Imagen tridimensional da Vasculatura e Drenagem Linfática Vertebral usando iDISCO+ e Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz

Resumo

Um protocolo é apresentado combinando limpeza tecidual com microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) para obter imagens tridimensionais e de resolução celular dos vasos linfáticos e linfonodos (LNs) coletando o fluido cefalorraquidal (CSF) e fluido peridural espinhal.

Resumo

O sistema linfático associado ao sistema nervoso central (SNC) inclui a vasculatura linfática que gira ao redor do cérebro, a medula espinhal e suas LNs associadas. O sistema linfático associado ao CNS está envolvido na drenagem de macromoléculas CSF e células imunes meningeais em direção às LNs drenantes de CNS, regulando assim o despejo de resíduos e a vigilância imunológica dentro dos tecidos CNS. Apresentada é uma nova abordagem para obter imagens tridimensionais (3D) e de resolução celular de linfáticos associados ao CNS, preservando a integridade de seus circuitos dentro dos tecidos circundantes. O protocolo iDISCO⁺ é usado para vasos linfáticos de imunolabel em preparações de montagem descalcificadas e limpas da coluna vertebral que são posteriormente imagens com microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM). A técnica revela a estrutura 3D da rede linfática que conecta os espaços meningeais e peridural ao redor da medula espinhal a vasos linfáticos extravertebrales. Desde que sejam imagens 3D dos circuitos de drenagem de rastreadores moleculares previamente injetados no CSF através da cisterna magna ou do parenchyma espinhal toracolumbar. A abordagem iDISCO⁺/LSFM traz oportunidades sem precedentes para explorar a estrutura e a função do sistema linfático associado ao CNS em biologia neurovascular, neuroimunologia, câncer cerebral e vertebral, ou osso vertebral e biologia articular.

Introdução

O CNS é cercado pelo CSF e camadas sobrepostas de meninges, tecido peridural e ossos. Ao todo, o CSF fornece proteção física ao cérebro macio e à medula espinhal. É principalmente secretado pelo plexo coroide e as membranas meningeais (ou seja, a pia mater, o aracnoide e a dura mater). O complexo CSF-meningeal também estabelece uma interface funcional entre os tecidos CNS e o resto do corpo, contribuindo assim para a homeostase cns. Primeiro, o CSF penetra o parênquim cns através dos espaços para-artefatos do CNS e interage dinamicamente com o fluido intersticial (ISF)¹ através do sistema glicêtico (glia-linfático), que consiste nos espaços paravasculares e nas membranas de pés finais de astrócito ao redor dos vasos CNS^2,,3,,4. Os resíduos metabólicos e o excesso de fluido são então liberados pela drenagem perivascular intramural diretamente do parenchyma cerebral em direção à circulação sistêmica³, bem como os espaços paravenosos em direção ao CSF e através de vasos linfáticos de drenagem cerebral, de acordo com o modelo glicêtico^2,4. O fluxo de saída do CSF é principalmente através do sistema linfático, através da placa cribriforme e dos vasos linfáticos extracranais associados^5,,6,,7, bem como pelos vasos linfáticos meningeais, que convergem nas LNs^{8,,9,,10,,11,,12} (Figura 1). Um papel importante, embora secundário, no fluxo de saída do CSF é tomado pelo villi aracnoide craniano, que penetram na lacuna dos seios venosos meningeais¹³.

Os circuitos de drenagem do CFS têm sido extensivamente investigados por meio de abordagens experimentais baseadas na injeção de rastreadores coloridos/fluorescentes no CNS ou CSF, seguidos pela imagem do padrão dos rastreadores dentro do CNS e em todos os órgãos e tecidos do corpo em diferentes pontos de tempo após a injeção¹³. Por muito tempo, a saída do CSF foi considerada exclusiva e diretamente assumida pela circulação sanguínea, através da villi aracnoide projetando-se em seios venosos durais¹³. No entanto, o fluxo de saída CSF é predominantemente realizado pela vasculatura linfática, como mostrado recentemente por imagens dinâmicas quase infravermelhas (NIR) do transporte de rastreadores injetados por CSF em camundongos^9,,10. Os vasos linfáticos drenantes do CSF retornam linfáticos à corrente sanguínea através da veia subclávia direita. As aproximações complementares detectaram tanto traços extracranais^6,7,13 e intracranianos^9,10,,11,12 saídas linfáticas de rastreadores injetados por CSF e sugerem que o CSF é absorvido por duas vias linfáticas, uma externa e outra interna ao crânio e coluna vertebral. A parte principal da drenagem do CSF ocorre rapidamente através de vasos linfáticos localizados rostrally, fora do crânio na mucosa nasal, através de canais da placa cribriforme do osso etmoide^3,,6,,13 e, caudally, fora dos ossos vertebrais lumbosacral através de rotas dorsolaterais que ainda não são totalmente caracterizadas^7,14. Além disso, nas meninges do crânio, os capilares linfáticos da dura mater absorvem CSF e células imunes meningeais em direção a coletores linfáticos durais que cruzam os ossos do crânio e se conectam às LNs drenantes de CNS^12,14. Esses vasos linfáticos meningeais desempenham papéis importantes na fisiopatologia cns, porque os linfáticos meningeais cerebrais são alterados no envelhecimento e também impactam o resultado de doenças neurológicas do cérebro, incluindo neurodegeneração, neuroinflamação e câncer cerebral^15,,16,17. Portanto, a vasculatura linfática associada ao CNS (ou seja, os vasos linfáticos durais e periféricos que drenam o CSF) pode ser um novo alvo promissor para combater doenças de SNC em humanos.

Estudos convergentes realizados com imunohistologia e ressonância magnética de alta resolução demonstraram que a vasculatura linfática meningeal também existe em primatas, incluindo macacos saguis comuns e humanos^7,,11,13. Além disso, os vasos linfáticos meningeais não estão restritos ao crânio, mas estendem-se dentro da coluna vertebral à superfície da górtice espinhal e^{rami 13,18}. Imagens tridimensionais (3D) da coluna vertebral linfática preservando a anatomia geral de amostras vertebrais e espinhais rotuladas, incluindo ossos, músculos, ligamentos, bem como tecidos viscerais vizinhos, foram realizadas recentemente¹⁴. O iDISCO⁺ protocolo^19,20 foi usado para decalcificar e limpar preparações de toda a coluna vertebral com anticorpos linfáticos específicos contra o receptor de membrana LYVE1²¹ ou o fator de transcrição PROX1²². A aquisição e análise de imagens foram então realizadas com microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) e o software Imaris. O LSFM permite imagens 3D rápidas e minimamente invasivas de grandes espécimes por confinamento axial de iluminação, o que resulta em fotobleaching reduzido e fototoxicidade²³.

A abordagem iDISCO⁺/LSFM permite a caracterização das distintas camadas de vasos linfáticos durais e peridurales, e a conexão desta vasculatura com os circuitos linfáticos extravertebrales e as LNs vizinhas à coluna vertebral. O protocolo foi aplicado a tecidos previamente injetados com rastreadores fluorescentes para demonstrar a drenagem do canal vertebral. O presente artigo fornece detalhes sobre a metodologia iDISCO⁺/LSFM para imagem da vasculatura linfática vertebral e ilustra sua relevância para a investigação de drenagem de fluidos peridural e CSF.

Protocolo

Todos os procedimentos in vivo utilizados neste estudo cumpriram todas as normas éticas relevantes para testes e pesquisas em animais, de acordo com a Comunidade Europeia para diretrizes experimentais de uso de animais (L358-86/609EEC). O estudo recebeu aprovação ética do Comitê de Ética do INSERM (n°201611111126651) e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle épinière).

1. Preparação

1. Prepare as seguintes ferramentas de dissecção para cirurgia: bisturi (1), microforceps (2), fórceps (1), tesoura de dissecção e clipes de sutura michel. Prepare agulhas de 26 G (0,45 mm x 13 mm), seringa de 1 mL e microsiringe de 10 μL.
2. Puxe microcapillarias com um protocolo de passo único a 67,5 °C com um puxador de micropipette de vidro. Prepare dois microcapillaries por injeção.
3. Prepare os reagentes para drenagem linfática por imagem(Tabela 1): Ovalbumin Alexa Fluor 555 conjugado (OVA-A⁵⁵⁵, 2 mg/mL em 1x salina tamponada de fosfato [PBS]) e anticorpo anti-LYVE1 (1 mg/mL em 1x PBS).
4. Prepare anticorpos(Tabela 1) para iDISCO⁺. Para anticorpos primários, use anticorpo policlonal de coelho anti-LYVE1 (1:1.600) e anticorpo policlonal IgG de cabra anti-PROX1 (1:2.000). Para anticorpos secundários, use alexa fluor burro anti-coelho-568, burro anti-coelho-647, e burro anti-cabra-647 (1:2.000).

2. Procedimentos cirúrgicos para injeções intra-cisterna magna (ICM) e toracolumbar (ThLb)

1. Preparação do animal para cirurgia
   1. Use camundongos C57BL6/J adultos, de 8 a 12 semanas de idade.
   2. Injete o camundongo intraperitoneal (IP) com solução de buprenorfina de 0,015 mg/mL diluída em cloreto de sódio de 0,9% a 0,1 mg/kg, 15 minutos antes da cirurgia.
   3. Anestesiar o rato em uma caixa de indução com 2-3% de gás isoflurane.
2. Preparação de animal anestesiado para injeção de rastreador
   1. Coloque o mouse anestesiado e sua almofada de aquecimento no aparelho estereotaxista. Use as barras de ouvido para segurar a cabeça do rato, e deite o corpo em um ângulo de ~135° para a cabeça ou imobilize a medula espinhal no nível vertebral thlb (Th12-L1) com um adaptador espinhal. Aperte a cauda ou a pata com o psp para verificar a eficiência da anestesia.
   2. Injete IP 200 μL de cloreto de sódio de 0,9% para hidratação do rato.
   3. Usando uma lâmina de bisturi, faça uma incisão de pele, seja na região occipital em direção à região cervical para injeção de ICM, ou no nível vertebral thlb (Th10-L3) para injeção no parênchyma espinhal ThLb.
3. Injeção de rastreador
   1. Descarte músculos paracervicos e paraspinais que cobrem o pescoço e a coluna para visualizar a superfície da dura mater, a camada mais externa das meninges.
   2. Puna cuidadosamente a área central do dura mater e coloque aracnoide com uma agulha de 26 G.
   3. Implantação microcapilária
      1. Corte 2 mm da ponta capilar de vidro (ver passo 1.2), em seguida, use a microcapilação conectada a uma cânula ligada a uma seringa de 10 μL para aspirar 2−8 μL do anticorpo OVA-A⁵⁵⁵ ou LYVE1.
      2. Introduza o microcapilário na região medial da dura mater em um ângulo de 30° para injeções de ICM ou ângulo de 10° para injeções espinhais thlb, e empurre-o para 1,5 mm abaixo da dura-mater.
         NOTA: O ligamento é perfurado, mas não é realizada laminectomia.
      3. Adicione 10 μL de cola cirúrgica para fechar a incisão ao redor do capilar de vidro e esperar que seque.
   4. Injete lentamente o rastreador fluorescente a 1 μL/min. Uma vez que o volume de injeção tenha sido entregue, mantenha o capilar no lugar por 1 min. Retraia o microcapilário e adicione cola cirúrgica para fechar o orifício de injeção.
4. Pós-injeção, feche as incisões da pele com clipes de sutura. Retire o mouse do aparelho estereotax e coloque-o em uma câmara de aquecimento pós-cirurgia a 37 °C até que ele se recupere.

3. Perfusão e dissecção tecidual

1. Em 15 min ou 45 min após a injeção do rastreador CSF, injete uma dose letal (100 μL) de pentobarbital de sódio. Aperte a cauda ou a pata para verificar se não há reflexo.
2. Com a tesoura de dissecção, corte a pele e abra a camada peritoneal da região inferior do abdômen em direção à gaiola torácica. Abra a gaiola torácica com uma tesoura para ter acesso ao coração.
3. Insira a agulha de 26 G no ventrículo esquerdo do coração e comece a perfuse com 20 mL de paraformaldeído gelado de 4% (PFA) em 1x PBS a 2 mL/min. Use uma tesoura para cortar rapidamente o átrio direito e soluturar o fluxo de fluido de perfusão.
4. Remova completamente a pele com fórceps e corte as quatro pernas com uma tesoura. Remova todos os órgãos internos, mas tenha cuidado para preservar as LNs intactas.
   NOTA: As LNs mandibulares são superficiais, por isso tome cuidado para não removê-las ao cortar a pele. LNs cervicais profundas (dcLNs) estão localizadas em cada lado da traqueia, em contato com a superfície lateral das veias jugulares internas e próximas aos músculos estereomestoides.
5. Corte as costelas para remover a coluna vertebral com a medula espinhal dentro da cervical para os segmentos lombares.
6. Mergulhe os tecidos dissecados em PFA de 4% no frio do gelo em 1x PBS em um tubo de 50 mL durante a noite (~18 h) a 4 °C. Lave os tecidos fixos 3x em 50 mL de 1x PBS por 5 min.

4. Macroscopia de fluorescência de um segmento vertebral

1. Posicione a amostra sob o microscópio de estereózoomo de fluorescência com uma câmera(Tabela de Materiais). Faça uma visão geral da amostra ou amplie em uma região específica.

5. Preparação da amostra para imunostaining de montagem inteira

1. Usando uma lâmina de microtoma, corte transversalmente a coluna cabeça-vertebral nos níveis occipital e cervical.
   NOTA: Esta dissecção permite o isolamento da cabeça e da região vertebral cervical do resto da coluna vertebral.
2. Com uma lâmina de microtome, corte as regiões cervical, torácica e sacral da coluna vertebral transversalmente em segmentos de 2-4 vértebras, cerca de 0,5 cm de tamanho cada.
3. Isolar cada segmento na ordem foi separado do eixo vertebral, ao longo de toda a extensão das regiões cervical e torácica da coluna vertebral. Preserve cada amostra em um tubo de 2 mL 1x PBS.

6. iDISCO⁺ imunostaining de montagem inteira de um segmento vertebral

NOTA: A descrição detalhada do protocolo iDISCO⁺ é acessível em http://www.idisco.info.

1. Dia 1: Desidratação tecidual
   1. Desidratar amostras de tecido vertebral (ou seja, segmento vertebral) por imersão sucessiva em 20%, 40%, 60%, 80% e 100% metanol em 1x PBS por 1h com agitação.
   2. Incubar as amostras durante a noite em uma solução de 33% de metanol/66% de diclorometano (DCM) à temperatura ambiente (RT) com agitação.
2. Dia 2: Branqueamento de tecidos
   1. Lave amostras 2x com 100% de metanol por 1 h na RT. Incubar as amostras em 5% H₂O₂ em metanol (30% H₂O₂ e metanol 1:5 v/v) a 4 °C durante a noite.
3. Dia 3: Etapa de descalcificação e permeabilização
   1. Reidratar as amostras gradualmente em 80%, 60%, 40%, 20% metanol, depois em 1x PBS (1h em cada solução) na RT com agitação.
   2. Decalcificar as vértebras incubando amostras na solução de Morse (citrato de trisódico de 10% e 45% ácido fórmico 1:1 v/v) por 30 minutos na RT para preservar a estrutura óssea.
   3. Enxágüe as amostras 2x com PBS 1x e incubar 2x por 1h em solução PTx2 (0,2% Triton X-100 em 1x PBS, renove para a segunda incubação) na RT com agitação. Em seguida, incubar as amostras pré-tratadas na solução de permeabilização (PTx2 com 20% de sulfóxido de dimetil [DMSO] e 2,3% w/v glycine) a 37 °C por 24 h.
4. Dia 4: Etapa de bloqueio
   1. Incubar amostras em solução de bloqueio (PTx2 com soro de burro de 6% e 10% DMSO) a 37 °C por 24 h.
5. Dias 5-16: Imunolabeling de montagem inteira
   1. Incubar amostras em anticorpo primário diluído em PTwH (1x PBS contendo 0,2% Tween-20 e 0,1% heparina a 10 mg/mL em 1x PBS) com 5% de soro de burro DMSO/3% a 37 °C por 6 dias. Lave amostras 4-5x em PTwH no RT com agitação durante a noite.
   2. Incubar amostras em diluições secundárias de anticorpos em PTwH com soro de burro de 3% a 37 °C durante 4 dias. Lave amostras em PTwH 4-5x em RT sob agitação durante a noite antes de limpar.
6. Dias 17 e 18: iDISCO⁺ limpeza tecidual
   1. Desidratar amostras gradualmente por sucessiva imersão em 1x PBS, depois 20%, 40%, 60%, 80% e 2x em 100% de metanol (1h em cada solução). Incubar cada amostra durante a noite em uma solução de 33% de metanol/66% DCM.
   2. Lave 2x em 100% DCM por 15 minutos para remover o metanol. Incubar em éter dibenzyl (DBE) sem tremer até limpar (4h) e depois armazenar em DBE no RT antes da imagem.

7. Imagem LSFM

1. Amostras limpas de imagem em um plano transversal com o LSFM equipado com um objetivo 4x/0.3.
   1. Use uma configuração de iluminação de três folhas unilateral, posição x fixa (sem foco dinâmico). Use lasers LED sintonizados a 561 nm, 100 mW; e 639 nm, 70 mW. Coloque a abertura numérica da folha de luz para 30%.
   2. Use diferentes filtros de emissão: 595/40 para Alexa Fluor-568 ou -555, e -680/30 para Alexa Fluor-647.
2. Encha a câmara de microscópio com DBE.
3. Aquire empilha com etapas de 2,5 μm z e um tempo de exposição de 30 ms por passo com a câmera (Tabela de Materiais). Use o zoom óptico x2 para uma ampliação efetiva de (x8), 0,8 μm/pixel, e realize as aquisições do mosaico com uma sobreposição de 10% no quadro completo.
4. Adquira imagens em formato .tif com software de aquisição e converta-as em formato 3D com um software de conversão de arquivos.
5. Reconstrua a aquisição de mosaicos com software de costura(Tabela de Materiais). Abra as imagens e mova-se manualmente para reconstituir toda a imagem do mosaico, usando a sobreposição de 10% entre as imagens como diretriz.
6. Utilize o software 3D (Tabela de Materiais) para gerar projeções ortogonais de dados, como mostrado na Figura 1, Figura 2, Figura 3e Figura 4, e adicione um atributo de código de cor aos vasos linfáticos e às outras estruturas anatômicas em exibição. Defina uma correção gama de 1,47 para os dados brutos obtidos do LSFM de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados

Imagem 3D da vasculatura linfática vertebral
A Figura 1 apresenta os passos do procedimento iDISCO⁺/LSFM e uma imagem LSFM de circuitos linfáticos dentro do canal vertebral das vértebras iDISCO⁺-tratadas thlb. A combinação de iDISCO⁺ com LSFM preservou a anatomia vertebral e capturou uma visão da rede vascular linfática (ou seja, os vasos intravertebral conectados com os vasos extravertebral que saem dorsal e lateralmente do corpo vertebral) dentro dos ossos, ligamentos, músculos e gânglios nervosos circundantes.

Imagem de macroscopia de fluorescência da drenagem dcLN
Para a drenagem da macromolécula no sistema linfático associado ao CNS, os rastreadores macromoleculares foram administrados in vivo por injeção no CSF ou no parênquim espinhal. Um rastreador macromolecular pode ser facilmente entregue no CSF na cisterna magna. A cisterna magna está localizada entre o cerebelo e a superfície dorsal da medula oblongata, acima do foramen magnum. O rastreador macromolecular também pode ser injetado no parenchyma espinhal por cirurgia estereotática em diferentes níveis ao longo da coluna vertebral.

Os rastreadores macromoleculares utilizados foram diretamente rotulados com um fluorohore ou detectados após a morte por imunohistoquímica com anticorpos específicos. A Figura 2A ilustra o plano experimental de rastreamento do OVA-A⁵⁵⁵, um rastreador de peso molecular vermelho fluorescente e pequeno (cerca de 45 kDa), que foi injetado tanto no CSF (Figura 2B) quanto na região de ThLb da medulaespinhal (Figura 2C).

Aos 45 minutos após a injeção do rastreador macromolecular, os camundongos foram sacrificados, perfundidos com 4% de PFA, e processados para isolar segmentos dissecados da região do tronco cerebral da cabeça e da coluna vertebral que foram decalcificados e esclarecidos. A drenagem macromolécula foi então prontamente avaliada por imagens de macroscopia de fluorescência das LNs que coletam os CSF e fluidos peridurais. Como mostrado na Figura 2, injeção OVA-A⁵⁵⁵ tanto na CSF (Figura 2B) quanto na região thlb(Figura 2C) da medula espinhal resultou em acúmulo de OVA-A⁵⁵⁵ nas dcLNs a 45 minutos após a injeção. Esta observação indica a absorção e drenagem do rastreador fluorescente pelo sistema linfático; é um pré-requisito antes de prosseguir com o procedimento iDISCO⁺/LSFM para visualizar a drenagem linfática vertebral.

Imagem 3D de drenagem de macromoléculas no sistema linfático vertebral
Com base na detecção da rotulagem OVA-A⁵⁵⁵ em dcLNs, o procedimento iDISCO⁺/LSFM poderia ser aplicado a amostras vertebrais descalcificadas e pré-cleadas isoladas de camundongos injetados em OVA-A^555. Esta abordagem permitiu a criação de um mapa 3D da drenagem linfática de CSF e fluido peridural espinhal em um ponto de tempo específico após a injeção do rastreador. Este mapeamento 3D poderia ser realizado por segmentos de CNS sucessivas imagens, em cada nível de coluna vertebral, a partir do ponto de injeção.

A Figura 3A mostra o design experimental para injeção de OVA-A⁵⁵⁵ no parênquim espinhal ThLb e o padrão 3D resultante da distribuição OVA-A⁵⁵⁵ em um segmento vertebral cervical e torácico, em conjunto com a vasculatura linfática. Aos 45 minutos após a injeção de OVA-A^555, o acúmulo de OVA-A⁵⁵⁵ foi detectado em tecidos da medula espinhal e dcLNs (setas brancas na Figura 3B),de acordo com observações de microscópio ilustradas na Figura 2. Não foi detectado, no entanto, na vasculatura linfática cervical e torácica rotulada com anticorpos anti-LYVE1. A ausência de rastreador injetado por CSF nos vasos linfáticos vertebrais pode ser devido a um curto tempo de persistência do rastreador dentro de vasos linfáticos ou à falta de absorção do rastreador pelos vasos linfáticos(Figura 3C).

Para testar a primeira hipótese, o anticorpo anti-LYVE1 do coelho foi usado como uma etiqueta celular endotelial linfática para ligar vasos linfáticos associados ao CNS. O anticorpo anti-LYVE1 do coelho injetado foi detectado posteriormente pela imunohistoquímica com um anticorpo secundário anti-coelho, enquanto as células endoteliais linfáticas foram imunolateradas com anticorpos anti-PROX1. A Figura 4 representa o design experimental da injeção anti-LYVE1 no parênquim espinhal ThLb (Figura 4A), e o padrão de distribuição 3D resultante dos anticorpos LYVE1 em um segmento thlb próximo ao local da injeção, com relação à PROX1⁺ linfática(Figura 4B). Tanto os linfáticos vertebrais quanto suas conexões linfáticas extravertebrales foram rotulados por anticorpos anti-LYVE1 injetados, que comprovaram a absorção do rastreador por vasos linfáticos vertebrais e a drenagem linfática em direção ao sistema linfático extravertebral. Faltavam LNs na região de ThLb e, assim, não podiam ser visualizadas no segmento de imagens. Além disso, o padrão descontínuo do marcador LYVE1 observado ao longo dos vasos linfáticos provavelmente refletiu a expressão descontínua de LYVE1 na vasculatura linfática, como relatado em estudos anteriores^14,21. Ao todo, os resultados do presente estudo demonstraram que, aos 45 minutos após a injeção do rastreador, o anticorpo LYVE1, mas não o OVA-A^555,permitiu a detecção da absorção linfática vertebral local e foi preferível ao OVA-A⁵⁵⁵ como marcador persistente de drenagem linfática vertebral local.

Figura 1: Visão tridimensional da vasculatura linfática vertebral. (A) Representação esquemática do protocolo. (B) Projeção planar de uma visão 3D da vasculatura linfática vertebral thlb de uma perspectiva dorsofrontal. Os vasos linfáticos foram imunolaterados com o anticorpo anti-PROX1 (verde) usando o protocolo iDISCO⁺ e, em seguida, imagedos pela LSFM. Observe o padrão metamédico da vasculatura dentro do canal vertebral de três vértebras sucessivas (pontas de flechabrabra). Além de vasos dorsais semicirculares (pontas de flechabrabrabra), cada rede vertebral incluía ramos ventral (setas amarelas), vias de saída laterais bilaterais ao longo do rami espinhal e gânglios (setas brancas), bem como uma rota de saída dorsal na linha média (seta dupla branca). As redes vertebrais foram interligadas com um vaso longitudinal (setas roxas). Para obter uma descrição completa, consulte Jacob L. et al.¹⁸ SC = medula espinhal; Asterisco = corpo vertebral ventral; D = dorsal; L = lateral; V = ventral; Barras de escala = 300 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: dcLNs coletadas OVA-A⁵⁵⁵-rotuladas CSF Fluids. (A) Esquema do projeto experimental. OVA-A⁵⁵⁵ foi injetado no ICM ou no parênquim espinhal ThLb, então os ratos foram sacrificados 45 minutos após a injeção. As amostras foram desmatadas e observadas por imagem do macroscópio de fluorescência(B,C). Imagens do macroscópio de fluorescência de vértebras cervival do ICM- (B) e ThLb- (C) injetaram camundongos. Note-se que o OVA-A⁵⁵⁵ acumulou nas dcLNs (B,C, pontas de flechabrabrabra, os espaços pial e paravascular da medula espinhal cervical (B,C) e após a injeção de ICM, em rotas de saída ventrolaterais, provavelmente ao longo dos nervos cervicais(B, setas brancas). SC = medula espinhal. Asterisco = corpo vertebral ventral; D = dorsal; L = lateral; V = ventral; Barras de escala em B e C = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Detecção de fluidos CSF rotulados em OVA-A⁵⁵⁵no sistema linfático vertebral. (A) Esquema do projeto experimental. OVA-A⁵⁵⁵ foi injetado no parnchyma espinhal ThLb, então os ratos foram sacrificados a 45 minutos após a injeção. As amostras foram tratadas com o protocolo iDISCO⁺ e com imagem com LSFM. (B,C) Projeções planares de visões 3D frontais capturadas pelo LSFM dos segmentos cervical(B) e torácico (C). Ova-A⁵⁵⁵ acúmulo (vermelho) foi detectado em tecidos medulares e dcLNs(B, seta branca), como ilustrado na Figura 2, mas não na imunolaculatura linfática cervical e torácica imunolabeled aqui com anticorpos anti-LYVE1 (verde). SC = medula espinhal; Asterisco = corpo vertebral ventral; D = dorsal; L = lateral; V = ventral; Barras de escala = 1 mm(B),300 μm(C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Detecção de drenagem linfática vertebral após injeção intraspinal de anticorpos anti-LYVE1. (A) Esquema do projeto experimental. Anticorpos anti-LYVE1 foram injetados no parnchyma espinhal ThLb, então os ratos foram sacrificados 45 minutos após a injeção. As amostras foram tratadas com o protocolo iDISCO⁺ e com imagem com LSFM. (B). Projeções planar de vistas 3D frontais de um segmento de coluna ThLb (B),capturadas com um LSFM. Anticorpos anti-LYVE1 foram detectados com anticorpos anti-coelho (roxo) e vasculatura linfática com anticorpos anti-PROX1 (verde). Os vasos brancos são PROX1⁺ linfáticos colabeled com anticorpos anti-LYVE1(B); estes incluem linfáticos vertebrais (setas amarelas) e linfáticos extravertebral (setas amarelas duplas). SC = medula espinhal; Asterisco = corpo vertebral ventral; D = dorsal; L = lateral; V = ventral; Barras de escala = 300 μm(B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Reagentes	Alvo	Figura	Passo do protocolo	Comentário
OVA-A555	Rastreador CSF	Figura 2 e Figura 3	2. Injeção de ICM ou ThLb 7. Imagem LSFM.	Solúvel em Água, fácil de injetar e alta fluorescência intensa
Anticorpo anti-Lyve1	Marcador de membrana de células LVs	Figura 3	6. iDISCO+ montagem inteira immnunostaining. 7. Imagem LSFM.	Anticorpo eficiente para todo o monte immnunostaining
	Drenagem de rastreadores dos LVs durais e peridural	Figura 4	2. Injeção de ICM ou ThLb 6. iDISCO+ montagem inteira immnunostaining 7. Imagem LSFM
Anticorpo anti-Prox1	Marcador nuclear de células LVs	Figura 1 e Figura 4	6. iDISCO+ montagem inteira immnunostaining 7. Imagem LSFM	Anticorpo eficiente para todo o monte immnunostaining

Tabela 1: Anticorpos e rastreadores utilizados no estudo.

	Problema	Possível razão	Solução
Cirurgia para injeção de rastreador	Lesão de tecido CNS indesejada	1. Falta de controle da inserção capilar de vidro 2. Profundidade incorreta da inserção capilar de vidro	1. Punctar com cuidado, mas totalmente, a dura mater com uma agulha de 26 G antes da inserção capilar de vidro. 2. Reduza a profundidade da inserção capilar de vidro (<1,5 mm da dura mater). 3. Reduza o diâmetro capilar do vidro.
	Contaminação indesejada de rastreador injetado nos espaços peridural ou extra-vertebral	Injeção incorreta de rastreador	1. Verifique se o micro capilar de vidro foi bem inserido no punctate da dura-maternidade. 2. Adicione cola cirúrgica entre a microcapilaria de vidro e o tecido cercado antes de injetar rastreador.
		Volume excessivo de rastreador injetado	Reduza o volume de rastreador injetado (<2 μL).
imunostaining iDISCO+	Ausência, heterogeneidade ou fundo excessivo de rotulagem no tecido	1. Problemas com a concentração do anticorpo primário 2. Permeabilização insuficiente 3. Lavagem insuficiente 4. Compensação insuficiente	Aumente o número e/ou o tempo de etapas de incubação: permebilização, chorão, anticorpo primário e compensação. Consulte http://www.idisco.info (faq e solução de problemas).
		Decalcificação insuficiente	Use um tratamento de decalcificação mais rigoroso da amostra com edta21 ou solução Morse para tecidos de cabeça especialmente.
compensação do iDISCO+	As amostras são opacas ou de cor marrom	Branqueamento insuficiente	Use uma solução H2O2 fresca, aumente o volume e/ou o tempo de incubação.
		Presença de oxidação	Encha o tubo completamente para evitar a presença de ar.
		Compensação insuficiente	Aumente o volume e/ou o tempo de incubação. Consulte http://www.idisco.info (faq e solução de problemas).
Detecção de rastreador	Rastreador indetectável	Combinação incorreta do rastreador selecionado	Alexa 555, 594 e 647 fluorochromes são resistentes ao protocolo iDISCO+5,6,7,,8,,9,,10. No entanto, este não é o caso para fitc, GFP, rfp fluorochromes.
		Ponto de tempo de sacrifício após injeção	Prefira o OVA-A555 para análise de drenagem de curto prazo (15 min) em linfáticos vertebrais locais. Para análise de drenagem de linfonodos, o anticorpo OVA-A555 e Lyve1 pode ser usado para análise de longo prazo (>45 min).
Imagem: captura e análise	Imagens capturadas do circuito linfático não são satisfatórias	Problema de dissecação (linfonodos estão faltando)	Inclua cuidadosamente os tecidos vertebrais/crânio vizinhos em sua amostra dissecada, de acordo com o circuito linfático que você deseja imaginar.
		Problema de imagem	1. Modifique os parâmetros de aquisição do LSFM: intensidade do laser, abertura numérica de folha de luz, espessura da folha de luz, tempo de exposição. 2. Coloque a amostra no suporte para reduzir o caminho percorrido pela luz através do tecido até o objetivo. 3. Certifique-se de que não há bolhas dentro da amostra de tecido durante a aquisição.

Tabela 2: Assessoria de solução de problemas para cada etapa do protocolo, incluindo possíveis problemas e soluções.

Discussão

O protocolo iDISCO⁺/LSFM fornece visões 3D sem precedentes da rede linfática associada ao CNS dentro de seus tecidos circundantes em um nível de resolução celular. Este protocolo é bem adaptado a amostras de médio porte, não execulando 1,5 cm^3,devido às limitações do sistema óptico LSFM, à distância de trabalho reduzida e ao grande tamanho das lentes objetivas comerciais para microscopia de alta resolução²³. Essa limitação impede a captura de todo o sistema linfático associado ao cérebro. É importante ressaltar que a área de investigação deve ser cautelosamente delimitada e os tecidos ao redor do CNS devem ser cuidadosamente dissecados para incluir os vasos linfáticos extracranianos e LNs que contribuem para todo o circuito linfático(Tabela 2).

Além do tamanho e das considerações anatômicas, a complexidade dos tecidos mesenquimais circundantes varia ao longo da coluna crânio e vertebral, o que requer adaptação do tratamento de decalcificação e pré-liberação, a fim de obter um esclarecimento de amostra homogênea e permitir a propagação do feixe de luz dentro de um tecido biológico isotrópico macio. Na ausência de ossos, a imagem lfsm do cérebro ou tecidos da medula espinhal não requer a etapa de decalcificação, e a resolução final das imagens capturadas é ótima¹⁹. O protocolo descrito acima, que inclui uma leve etapa de decalcificação com a solução de Morse, é bem adaptado para imagens LSFM da coluna vertebral como ilustrado nas Figuras 1 e Figura 4. Em contraste, a região do pescoço exibe uma anatomia óssea particularmente complexa, além de múltiplas camadas de músculos, gordura e tecidos glandulares, que reduzem a qualidade das imagens LSFM capturadas, como refletido na Figura 3B. A imagem LSFM do pescoço e da área cervical pode, assim, ser melhorada por um tratamento mais rigoroso dos tecidos; por exemplo, com EDTA, como relatado anteriormente²⁴. A etapa de descalcificação é, portanto, crítica e as condições de decalcificação devem ser previamente testadas para cada anticorpo utilizado antes de iniciar o protocolo iDISCO⁺ completo(Tabela 2).

Enquanto o protocolo iDISCO⁺/LSFM permite a geração de uma visão 3D de circuitos de conexão entre os espaços meningeais e peridural e LNs associadas, a análise quantitativa direta da vasculatura linfática das imagens capturadas pelo LSFM não é viável pelas seguintes razões: 1) o delineamento dos circuitos de vasos linfáticos não é confiável devido ao padrão descontínuo da expressão do marcador linfático, pois membranar LYVE1 é hereterogenously distribuído²¹ e PROX1 tem um padrão de expressão nuclear²²; 2) a penetração heterogênea dos anticorpos, bem como a anisotropia que pode persistir no tecido biológico devido à decalcificação incompleta e heterogênea e preclearing. Assim, a imagem LSFM precisa ser estendida por ferramentas de realidade virtual que possibilitem a visualização interativa e facilitam a quantificação da vasculatura linfática (www.syglass.io). Também é notável que a descrição precisa do circuito associado ao CNS requer o backup de informações LSFM com dados confocal de alta resolução obtidos por imunolabeling convencional em seções de criostat fino (5-10 μm) ou seções de tecido embarcado em parafina, especialmente para localização precisa da posição dos vasos linfáticos no que diz respeito à dura-maternidade e ao CSF, conforme relatado anteriormente^11,,14,18.

O protocolo iDISCO⁺/LSFM permite a visualização tridimensional da drenagem macromolecular no sistema linfático associado ao CNS, conforme ilustrado nas Figuras 3 e Figura 4. No entanto, a avaliação funcional da drenagem linfática requer, além das recomendações do protocolo iDISCO +/LSFM detalhado acima, seguindo um procedimento rigoroso, pois o resultado final depende da qualidade da cirurgia de injeção, da escolha do local de entrega, do tipo e do volume injetado do marcador de macromoulelec utilizado, e do tempo de sacrifício após a administração do rastreador(Tabela 2). ⁺ Devido às variações do padrão do rastreador entre os animais injetados, a caracterização de circuitos de drenagem linfática requer grandes grupos experimentais (>10 por condição de injeção). No protocolo apresentado, 1) a dura-seca deve ser perfurada antes da injeção para evitar lesões indesejadas e penetração nos tecidos cns; 2) o volume injetado deve ser inferior a 2 μL para limitar a difusão indesejada através do orifício de injeção, ao longo da capilar de injeção, no espaço peridural ou nos tecidos extravertebrales; 3) a profundidade da inserção capilar por injeção deve ser limitada a 2 mm abaixo da dura-maternidade para evitar lesões de CNS ou erro de injeções de ICM e intraspinais, respectivamente. Note-se também que é necessário realizar uma análise confocícal complementar de alta resolução dos segmentos vertebrais vizinhos, conforme indicado acima, para avaliar a presença de rastreador injetado dentro dos vasos linfáticos. Esta análise requer o estabelecimento das parcelas de perfil de intensidade para o rastreador e o marcador linfático em seções transversais de vasos linfáticos rotulados com marcadores. Esta abordagem foi usada anteriormente para demonstrar a absorção de OVA⁵⁵⁵ por Linfáticos ThLb em 15 minutos após a injeção (Figura Suplementar 5F em Jacob et al.¹⁴). No entanto, não foi ilustrado para o rastreador anti-LYVE1 no presente estudo(Figura 4).

Entre os possíveis rastreadores CSF, o OVA-A⁵⁵⁵ é uma excelente opção, pois é resistente aos tratamentos de protocolo iDISCO⁺ e mantém alta fluorescência para imagens LSFM. No entanto, observe que o tipo de rastreador deve ser escolhido de acordo com o ponto de tempo de análise(Tabela 1 e Tabela 2). Conforme relatado acima, a rotulagem OVA-A⁵⁵⁵ de vasos linfáticos vertebrais locais é observada em 15 minutos após a injeção¹⁴. No entanto, o OVA-A⁵⁵⁵ não é mais detectado nestes circuitos linfáticos locais a 45 minutos após a injeção(Figura 3)em contraste com o anticorpo anti-LYVE1(Figura 4).

Para concluir, o protocolo iDISCO⁺/LSFM está bem adaptado para investigar a estrutura 3D e a drenagem do sistema linfático associado ao CNS em condições fisiológicas e patológicas, como câncer de CNS e coluna vertebral, ou doenças ósseas e articulares vertebrais. Embora o procedimento completo seja longo e exija rigor metodológico, fornece informações valiosas e únicas quando utilizadas com análises complementares usando ferramentas de realidade virtual e imagens confocal de alta resolução.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Consumíveis
Tubos de centrífuga: 0,2ml	Eppendorf	30124359
Tubos de centrífuga: 2ml	Eppendorf	30120094
Tubos de centrífuga cônicos: 15ml	Falcon	352096
Tubos de centrífuga cônicos: 50ml	Falcon	352070
Micrótomo lâmina 80mm	Microm Microtech France	F/MM35P
Agulhas 26G (0.45x13 mm)	Terumo	AN*2613R1
Seringa 1ml	Terumo	SS+01H1
Microscópios e softwares de imagem
AxioZoom.V16 microscópio de zoom estéreo de fluorescência, equipado com uma câmera digital sCMOS ORCA-Flash 4.0 (Hamamatsu Photonics) ou um OptiMOS sCMOS câmera	Zeiss
Imspector Microscópio controlador software, Versão v144 (software de aquisição)	Instrumentos
Imaris File Converter x64 9.2.0 (software de conversão de arquivos), Imaris stitcher software 9.2.0 (software stitcher), Imaris x64 9.2.0 (software 3D)	Instrumentos
Lasers LED (OBIS) LVBT Módulo de laser 2ª geração	COERENTE
Ultramicroscópio II equipado com uma câmera sCMOS (Andor Neo) e um 4  &vezes;  /0.3 lente objetiva (LVMI-Fluor WD6)	LaVision Biotec
Reagents
Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit	Thermo Fisher	A10042
Alexa Fluor 647 Donkey anti goat	Jackson ImmunoResearch	705-605-147
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit	Jackson ImmunoResearch	711-605-152
Anticorpo policlonal anti-LYVE1	Angiobio	#11-034
Anticorpo IgG policlonal de cabra anti-PROX1	R& Sistemas D	#AF2727
Ampolas de injeção de buprenorfina (solução de Buprecare, 0,3 mg / ml)	Ampola para cuidados com animais	1ml
Éter dibenzílico 100% (DBE)	Sigma Aldrich	108014
Diclorometano 100% (DCM)	Sigma Aldrich	270997
ácido fórmico 99%	CARLO ERBA	405793
Glicina	Sigma Aldrich	G.7126
Sal de heparina sódica de suíno	Sigma Aldrich	H4784
Solução de peróxido de hidrogênio (H2< / sub>O2< / sub> 30%)	Sigma Aldrich	H1009
Isoflurano (Iso-Vet 100%)	Piramal	NDC 66794-013-10
Metanol 100%	Sigma Aldrich	322415
Ovalbumina Alexa Fluor 555 Conjugado	Invitrogen	11549176
Solução Tampão de Fosfato PBS (solução estoque 10X)	Euromedex	ET330-A
Pentobarbital de Sódio (Euthasol 400mg/mL)	Dechra	08718469445110
Citrato de Trissódico	VWR	6132-04-3
Ferramentas e equipamentos cirúrgicos
Sistema de anestesia	Univentor Univentor	410 Unidade
Extrator de micropipeta de vidro	Narishige	PC-10
Almofada de aquecimento	CMA Microdiálise AB	CMA 450 Controlador
Microcapilares (capilares de vidro)	Harvard Apparatus	GC120-15
Microfórceps, fórceps, tesouras de dissecção e clipes de sutura Michel (7.5  &vezes;   1.75mm)	Fine Science Tool	12040-01
Bisturi (bisturi descartável estéril 23)	Swann-Norton	0510
Aparelho estereotáxico	KOPF	Modelo 940
Seringa Hamilton 10µ l 701N	Hamilton	28618-U
Sistema de ar quente	Vet-Tech LTD	HE011