O declínio proteostático é uma marca do envelhecimento, facilitando o aparecimento de doenças neurodegenerativas. Delineamos um protocolo para medir quantificadamente a proteostase em dois tecidos elegans caenorhabditis diferentes através da expressão heteróloga de repetições de poliglutamina fundidas a um repórter fluorescente. Este modelo permite uma rápida análise genética in vivo da proteostase.
A capacidade de manter a função adequada e o dobrável do proteome (proteína homeostase) diminui durante o envelhecimento normal, facilitando o aparecimento de um número crescente de doenças associadas à idade. Por exemplo, proteínas com expansões de poliglutamina são propensas à agregação, como exemplificado com a proteína de huntingtina e o aparecimento concomitante da doença de Huntington. A deterioração associada à idade do proteome tem sido amplamente estudada através do uso de caenorhabditis elegans transgênicos expressando repetições de polq fundidas a uma proteína fluorescente amarela (YFP). Este modelo animal transgênico poliQ::YFP facilita a quantificação direta do declínio associado à idade do proteome através da imagem da formação progressiva de focos fluorescentes (ou seja, agregados proteicos) e subsequente aparecimento de defeitos de locomoção que se desenvolvem como resultado do colapso do proteome. Além disso, a expressão do transgênico polyQ::YFP pode ser impulsionada por promotores específicos do tecido, permitindo a avaliação da proteostase entre tecidos no contexto de um organismo multicelular intacto. Este modelo é altamente receptivo à análise genética, proporcionando assim uma abordagem para quantificar o envelhecimento que é complementar aos ensaios de vida útil. Descrevemos como medir com precisão a formação de focos de polq::YFP dentro de neurônios ou músculos da parede corporal durante o envelhecimento, e o subsequente aparecimento de defeitos comportamentais. Em seguida, destacamos como essas abordagens podem ser adaptadas para maior rendimento e potenciais aplicações futuras usando outras estratégias emergentes para a análise genética de C. elegans.
A homeostase proteica (proteostase) é definida como a capacidade celular de manter a função adequada e a dobra do proteome. O desafio inerente à proteostase é garantir que todas as proteínas sejam devidamente dobradas e mantidas em uma conformação nativa, que é ainda mais amplificada pela natureza variada do tamanho da proteína, composição de aminoácidos, conformação estrutural, estabilidade, rotatividade, expressão, compartimentação subcelular e modificações1. A proteostase é mantida através da ação coordenada de uma grande rede proteostática, composta por aproximadamente 2000 proteínas únicas, que regulam a síntese adequada, dobramento, tráfico e degradação dentro do proteome2,3. Os componentes do cavalo de trabalho da rede proteostática são nove grandes famílias de acompanhantes moleculares4. Cada tipo de tecido e célula utiliza preferencialmente subconjuntos específicos de acompanhantes moleculares, presumivelmente em alinhamento com as diferentes demandas de proteomes distintos5.
Uma marca registrada do envelhecimento organismo normal é o declínio progressivo e o colapso da proteostase celular, que é considerada uma base subjacente para o início e progressão de um número crescente de doenças associadas à idade. Por exemplo, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, e a Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) compartilham uma característica comum: em cada caso, a manifestação da neurodegeneração é impulsionada por alterações genéticas que predispõem uma proteína mutante à agregação (amilóide-β/Tau, α-sinucleína, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1,respectivamente) 6,7,8, 8,9,10 . Durante o envelhecimento, a integridade e induibilidade da rede proteostática diminui, o que resulta no acúmulo de agregados proteotóxicos que resultam em disfunção celular e neurodegeneração. Note-se que as doenças conformais proteicas não são exclusivas dos neurônios, e ocorrem em múltiplos tecidos, como destacado pelo diabetes tipo II, mieloma múltiplo e fibrose cística11,12,13,14. Portanto, a elucidação de mecanismos capazes de preservar a proteostase facilitará o desenvolvimento de intervenções direcionadas para o tratamento da doença e promoverá o envelhecimento saudável.
O pequeno nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) tem sido fundamental na descoberta de genes e caminhos elucidadores que alteram a proteostase. Muitos componentes da rede proteostática e as vias de transdução de sinal que regulam a proteostase são evolutivamente conservados. Além disso, C. elegans reduziu a complexidade e a redundância em relação aos sistemas de vertebrados, tornando-o mais agradável à análise genética e à descoberta genética. Outras vantagens de C. elegans que o levaram a ser amplamente utilizado como um sistema modelo para estudar proteostase incluem: genômica genética e funcional poderosa, um ciclo de vida curto (3 dias) e vida útil (3 semanas), um genoma compacto e bem anotado, a disponibilidade de uma ampla variedade de mutantes genéticos, e a facilidade de visualizar mudanças específicas de tecido na biologia celular usando repórteres fluorescentes.
A decadência progressiva da proteostase durante o envelhecimento pode ser facilmente quantificada em C. elegans. O laboratório de Morimoto demonstrou pela primeira vez que uma expansão de poliglutamina fundida à proteína fluorescente amarela(polyQ::YFP) poderia ser usada para quantificar o declínio proteostático em C. elegans durante o envelhecimento15,16,17,18. As fusões de YFP a 35 repetições de glutamina ou mais resultam em uma formação associada à idade de focos fluorescentes, juntamente com sinais de patologia celular. Note-se que esta gama de expansão da glutamina reflete o comprimento do trato de poliglutamina da proteína Huntingtin na qual a patologia da Doença de Huntington começa a ser observada em humanos (tipicamente >35 CAG repete)19. Cepas com expressão de polq::YFP dentro de células musculares, intestinais ou neuronais têm sido utilizadas para confirmar que o declínio associado à idade da proteostase ocorre em diferentes tipos de células e tecidos. PoliQ específico para músculos::YFP expressão (i.e., unc-54p::Q35::YFP) tem sido o repórter mais amplamente utilizado como tecido específico, pois os focos fluorescentes acumulados são fáceis de quantificar nos primeiros dias da vida adulta usando um simples microscópio de dissecação fluorescente(Figura 1A-1B). Além disso, os animais ficam paralisados durante a meia-idade, pois o proteome dentro do músculo entra em colapso devido ao efeito proteotóxico do repórter(Figura 1C). Da mesma forma, o declínio associado à idade na proteostase neuronal pode ser seguido(rgef-1p::Q40::YFP) quantificando diretamente a formação de focos/agregados e declínios associados à idade em curvas corporais coordenadas após a colocação de animais em líquido(Figura 2).
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado sobre como medir a progressão dependente da idade do acúmulo agregado de proteínas e a proteotoxicidade associada induzida pela expressão de poliglutamina repetida dentro do tecido neuronal e muscular em C. elegans. Fornecemos exemplos de resultados típicos gerados usando essas cepas e métodos. Além disso, mostramos como utilizamos esses métodos para estudar a regulação transcricional da rede proteostática. Discutimos maneiras adicionais de esses repórteres serem facilmente integrados com outros reagentes existentes ou adaptados para telas maiores.
O envelhecimento é caracterizado por um declínio gradual da proteostase. A proteostase é mantida por um sistema complexo, a rede proteostática, para o controle coordenado, dinâmico e responsivo do estresse do dobrável, degradação e tradução de proteínas. Por que a proteostase falha no curso do envelhecimento é mal compreendida, mas um epigenome em decomposição, a induibilidade em declínio das respostas ao estresse e a perda de conversa cruzada compensatória coincidem com esse colapso. Em C. elegans,</…
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer aos membros passados e presentes do laboratório Samuelson por sua assistência no refinamento deste método e/ou discussão que auxiliou no desenvolvimento deste manuscrito. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Envelhecimento dos Institutos Nacionais de Saúde sob os Números de Premiação RF1AG062593 e R21AG064519. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.
24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
2 mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
Glass microscope cover slips | VWR | 48404-455 | |
Glass microscope slides | VWR | 160004-422 | |
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
Sodium Azide, CAS #26628-22-8 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software | Zeiss | unknown | |
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope | Zeiss | unknown |