- Macropage (MDM)-Aussaat
- Nehmen Sie 6 Well-Platten mit vordifferenzierten MDMs. Legen Sie sie aus dem Zellinkubator auf eine laminare Strömungshaube.
- Aspirieren und entsorgen Sie CCM mit unbefestigten MDMs, die in 6 Brunnenplatten angebaut werden, und Pipette 1 ml frisch vorgewärmten CCM in jedem Brunnen.
- Entfernen Sie mit einem Zellschaber behutsam haftende MDMs aus einzelnen Brunnen (wie in Schritt 2.2.3 für die MDDCs).
- Pipette 10 l Trypan blau in einen Brunnen oder ein Rohr und fügen Sie 10 l der MDM-Suspension hinzu, um die endgültige Verdünnung von 1:1 (v/v) zu erreichen. Zählen Sie die Anzahl der MDMs mithilfe des entsprechenden Zählprotokolls.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension wie in Schritt 1.2.13.
- Berechnen Sie das benötigte Volumen (Gleichung 6):
Erforderliche MDM-Dichte = 2,5 x 104 Zellen/ml in CCM (hier benötigt jeder Einsatz 1,25 x 104 Zellen in 0,5 ml CCM, was einer gesäten Zelldichte von 1,4 x 104 Zellen/cm2entspricht).
(6) - Bei zentrifugieren, aspirieren und entsorgen Sie den Überstand, dispergieren Sie das MDM-Pellet in der berechneten Menge an CCM (Schritt 2.3.6) und Pipette nach oben und unten 3x.
- Sorgfältigpipetten 0,5 ml der MDM-Aufhängung (in Schritt 2.3.7) an der Wand der Zellkultureinsätze mit A549 und MDDCs (nicht direkt an Epithelzellen) mit einer 1 ml Pipette. Platten mit Deckeln abdecken und 24 h in einen Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2)stellen.
- Übertragung des Cokulturmodells auf Luft-Flüssig-Schnittstelle (ALI)
- Am Ende der 24 h (2 h) Inkubationszeit des montierten Modells in einem Zellkultur-Inkubator CCM sowohl aus apikalen als auch aus Basalteilen von Zellkultureinsätzen und aus den Brunnen aspirieren und entsorgen.
- Heben Sie mit sterilisierter Pinzette einzelne Einsätze aus den Brunnen und Pipette 0,6 ml frisch vorgewärmten CCM mit einer 1 ml Pipette auf jeden Brunnen. Fügen Sie CCM nicht zur apikalen Seite des Einsatzes hinzu.
- Platten mit Deckeln abdecken und vor der weiteren Verwendung in einen Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5 %CO2)legen.
(6)3. Exposition gegenüber ausgewählten positiven Kontrollen (bekannte Reize zur Induktion einer entzündungshemmenden Reaktion)
HINWEIS: Die Exposition der Cokulturmodelle gegenüber einem bekannten proinflammatorischen Stimulus Endotoxin Lipopolysaccharid (LPS)7 und dem proinflammatorischen Zytokintumor-Nekrosefaktor (TNF-)7 wird verwendet, um die Reaktionsfähigkeit des Modells zu veranschaulichen. Darüber hinaus wird die Exposition gegenüber einem Waschmittel (Triton X-100) verwendet, um die Empfindlichkeit eines Lactatdehydrogenase (LDH)-Assays zu bestätigen.
- Bereiten Sie die Positivkontrolllösungen vor: LPS-Bestand (1 mg/ml in destilliertem Wasser), TNF-A-Bestand (100 g/ml in destilliertem Wasser) und Triton-X 100 (2% [v/v] in PBS).
- Bei 24 h Inkubation des Cokulturmodells unter ALI-Bedingungen den Überstand aus dem Basalfach ansaugen und entsorgen. Mit sterilisierter Pinzette einzelne Einsätze aus den Brunnen und Pipette 0,6 ml frisch vorgewärmten CCM in jeden Brunnen heben.
- Bereiten Sie individuelle Positivsteuerungen vor, indem Sie die Lagerbestände in CCM in konischen Zentrifugenröhren wie folgt verdünnen: 1 g/ml LPS, 1 g/ml TNF-A und 0,2% Triton-X 100. Die Volumina entsprechen der Anzahl der getesteten Einsätze (hier 100 l/Einsatz). Mischen Sie die Lösungen gut, indem Sie 3x nach oben und unten pfeifen.
- Tragen Sie 100 l jeder Positivkontrolllösung auf, indem Sie langsam auf die Wand des Zellkultureinsatzes pipetieren. Die Brunnenplatte mit einem Deckel bedecken und 24 h im Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5%CO2)platzieren. Nach der Inkubation die Flüssigkeit an der apikalen Seite des Einsatzes ansaugen und entsorgen, indem Sie einzelne Einsätze mit einer Pinzette halten.
- CCM in den Basalfächern sammeln und bei 1) 4 °C für weitere LDH-Analysen speichern, zellmembranrissvermittelte Zytotoxizität dekoieren und/oder bei -80 °C speichern, um die Proteinfreisetzung über enzymgebundenen Immunsorbent-Assay (ELISA) weiter zu analysieren. Führen Sie die Assays gemäß den Empfehlungen des Kit-Lieferanten aus.
- Nach der Entfernung von CCM die Einsätze mit PBS 3x waschen und die Zellen auf Zellkultureinsätzen in 4% [w/v] Paraformaldehyd (in PBS, 15 min bei Raumtemperatur) fixieren, indem Sie sicherstellen, dass beide Insert-Seiten mit PFA-Lösung gut abgedeckt sind. Anschließend 3x mit PBS waschen, um PFA zu entfernen. Bewahren Sie die in PBS getauchten Proben bei 4 °C auf, um weitere Immunfärbungen zu erhalten (ein Beispiel für diese Methode wurde bereits beschrieben17).
Representative Results
Menschliche Lungenkokulturmodelle, die aus alveolären Epithelzellen und Immunzellen bestehen, wurden entweder aus frischen oder gefrorenen MDDCs und MDMs-Vorläufern (hier menschliche periphere blutabgeleitete Monozyten) zusammengesetzt. Wie in Abbildung 1dargestellt, wurden A549-Zellen 3 Tage nach dem ersten Abschnitt mit Monozytenisolation/Auftauen ausgesät. Nach 6 Tagen Differenzierung erschienen die differenzierten MDB rund, während MDDCs eine längere Form mit beobachtbaren Vorsprüngen bildeten. Sie erschienen auch als Agglomerate, vor allem, wenn sie von frischen Monozyten unterschieden wurden (Abbildung 2, Abbildung 3). Epithelzellen bildeten nach 3 Tagen Wachstum auf Membraneinsätzen (Abbildung 4), als die Kokulturen zusammengesetzt wurden, eine dichte Zellschicht von Zellen. Nach 24 h Montage und weiteren 24 h ALI-Bedingungen wurden die Kokulturen für Expositionen vorbereitet.
Die Reaktionsfähigkeit der 3D-Zellkulturmodelle wurde bei Exposition gegenüber bekannten proinflammatorischen Reizen mit einem Pseudo-ALI-Ansatz untersucht, wie zuvorbeschrieben 29. Die proinflammatorischen Reize, LPS und TNF-A, wurden in geringen Volumina (100 l) auf die apikale Oberfläche des luftexponierten Zellmodells gesetzt. Parallel dazu wurde das Fehlen eines Membranbruchs als Maß für die Zytotoxizität mittels LDH-Assay beurteilt. Bei Exposition gegenüber der Positivkontrolle für Membranbruch, einem Waschmittel Triton-X 100 (Abbildung 5), wurde eine signifikante Zunahme der LDH-Freisetzung in CCM des Basalfachs beobachtet. Diese Ergebnisse erwiesen sich als Reaktionsfähigkeit des Modells auf eine zytotoxische Substanz, während bei der apikalen Stimulation mit TNF-A oder LPS keine Erhöhung der LDH-Freisetzung beobachtet wurde.
Ein möglicher Grund für die unterschiedlichen Messwerte von LDH in den Proben, die mit frischen oder zuvor gefrorenen PBMs montiert wurden, kann der Probenlagerung zugeschrieben werden. Proben von frischen PBMs wurden länger bei -80 °C gelagert; daher kann die Aktivität des LDH-Enzyms sinken. Insbesondere ist LDH nur für bis zu 4 Tage in CCM stabil; Daher wird empfohlen, den Test spätestens 2 Tage nach dem Sammeln der Überstande durchzuführen. Alternativ ist es möglich, die Überräube direkt nach der Abholung einzufrieren. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass das Einfrieren die enzymatische Aktivität von LDH verringern kann.
Die Sekretion von proinflammatorischen Mediatoren (hier TNF-A und Interleukins 6 [IL-6] und 8 [IL-8]) in das basale CCM wurde über ELISA quantifiziert. Statistisch signifikante (p < 0,05, einwegige ANOVA) Erhöhungen der Freisetzung von IL-6 und IL-8 wurden sowohl in LPS- und TNF---behandelten Proben im Vergleich zu den jeweiligen unbehandelten Zellen als auch in den Zellkulturmodellen beobachtet, die aus beiden PBM-Quellen zusammengesetzt wurden (Abbildung 6). Obwohl die Konzentrationen (pg/ml) aller getesteten Zytokine im Basal-CCM in den Kokulturen aus frischen PBM höher waren, waren die Unterschiede zwischen den beiden Kokulturen und Monokulturen statistisch nicht signifikant (p > 0,05) (Abbildung 6). Um den Mehrwert von Cokulturmodellen in Bezug auf eine 2D-Epithelzellkultur zu bestätigen, wurden a549-Monokulturen auch LPS oder TNF-A ausgesetzt. Wie erwartet war die Freisetzung aller untersuchten Mediatoren aus A549-Monokulturen im Vergleich zu beiden Cokulturmodellen geringer; obwohl der Unterschied zwischen ihnen statistisch nicht signifikant war (p > 0,05, einwegige ANOVA).
Die zelluläre Morphologie der 3D-Epithelgewebebarriere des menschlichen Alveolaren wurde mittels konfokaler Laserscanmikroskopie (LSM) untersucht. Um die Zusammensetzung der einzelnen Modelle zu visualisieren, wurden Makrophagen innerhalb der Cokulturmodelle (MDMs) mit dem ausgereiften Makrophagenmarker 25F9 befleckt. MDDCs wurden mit CD83 gefärbt, was ein wichtiger Marker für aktivierte dendritische Zellen30ist. In Bezug auf die zelluläre Morphologie wurde kein Unterschied zwischen den Cokulturmodellen mit MDMs und MDDCs von frischen PBMs im Vergleich zu denen beobachtet, die aufgetaute PBMs verwenden. In LPS- und TNF-exponierten Kokulturen, die beide aus frischen und gefrorenen Immunzellen bestehen, wurde eine gestörte Epithelschicht in LSM-Bildern beobachtet, was bei unbehandelten Zellen nicht der Fall war (Abbildung 7, Abbildung 8).
Abbildung 1: Schematische Zeitachse des Protokolls. Präsentation der Vorbereitung, Montage und Anwendung des 3D-Cokulturmodells (Exposition gegenüber einem geprüften Stoff). ALI = Luft-Flüssig-Schnittstelle, MDDCs = monozytenabgeleitete dendritische Zellen, MDMs = monozytenabgeleitete Makrophagen, PBMs = periphere Blutmonozyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: MDMs und MDDCs unterscheiden sich von frischen PBMs. Phasenkontrastmikroskopische Abbild von differenzierten (A) MDMs und (B) MDDCs von frischen PBMs (6 Tage nach Zellisolation). MDMs sind rundförmig, während MDDCs häufig als Agglomerate beobachtet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: MDMs und MDDCs unterscheiden sich von eingefrorenen PBMs. Phasenkontrastmikroskopiebild von differenzierten (A) MDMs und (B) MDDCs von aufgetauten PBMs (6 Tage nach dem Auftauen). MDMs sind rundförmig, aber einige längliche Zellen können beobachtet werden. MDDCs erscheinen auch rundförmig mit Vorsprüngen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Epithelzellenwachstum auf Membraneinsätzen. Phasenkontrastmikroskopiebild des konfluenten A549, das 4 Tage nach der Aussaat auf einem Membraneinsatz wächst und eine dichte Zellschicht bildet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Cytotoxizitätsergebnisse, die mittels LDH-Assay (Membranrupturen) untersucht wurden. Die Daten werden als Faltenzunahme gegenüber unbehandelten Zellen dargestellt (Mittelwert sD, n = 3, Sternchen bezeichnen statistisch signifikanten Anstieg im Vergleich zu unbehandelten Zellen, **p < 0,01, ****p < 0,0001). In grünen Modellen werden MDMs und MDDCs von frischen PBMs dargestellt, und in violetten Modellen, die aus aufgetauten PBMs zusammengesetzt sind, werden mdMs und MDDCs von frischen PBMs dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Entzündungsreaktionen in den Kokulturen und Monokulturen. Die proinflammatorischen Mediatoren (TNF-, IL-6 und IL-8) geben in den Kokulturen bei 24 h Herausforderung mit LPS oder TNF-A frei. Die Daten werden relativ zu unbehandelten Zellen dargestellt (Mittelwert sD, n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). In grünen Modellen werden MDMs und MDDCs von frischen PBMs dargestellt, und in violetten Modellen, die aus aufgetauten PBMs zusammengesetzt sind, werden mdMs und MDDCs von frischen PBMs dargestellt. Grau steht für A549-Monokulturen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Morphologie von Kokulturen, die aus frischen Immunzellen bestehen. LSM-Bilder von apikalen und basalen Seiten des Cokulturmodells mit xz-Projektionen von apikalen Seiten des Modells mit MDMs und MDDCs von frischen PBMs. Cyan repräsentiert Kerne (DAPI), Magenta steht für Zytoskelett (Rhodamine-Phalloidin), weiß für MDMs (25F9) und grün für MDDCs (CD 83). Der weiße Pfeil bezeichnet MDM, während der grüne Pfeil MDDC bezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Morphologie von Kokulturen, die aus gefrorenen Immunzellen bestehen. LSM-Bilder der apikalen Seite des Cokulturmodells mit entsprechenden xz-Projektionen und Basalseite des Modells mit MDMs und MDDCs von aufgetauten PBMs. Cyan repräsentiert Kerne (DAPI), Magenta steht für Zytoskelett (Rhodamine-Phalloidin), weiß für MDMs (25F9) und Grün für MDDCs (CD 83). Der weiße Pfeil bezeichnet MDM, während der grüne Pfeil MDDC bezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Die aufkommende Produktion neuartiger Materialien, einschließlich Chemikalien und Medikamente, erhöht allmählich den Bedarf an prädiktiven In-vitro-Modellen. Um die drei Prinzipien des Austauschs, der Reduktion und der Verfeinerung von Tierversuchen32zu erfüllen, sind In-vitro-Zellmodelle zu leistungsstarken Werkzeugen in Bezug auf den Ersatz- und Reduktionsaspekt für die Aufklärung von Mechanismen der Wirkung eines Arzneimittels oder Materials8,9,10,11. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Zusammenstellung des mehrzelligen Modells mit Immunzellen vorgestellt, die entweder frisch isoliert oder aus zuvor eingefrorenen Monozyten aufgetaut sind. Ebenfalls beschrieben ist die Kultivierung des Modells bei ALI. Schließlich veranschaulicht das Protokoll ein Beispiel für die Exposition gegenüber entzündungshemmenden Reizen und vergleicht die Reaktion der beiden Modelle, die entweder frische oder gefrorene Monozyten enthalten.
Es wurden verschiedene Studien durchgeführt, um den Mehrwert der verbesserten Komplexität der unter ALI-Bedingungen angebauten und exponierten Modelle im Vergleich zur herkömmlichen Unterwasserexposition7,22,31zu bestätigen und zu rechtfertigen. Die Beobachtung der höheren proinflammatorischen Reaktion in Kokulturen im Vergleich zu Monokulturen von Epithelzellen bestätigt eine frühere Studie. Die Studie verwendete das vorgestellte Cokulturmodell (stimuliert mit LPS) und zeigte eine höhere Reaktion auf Genexpressionsniveaus von TNF und IL1B im Vergleich zum A549 Monokultur-Äquivalentmodell7. Andererseits zeigten beide Modelle höhere Schwankungen innerhalb der gemessenen proinflammatorischen Mediator-Freisetzungswerte im Vergleich zu A549-Monokulturen. Dies kann durch die Verwendung von Immunzellen verschiedener Spender (Buffy Coats) in biologischen Wiederholungen (d.h. eine Wiederholung, ein Spender) erklärt werden, wie zuvor gezeigt7. Auf Wunsch können die Variationen zwischen den Replikationen durch 1) mit aufgetauten PBMs desselben Spenders oder 2) Pooling PBMs von verschiedenen Spendern vor dem Einfrieren der Zellen, dann nachfolgende Verwendung des gleichen Pools in jeder Wiederholung überwunden werden. Es wird auch empfohlen, mehr biologische Wiederholungen zu verwenden.
Die Zellgefriertechnik kann als kritischer Schritt betrachtet werden; Es ist jedoch ein gängiges Laborverfahren zur Konservierung von Zellen für die phänotypische und funktionelle Analyse. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass die Qualität von gefrorenen PBMs lebenswichtig für ihr Überleben ist, und eine geeignete Gefriertechnik ist der Schlüssel zum Erfolg nachfolgender Tests mit den gleichen Zellen28,32. Die Änderung des Protokolls kann durch Einfrieren von PBMs durchgeführt werden, was Flexibilität im experimentellen Aufbau bietet, da die Verfügbarkeit von Buffy-Coats in der Regel begrenzt ist. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von gefrorenen PBMs (in mehreren Durchstechflaschen) gegenüber frisch isolierten ist, dass sie auch nach 1 Jahr in nachfolgenden Experimenten eingesetzt werden können. Dies verringert das potenzielle Problem der Variabilität von Spender zu Spender, wenn dies ein gewünschter oder erforderlicher Parameter in einem experimentellen ist.
Die Ergebnisse eines laborativen Vergleichs, der nach bis zu 13 Monaten durchgeführt wurde, zeigen, dass PBM, wenn sie ordnungsgemäß in einem flüssigen Stickstofftank gelagert werden, über einen langen Zeitraum ohne Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit oder die Zellrückgewinnung verwendet werden können33. Längere Speicherzeiten (über 1 Jahr) können bei sorgfältiger Validierung der Zelllebensfähigkeit und der Reaktionsfähigkeit der Zelle vor der Durchführung eines Experiments möglich sein. Außerdem muss die Temperatur im Flüssigstickstofftank jederzeit stabil bleiben. Der Hauptfaktor, der die Lebensfähigkeit von kryokonservierten PBM beeinflusste, war die DMSO-Konzentration mit einer optimalen Konzentration von 10 %–20 % (v/v)28. Um potenziell schädliche Auswirkungen des Einfrierens zu minimieren, werden dem Gefriermedium häufig verschiedene Proteinquellen, FBS oder BSA (mit einem breiten Konzentrationsbereich von 40 % bis 100 %34) als natürliche Schutzkomponenten zugesetzt, die das Zellüberleben erhöhen können.
Aufgrund des hohen zytotoxischen Potenzials von DMSO wird empfohlen, zunächst PBMs in FBS zu dispergieren und dann DMSO zu PBMs hinzuzufügen, die bereits in FBS verteilt sind. Bemerkenswert ist, dass höhere FBS-Konzentrationen (>40%) keine Verbesserung der Zelllebensfähigkeit zeigte, gleichzeitig verursachten sie keinen Schaden für die Zellen28. Nichtsdestotrotz ist das Einfrieren von Monozyten ein möglicher Ansatz, um Probleme mit begrenzter Verfügbarkeit von Buffy-Coatzulösen zu überwinden. Wenn jedoch die Verwendung von MDDCs und MDMs von frischen PBMs gewünscht wird, können die Immunzellen unterschieden und 5–8 Tage nach der Isolierung7,,16,17,35,36,37verwendet werden., Wenn die experimentelle Planung dies zulässt, wird eine Differenzierung von mindestens 6 Tagen sowohl in MDDCs als auch in MDMs empfohlen. Die Konsistenz zwischen verschiedenen Wiederholungen im selben Experiment sowie routinemäßige Inspektionen ihrer spezifischen Oberflächenmarkerausdrücke sind jedoch von entscheidender Bedeutung. Auch die Reaktionsfähigkeit auf einen proinflammatorischen Reiz wie LPS nach der Differenzierungszeit sollte regelmäßig überprüft werden.
Viele Untersuchungen mit der A549-Zelllinie wurden bei ALI durchgeführt, entweder als Monokultur oder in Kombination mit anderen Zelltypen (Makrophagen, dendritische Zellen oder Fibroblasten) in 3D-Kokulturmodell22,24,29,38. Mit diesem 3D-Kokulturmodell wurden die Zytotoxizität, oxidativer Stress oder die proinflammatorische Wirkung von (Nano-)Materialien für bis zu 72 h1,17,21,24,29untersucht. Die Ähnlichkeit des Modells mit In-vivo-Gewebe wurde zuvor anhand einer konfokalen Laserscanning-Bildgebung des Modells16untersucht. Bei der Montage des Modells ist es wichtig, sowohl die Zellproliferation (die A549 im hier vorgestellten Modell beeinflussen kann) als auch die Leistung der primären (nicht vermehrenden) Immunzellen (hier MDDCs und MDMs) zu berücksichtigen. Es ist auch wichtig zu berücksichtigen, dass nicht alle CD14-positiven Monozyten sich in MDDCs und MDMs unterscheiden und dass die Zellen sowohl in angehängter als auch in hängender Form vorhanden sein können. Basierend auf der Art der Cokultur-Assembly (hier müssen beide Zelltypen an die vorhandene Epithelschicht anhängen), wird empfohlen, nur die anhaftenden Subpopulationen beider Immunzelltypen zu verwenden. Darüber hinaus haben routinemäßige Analysen von Monozyten, MDDC und MDM-Monokulturreaktionsfähigkeit auf LPS und die Expression spezifischer Oberflächenmarker (CD14, CD163, CD86, CD93 oder CD206, nicht gezeigte Daten) ergeben, dass 6 und 7 Tage Differenzierung die optimalen Zeitpunkte sind.
Obwohl eine realistische Anzahl von Alveolaren-Epithelzellen in der menschlichen Lunge 160.000 Zellen/cm2entspricht, beträgt die Anzahl der im Modell gezählten A549-Zellen nach 9 Tagen, die auf dem Einsatz16,18kultiviert sind, 1.000.000 Zellen/cm2 . Daher müssen die Einschränkungen dieses In-vitro-Modells berücksichtigt werden. Zunächst wurde die Dichte der Epithelzellen auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, eine Konfluentschicht auf der wachsenden Membran zu bilden, festgestellt. Es ist auch wichtig zu erwähnen, dass die A549 eine epitheliale Typ-II-Zelle mit einer quaderförmigen Form darstellt, im Gegensatz zu epitheliaalen Typ-I-Zellen, die flach und überbreitsind sind. Andererseits wurde die erforderliche Anzahl von Immunzellen auf der Grundlage der Literatur festgelegt und in diesem Protokoll als Zellzahl/Oberfläche39,40,41dargestellt. Die Zelldichte von MDDCs im Bereich von 400 Zellen/mm2 (4 Zellen/cm2)16 ist vergleichbar mit der stationären Zelldichte von 500–750 Zellen/mm2 (5- 7 Zellen/cm2) aus in vivo Studien39berichtet. Die Dichte der MDMs in diesem Modell liegt innerhalb des gleichen Bereichs der In-vivo-Situation in der menschlichen Alveolarregion40.
Die reife Makrophagen-Markerfärbung (25F9) wurde sowohl auf der apikalen Seite (wo MDMs vorhanden sind) als auch auf der Basalseite (d. h. an der Stelle der dendritischen Zellen) beobachtet. Die Translokation von Immunzellen durch die Membran setzt Poren ein und wurde auch mit diesem Modell16beobachtet, was die beobachteten Unterschiede in den Färbeintensitäten erklären kann. Eine andere mögliche Erklärung ist jedoch, dass der reife Makrophagenmarker auch auf dendritischen Zellen ausgedrückt werden kann, aber der Ausdruck ist hochspenderspezifisch42. Außerdem ist die Intensität des 25F9-Ausdrucks in MDMs viel höher (Abbildung 7, Abbildung 8). Beide proinflammatorischen Reize (LPS und TNF-A) beeinträchtigten die Integrität der lungenepithelischen Barriere in beiden Kokulturen (Abbildung 7, Abbildung 8). Dies wurde auf der Grundlage früherer Veröffentlichungen43,44 erwartet, die zeigten, dass proinflammatorische Zytokine und bakterielle Produkte die Integrität von Epithelbarrieren stören.
Das mehrzellige 3D-Modell des menschlichen Alveolarenepithels, das zuvor17etabliert und charakterisiert wurde, diente als leistungsfähiges und nützliches Werkzeug zur Beurteilung biologischer Reaktionen (d. h. akute proinflammatorische Reaktionen, oxidative Stressreaktion, Partikelverteilung und zelluläre Kommunikation) in vitro21,24,25,45. Die Ergebnisse bestätigen die Reaktion von Cokulturmodellen auf proinflammatorische Reize (hier LPS und TNF-A). Die Reaktion wurde leicht erhöht, wenn Immunzellen aus frischen PBMs verwendet wurden; es gab jedoch keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen Kokulturen, die frische und aufgetaute PBM verwenden. Darüber hinaus waren die proflammatorischen Reaktionen beider Kokulturmodelle höher als die von Epithelzellmonokulturen, die unter den gleichen (ALI) Bedingungen kultiviert wurden. Zusammenfassend beschreibt das Protokoll die Zusammenstellung eines 3D-Human-Alveolar-Epithel-Gewebe-Cokulturmodells unter Verwendung von frischen oder aufgetauten PBMs zur Differenzierung in MDMs und MDDCs. Es wird gezeigt, dass beide Modelle sehr ansprechbar sind auf proinflammatorische Reize; daher können sie als leistungsfähige Instrumente für potenzielle Gefahren- und Toxizitätsbewertungen dienen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Miguel Spuch-Calvar für das Cokulturprogramm in Abbildung 3 und Dr. Bedia Begum Karakocak für die kritische Lektüre. Diese Studie wurde durch das PATROLS-Projekt, das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 760813, und durch die Adolphe Merkle Foundation unterstützt. B.D. dankt der Stiftung Peter und Traudl Engelhorn für die finanzielle Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchmark microplate reader | does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland | ||
| Cell culture Incubator | does not have to be specific | ||
| Cell freezing container (for example Mr. Frosty) | does not have to be specific | ||
| Centrifuge | does not have to be specific | ||
| Confocal laser scanning microscope | does not have to be specific, for example | Zeiss LSM 710 meta | |
| Heamatocytometer, or automatic cell counter | does not have to be specific | ||
| Laminar bio-safety hood class II | does not have to be specific | ||
| MultiStand Macs (Macs Cell Separator) | Miltenyi, Germany | 130-042-303 | |
| pH meter | does not have to be specific | ||
| Phase contrast inverted light microscope | does not have to be specific | ||
| Pipette boy, pipettors (different volumes) | do not have to be specific | ||
| Scissors | do not have to be specific | ||
| Vacuum pump | does not have to be specific | ||
| Water bath | does not have to be specific | ||
| Disposable small equipment/glassware | Catalogue Number | ||
| 15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes | does not have to be specific | ||
| 6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile | Falcon, Switzerland | 353046 and 353043 | |
| Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 μm pore size | Falcon, Switzerland | 353181 | |
| Cell scrapper | does not have to be specific, for example VWR, Switzerland | 353085 | |
| Cryovials | do not have to be specific | ||
| Glass autoclaved Petri Dishes | do not have to be specific | ||
| LS Columns | Miltenyi, Germany | 130-042-401 | |
| Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 μm pore size | does not have to be specific, for example VWR, Switzerland | 10040-446 | |
| Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL) | does not have to be specific | ||
| Sterile pipettes | do not have to be specific | ||
| Chemicals | |||
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | A7030-100g | |
| CD14+ MicroBeads human - magnetic beads | Miltenyi, Germany | 130-097-052 | |
| Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red | Gibco, Switzerland | 25300054 | |
| Density gradient medium Lymphoprep | Alere Technologies AS, Norway | 1114547 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich, Switzerland | D2438 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | E6758-100g | |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco, Switzerland | 10270-106 | |
| Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-093-864 | |
| Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-095-373 | |
| Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-096-485 | |
| L-glutamine | Gibco, Switzerland | 25030-024 | |
| Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli | Sigma-Aldrich, Switzerland | 4524-5mg | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | 158127 | |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco, Switzerland | 15140-122 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco, Switzerland | 10010-015 | |
| Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI) | Gibco, Switzerland | 42401-018 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Switzerland | T8787 | |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma Aldrich, Switzerland | ||
| Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | Immunotools | 11343015 | |
| Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response | |||
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche, Switzerland | 11644793001 | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D, Biotechne, Switzerland | DY206 | |
| Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA | R&D, Biotechne, Switzerland | DY208 | |
| Immunostaining | |||
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 μg/mL | Sigma-Aldrich, Switzerland | 10236276001 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 μg/mL | Abcam, UK | ab150115 | |
| Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 μg/mL | Agrisera, Sweden | AS09 633 | |
| Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 μg/mL | eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland | 14-0115-82 | |
| Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 µM | Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland | R415 | |
| Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution | Abcam, UK | ab244204 |
References
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