Otimização da Técnica de Manguito para Transplante de Coração de Murine

Resumo

Introduzimos uma abordagem interna do tubo da técnica de manguito para transplante de coração heterotópico cervical do rato para ajudar a everter o vaso sobre a braçadeira. Descobrimos que a cooperação entre dois cirurgiões experientes diminui significativamente o tempo de operação.

Resumo

O transplante cardíaco de Murine é realizado há mais de 40 anos. Com os avanços na microcirurgia, algumas novas técnicas têm sido usadas para melhorar a eficiência cirúrgica. Em nosso laboratório, otimizamos a técnica da braçadeira com dois passos principais. Primeiro, utilizamos a técnica do tubo interno para inserir um tubo interno temporário na veia jugular externa e no vaso sanguíneo da artéria carótida para facilitar a eversão do vaso sobre a braçadeira. Em segundo lugar, realizamos transplante cardíaco heterotópico completo através da colaboração de dois cirurgiões experientes. Essas modificações efetivamente reduziram o tempo de operação para 25 minutos, com uma taxa de sucesso de 95%. Neste relatório, descrevemos esses procedimentos em detalhes e fornecemos um vídeo suplementar. Acreditamos que este relatório sobre a técnica aprimorada da braçadeira oferecerá orientação prática para transplante de coração heterotópico murine e aumentará a utilidade deste modelo de camundongos para pesquisa básica.

Introdução

O estabelecimento de transplante de coração heterotópico de camundongos por meio de anastomose de ponta a ponta no abdômen em 1973 foi um marco importante na pesquisa básica de imunologia de transplante¹. Este modelo forneceu uma ferramenta importante e válida para a análise dos mecanismos de isquemia de reperfusão^{lesão 2,}rejeição imunológica e tolerância^3,4. No entanto, a natureza complexa e demorada da cirurgia, bem como o potencial de infecções podem resultar em aderências abdominais perioperatórias graves e reações inflamatórias, resultando em baixa eficiência para o modelo heterotópico de transplante cardíaco.

A técnica de transplante de coração heterotópico cervical foi descrita pela primeira vez por Chen em 1991⁵. Neste modelo, a veia jugular externa do receptor é anastomosada à artéria pulmonar do enxerto e a artéria carótida é anastomosada à aorta ascendente. As principais vantagens desse método são a conveniência de monitorar e reduzir o trauma ao receptor. No mesmo ano, Matsuura descreveu uma técnica melhorada, na qual a extremidade da veia jugular externa e da artéria carótida foram sempre sempre realizadas sobre um manguito de Teflon e fixadas com uma ligadura de seda circunferencial⁶. Alguns pesquisadores também fixaram a braçadeira na artéria pulmonar direita no coração doador antes de inserir o manguito na veia jugular externa do receptor⁷. Até agora, a técnica da braçadeira tem sido amplamente aplicada em vários modelos de transplante de pediculo vascular, incluindo os do pulmão⁸, fígado⁹e transplante renal^10.

Até o momento, existem várias dificuldades associadas à técnica da braçadeira. Por exemplo, a artéria carótida é difícil de eterncar sobre a braçadeira devido à elasticidade adicional, resultando na inversão do tecido. Assim, uma prática adicional e um dilador microcirúrgico podem ser necessários para completar esta etapa. Além disso, a preparação do vaso cervical pode levar até 25 minutos.

Para resolver esses problemas, introduzimos a técnica do tubo interno, que é baseada na técnica da braçadeira e inclui a fixação da braçadeira na veia jugular externa e na artéria carótida usando um tubo interno para ajudar na eversão da parede do vaso. Além disso, com treinamento simples, a preparação do receptor é reduzida para 15,5 minutos. Esta técnica reduz a complexidade da operação e não requer prática adicional ou o uso de um dilatador vascular. Pode ser aplicado em todas as pesquisas imunológicas de transplante, especialmente para verificar a tolerância imune de terceiros durante a qual o receptor recebe dois arófilos cardíacos, um dentro do abdômen e outro no pescoço¹¹. Também recomendamos a cooperação entre dois cirurgiões qualificados para estabelecer esse modelo, com um cirurgião preparando o animal receptor e o outro colhendo e implantando o coração doador. Tal colaboração pode reduzir o tempo de operação para 25 minutos. Utilizando este procedimento otimizado, estabelecemos modelos de transplante de coração de camundongos síngênicos, aogênicos^{12,,13,,14,,15,,16,,17,,18,,19}e xenogênicos de transplante de coração de^{camundongos 20}.

A justificativa para o desenvolvimento da técnica do tubo interno foi reduzir o tempo de operação para o estabelecimento de um modelo de transplante de coração de camundongos com alta taxa de sucesso. A otimização do modelo de transplante cardíaco cervical facilita a aquisição de altas taxas de sucesso em um curto período de tempo de cirurgia em comparação com a técnica tradicional de sutura e manguito²¹. Além disso, o modelo de cooperação pode reduzir ainda mais o tempo isquêmico quente do coração doador em comparação com as cirurgias realizadas com um único operador.

Protocolo

Os animais (BALB/c, C57BL/6, macho, 8-12 semanas) estão alojados em uma instalação específica sem patógenos no Centro de Animais do Laboratório da Universidade de Xiamen. C57BL/6 é usado como receptor e BALB/c é usado como doador. Todos os procedimentos são realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC).

NOTA: Um conjunto de instrumentos microcirúrgicos, incluindo micro tesoura, micro fórceps retos, micro fórceps curvos e micro-agulhas, são necessários para a operação (Tabela e Materiais, Figura 1B, C, D, E). Um par de grampos bulldog de uso único (Figura 1F) é necessário. Duas algemas para a veia jugular externa e artéria carótida são preparadas cortando os tubos de poliamida personalizados com um bisturi nº 10 sob um microscópio. O diâmetro da veia e da braçadeira da artéria é de 0,9 mm e 0,55 mm, respectivamente. Além disso, o diâmetro do tubo interno para o manguito venoso correspondente é de 0,6 mm, e estes do tubo interno para o manguito artéria correspondente é de 0,28 mm(Figura 1G).

1. Preparação do destinatário

1. Anestesiar o mouse receptor com pentobarbital (60 mg/kg, i.p). Use cortadores mecânicos atrauáticos para remover o cabelo na região cervical lateral direita.
2. Use um aplicador de ponta de algodão estéril para limpar a área cirúrgica com antisséptico de iodo seguido de 70% de etanol.
3. Coloque o mouse na posição supina na plataforma de operação. Cubra o mouse com gaze estéril.
4. Use uma tesoura oftálmica para fazer uma incisão transversal da linha média inferior de um terço do pescoço até a articulação ombro-clavícula direita.
5. Isole a veia jugular externa direita com micro fórceps curvos para expor o comprimento suficiente, corte os galhos através de eletrocoagulação e liga o vaso na extremidade distal usando uma sutura de seda 6-0.
6. Fixar a veia jugular externa proximalmente usando um grampo bulldog e, em seguida, transectar a veia proximalmente para a ligadura usando uma micro tesoura.
7. Lave o lúmen do vaso com 100 U/mL 0-4 °C salina heparinizada para remover qualquer sangue residual.
8. Puxe a veia jugular externa através do manguito da veia usando micro fórceps retos; inserir o tubo interno da veia no lúmen como um stent, e evertir a parede do vaso sobre o punho com micro fórceps retos(Figura 2A).
9. Fixar o endotélio do vaso sempreado na extremidade proximal da braçadeira usando um 8-0 circunferencial sutura de seda(Figura 2B).
10. Use micro fórceps retos para retirar o tubo interno da veia do vaso venoso.
11. Realize dissecção contundente com micro fórceps curvos para isolar a artéria carótida direita adjacente à borda interna da esteocleidomastoide.
12. Fixar a artéria carótida direita proximicamente usando um grampo buldogue, ligar a artéria carótida distally usando uma sutura de seda 6-0, e usar uma micro tesoura para transectar a artéria carótida proximally para a ligadura.
13. Lave a artéria carótida com 100 U/mL 0-4 °C salina heparinizada para remover qualquer sangue residual.
14. Passe a artéria carótida através do manguito da artéria e insira o tubo interno da artéria no vaso da artéria usando micro fórceps retos(Figura 2C).
15. Everta o vaso sobre o manguito usando micro fórceps retos; corrigir o endotélio vaso everted usando um circunferencial 8-0 sutura de seda(Figura 2D).
16. Retire o tubo interno da artéria do vaso da artéria com micro fórceps retos.
    NOTA: Preserve a glândula submandibular do destinatário.

2. Preparação do doador

1. Anestesiar o rato doador com pentobarbital (60 mg/kg, i.p). Use cortadores mecânicos atrauáticos para remover os cabelos na região abdominal.
2. Coloque o mouse na posição supina na plataforma de operação. Cubra o mouse com gaze estéril.
3. Use um aplicador de ponta de algodão estéril para limpar a área cirúrgica com antisséptico de iodo seguido de 70% de etanol.
4. Faça uma incisão abdominal midline com uma tesoura oftálmica e exponha a cavidade abdominal.
5. Use micro fórceps curvos para expor a veia cava inferior, e então injete por via intravenosa 200 μL de 100 U/mL 0-4 °C salina heparinizada por 20 g de peso corporal através da cava vena inferior.
6. Faça toracotomia com tesoura oftálmica, corte as costelas através das incisões bilaterais da linha midaxillary, vire a parede do peito anterior para fora para expor a cavidade torácica.
7. Extirpe o timo com micro fórceps curvos.
8. Exponha a aorta e, em seguida, perfunda 200 μL de 100 U/mL 0-4 °C salina heparinizada até a artéria coronária através do arco aórtico.
   NOTA: Evite perfundar quaisquer bolhas de gás no coração do doador.
9. Use uma micro tesoura para transectar a aorta ascendente no início do arco aórtico.
10. Transecte a artéria pulmonar no início dos dois ramos principais com uma micro tesoura.
11. Liga a veia cava superior e a veia cava inferior proximally usando uma sutura de seda 6-0 e use uma micro tesoura para transectar a veia distally para a ligadura.
12. Ligate as veias pulmonares juntas, circunferencialmente, usando uma única sutura de seda 6-0, e corte os ramos da veia distally à ligadura usando uma micro tesoura.
13. Remover o enxerto cardíaco dos tecidos moles circundantes; preservá-lo em salina heparinizada de 0-4 °C.

3. Implantação cardíaca

1. Coloque o coração doador de cabeça para baixo na região do pescoço direito do receptor.
2. Insira a artéria pulmonar do coração doador para um laço de seda 6-0 com micro fórceps retos.
3. Enrole o lúmen do vaso ao redor do manguito da veia e, em seguida, aperte os laços de sutura de seda 6-0 ao redor da braçadeira para a banda da junta do vaso.
4. Realize a anastomose da aorta do enxerto e da braçadeira da artéria seguindo as etapas descritas na etapa 3.2.
5. Solte a veia jugular fixa seguida da artéria jugular fixada. Mantenha a articulação do vaso sem fiação e certifique-se de que o fluxo sanguíneo está desobstruído.
   NOTA: O ritmo sinusal voltando a mais de 200 vezes dentro de 1 min é considerado normal.
6. Umedeça o coração doador usando soro fisiológico quente (37 °C) e inspecione se o enxerto está sangrando. Coloque o enxerto cardíaco pulsante no espaço subcutâneo e, em seguida, sutura a incisão.

4. Avaliação de Cuidados Pós-Operatórios e Enxertos

1. Regisse o tempo para o ritmo sinusal normal e a preservação do ritmo sinusal normal por pelo menos 5 minutos após a liberação do grampo para monitorar a função de enxerto pós-operatório.
2. Coloque o destinatário sozinho em um cobertor quente até que o destinatário acorde da anestesia. Administrar analgesia de buprenorfina, 0,05 mg/kg, s.c, no final da cirurgia e a cada 12 horas durante 72 horas após a cirurgia.
3. Regisso o estado de recuperação do peso e pós-operatório do destinatário diariamente. No caso de perda de peso de >15% em relação à data da cirurgia, paralisia hemplégica ou infecção, eutanize o receptor via inalação terminal isoflurane²¹.
4. Monitore a sobrevivência do enxerto por palpação diariamente. A cirurgia é considerada bem sucedida se o alusão murina sobreviver por >72 horas. Classificar a função do enxerto, conforme relatado anteriormente²²: Escala 3 - pulsar vigorosamente e frequência; Escala 2 - menos pulsar; Escala 1- fibrilação e rejeição iminente; ou Escala - 0, perda de batimento cardíaco e rejeição completa.

Resultados

Tempo de operação cirúrgica

Após o treinamento, um cirurgião qualificado pode realizar a operação com sucesso dentro de 35 minutos usando a técnica do tubo interno, onde aproximadamente 15,5 minutos são necessários para a preparação do receptor, 10,9 minutos são necessários para a preparação do doador e 4,4 minutos são necessários para anastomoses cardíacos doadores. O tempo de isquemia fria e quente (da preparação do doador à implantação do coração) é reduzido para 15,3 minut...

Discussão

Modelos de transplante de coração de rato são ferramentas importantes para a pesquisa em imunologia de transplante, pois ferramentas e materiais para avaliar os mecanismos imunológicos deste modelo e um grande número de camundongos modificados por genes estão disponíveis. No entanto, desafios técnicos microcirúrgicos, como sutura e eversão de vasos, limitaram seu uso generalizado. No presente estudo, investigamos certos desafios técnicos fundamentais do transplante de coração murino e obtivemos bons resultados. Um passo ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Balonete de artéria	de fabricação		. diâmetro: 0,55 mm, comprimento: 1,0 mm
Tubo interno de artéria	Tubo de		. Diâmetro: 0,28 mm
Micro pinça curva	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA3050	1/8 arco, ponta de 0,3 mm sem gancho
Porta-agulhas Shanghai	Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments	Factory WA2050	ponta de 0,2 mm
Micro tesoura Shanghai	Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Fábrica	de Instrumentos CirúrgicosWA1050	Reto, comprimento da lâmina: 10 mm
Micro pinça reta	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA3060	Ponta de 0,15 mm sem gancho
Grampos Scanlan Vascu-Statt Bulldog	Scanlan International Inc	1001-531	Pressão de aperto 20– 25 gramas
Manguito de veia	Tubo de poliamida feito por		. diâmetro: 0,9 mm, comprimento: 1,2 mm
Tubo interno de veia Tubo de	feito por		. Diâmetro: 0,6 mm

Tubo de poliamida própria poliamida de fabricação própria si poliamida si