Artigo de método

Quantificando o declínio proteostático específico do tecido em elegans caenorhabditis

DOI:

10.3791/61100

⸱

7 de setembro de 2021

 ,  , 
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center

Neste artigo

Resumo

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O declínio proteostático é uma marca do envelhecimento, facilitando o aparecimento de doenças neurodegenerativas. Delineamos um protocolo para medir quantificadamente a proteostase em dois tecidos elegans caenorhabditis diferentes através da expressão heteróloga de repetições de poliglutamina fundidas a um repórter fluorescente. Este modelo permite uma rápida análise genética in vivo da proteostase.

Resumo

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A capacidade de manter a função adequada e o dobrável do proteome (proteína homeostase) diminui durante o envelhecimento normal, facilitando o aparecimento de um número crescente de doenças associadas à idade. Por exemplo, proteínas com expansões de poliglutamina são propensas à agregação, como exemplificado com a proteína de huntingtina e o aparecimento concomitante da doença de Huntington. A deterioração associada à idade do proteome tem sido amplamente estudada através do uso de caenorhabditis elegans transgênicos expressando repetições de polq fundidas a uma proteína fluorescente amarela (YFP). Este modelo animal transgênico poliQ::YFP facilita a quantificação direta do declínio associado à idade do proteome através da imagem da formação progressiva de focos fluorescentes (ou seja, agregados proteicos) e subsequente aparecimento de defeitos de locomoção que se desenvolvem como resultado do colapso do proteome. Além disso, a expressão do transgênico polyQ::YFP pode ser impulsionada por promotores específicos do tecido, permitindo a avaliação da proteostase entre tecidos no contexto de um organismo multicelular intacto. Este modelo é altamente receptivo à análise genética, proporcionando assim uma abordagem para quantificar o envelhecimento que é complementar aos ensaios de vida útil. Descrevemos como medir com precisão a formação de focos de polq::YFP dentro de neurônios ou músculos da parede corporal durante o envelhecimento, e o subsequente aparecimento de defeitos comportamentais. Em seguida, destacamos como essas abordagens podem ser adaptadas para maior rendimento e potenciais aplicações futuras usando outras estratégias emergentes para a análise genética de C. elegans.

Introdução

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A homeostase proteica (proteostase) é definida como a capacidade celular de manter a função adequada e a dobra do proteome. O desafio inerente à proteostase é garantir que todas as proteínas sejam devidamente dobradas e mantidas em uma conformação nativa, que é ainda mais amplificada pela natureza variada do tamanho da proteína, composição de aminoácidos, conformação estrutural, estabilidade, rotatividade, expressão, compartimentação subcelular e modificações1. A proteostase é mantida através da ação coordenada de uma grande rede proteostática, composta por aproximadamente 2000 proteínas únicas, que regulam a síntese adequada, dobramento, tráfi....

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Protocolo

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1. Preparação de reagentes

  1. Selecione genes de interesse para serem inativados através de RNAi baseados em alimentação. Comprar ações da HT115 E. coli contendo o clone RNAi de interesse20. Alternativamente, subclone o cDNA do gene de interesse no local multicloning do plasmídeo L4440.
    NOTA: Para evitar a degradação do dsRNA dentro da bactéria, use a cepa HT115. Esta é uma cepa E. coli deficiente RNase III com atividade de polimerase T7 indutível pelo IPTG. Para estudos de proteostase que não utilizam RNAi à base de alimentação, podem ser utilizados HT115 ou OP50 E. coli em placas padrão de GNM.
  2. P....

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Resultados

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Em C. elegans,o modelo de repetição de poliglutamina tem sido fundamental para a identificação de genes que regulam a rede proteostática. Por exemplo, mostramos anteriormente que a quinase proteica interativa de homeodomina (hpk-1),um cofator transcricional, influencia a proteostase durante o envelhecimento, regulando a expressão da autofagia e dos acompanhantes moleculares31. Descobrimos que a perda de hpk-1, seja por silenciamento RNAi ou em animais mutantes nulos .......

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Discussão

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O envelhecimento é caracterizado por um declínio gradual da proteostase. A proteostase é mantida por um sistema complexo, a rede proteostática, para o controle coordenado, dinâmico e responsivo do estresse do dobrável, degradação e tradução de proteínas. Por que a proteostase falha no curso do envelhecimento é mal compreendida, mas um epigenome em decomposição, a induibilidade em declínio das respostas ao estresse e a perda de conversa cruzada compensatória coincidem com esse colapso. Em C. elegans, a indução tr.......

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Gostaríamos de agradecer aos membros passados e presentes do laboratório Samuelson por sua assistência no refinamento deste método e/ou discussão que auxiliou no desenvolvimento deste manuscrito. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Envelhecimento dos Institutos Nacionais de Saúde sob os Números de Premiação RF1AG062593 e R21AG064519. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas de Cultura de 24 PoçosGreiner Bio-One#662102
2 mL Placas de 96 poçosGreiner Bio-One#780286
600 µ L Placas de 96 poçosGreiner Bio-One#786261
Replicador de placas de 96 pinosNunc250520
Vedação de placa permeável ao arVWR60941-086
ágar bacteriológicoAffymetrix/USB10906
bactopeptonaVWR90000-368
Biblioteca de clones de RNAi de C. elegans em bactérias HT115- AhringerFonte: BioscienceColeção de RNAi de C. elegans (Ahringer)Ver também Kamath, et. al, Nature 2003.
Biblioteca de clones de RNAi de C. elegans em bactérias HT115 - VidalSource BioscienceC. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)Veja também Rual et. al, Genome Research 2004. Esta biblioteca também está disponível na Dharmacon.
FuDR (5-Fluoro-2'-desoxiuridina)Alfa AesarL16497
Lamínulas de vidro para microscópioVWR48404-455
Lâminas de vidro para microscópioVWR160004-422
IPTG (isopropil beta-D-1-tigalactopiranosídeo)Gold Bio12481C100
Placa retangular de poço único não tratada, 128x86mmThermo-Fisher
azida de sódio, CAS #26628-22-8Sigma-AldrichS2002
Zeiss Axio Imager M2m microscópio com software AxioVision v4.8.2.0Zeissdesconhecido
Zeiss StemiSV11 M2 Bio microscópio quádruploZeissdesconhecido
, 242811

Referências

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  1. Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
  2. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
  3. Powers, E. T., Morimoto, R. ....

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