Summary
Aquí se presenta un protocolo que describe el monitoreo del ciclo de vida completo de la bacteria depredadora Bdellovibrio bacteriovorus usando microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo en combinación con una almohadilla de agarosa y platos de imágenes celulares.
Abstract
La bacteria Bdellovibrio es una pequeña bacteria depredadora gramnegativa que mata otras bacterias gramnegativas, incluidos los patógenos dañinos. Por lo tanto, se considera un antibiótico vivo. Para aplicar B. bacteriovorus como un antibiótico vivo, primero es necesario entender las principales etapas de su complejo ciclo de vida, particularmente su proliferación dentro de sus presas. Hasta ahora, ha sido un reto monitorear las sucesivas etapas del ciclo de vida depredador en tiempo real. Aquí se presenta un protocolo integral para la imagen en tiempo real del ciclo de vida completo de B. bacteriovorus,especialmente durante su crecimiento dentro del huésped. Para este propósito, se utiliza un sistema que consiste en una almohadilla de agarosa en combinación con platos de imágenes celulares, en el que las células depredadoras pueden moverse libremente debajo de la almohadilla de agarosa, mientras que las células de presa inmovilizadas son capaces de formar bdelloplasts. La aplicación de una cepa que produce una subunidad de ADN polimerasa III con etiquetas fluorescentes permite además controlar la replicación cromosómica durante la fase de reproducción del ciclo de vida de B. bacteriovorus.
Introduction
Bdellovibrio bacteriovorus es una bacteria pequeña (0,3-0,5 m por 0,5-1,4 m) gramnegativa que se aprovecha de otras bacterias gramnegativas, incluidos patógenos nocivos como Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa y Shigella flexneri1,,2,,3. Dado que B. bacteriovorus mata patógenos, se considera un antibiótico vivo potencial que se puede aplicar para combatir las infecciones bacterianas, particularmente las causadas por cepas multirresistentes.
B. bacteriovorus presenta un ciclo de vida peculiar que consiste en dos fases: una fase de ataque no replicativo de vida libre y una fase reproductiva intracelular(Figura 1). En la fase de vida libre, esta bacteria altamente móvil, que se mueve a velocidades de hasta 160 m/s, busca a su presa. Después de adherirse a la membrana externa de la presa, entra en el periplasma4,5. Durante la fase reproductiva interperiplasmática, B. bacteriovorus utiliza una plétora de enzimas hidrolíticas para degradar las macromoléculas del huésped y reutilizarlas para su propio crecimiento. Poco después de invadir el periplasma, la célula huésped muere y se hincha en una estructura esférica llamada bdelloplast, dentro de la cual la célula depredadora se alarga y replica sus cromosomas. El proceso de replicación comienza en el origen de replicación (oriC)6 y continúa hasta que varias copias del cromosoma se han sintetizado completamente7. Curiosamente, la replicación de cada cromosoma no es seguida por la división celular. En su lugar, el depredador se alarga para formar una célula larga, multinucleoide y filamentosa. Tras el agotamiento de nutrientes, el filamento se somete a septación síncrona y las células progenie se liberan del bdelloplast8.
Antes de B. bacteriovorus puede ser utilizado como un antibiótico vivo contra las infecciones bacterianas, es crucial entender las principales etapas de su ciclo de vida, particularmente las relacionadas con su proliferación dentro de la presa. La imagen de células vivas de B. bacteriovorus ha sido un desafío, debido a las diversas formas morfológicas del depredador y su presa durante el complejo ciclo de vida. Hasta ahora, las interacciones entre B. bacteriovorus y su célula huésped han sido estudiadas principalmente por microscopía electrónica y análisis de disparo a presión2,9,10, ambos de los cuales tienen limitaciones, especialmente cuando se utilizan para monitorear etapas sucesivas del ciclo de vida depredador. Estos métodos proporcionan imágenes de alta resolución de células B. bacteriovorus y permiten la observación de un pequeño depredador durante la fase de ataque o crecimiento. Sin embargo, no permiten el seguimiento de células B. bacteriovorus solas a lo largo de ambas fases del ciclo de vida.
Aquí se presenta un protocolo completo para el uso de microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo (TLFM) para monitorear el ciclo de vida completo de B. bacteriovorus. Un sistema que consiste en una almohadilla de agarosa se utiliza en combinación con una placa de imagen celular, en la que las células depredadoras pueden moverse libremente debajo de la almohadilla de agarosa, mientras que las células de presa inmovilizadas son capaces de formar bdelloplasts (Figura 2). Esta configuración se prepara sobre la base de cepas específicas de E. coli y B. bacteriovorus,pero el protocolo puede ser fácilmente alterado para adaptarse a las cepas individuales de un usuario (por ejemplo, llevando diferentes marcadores de selección, proteínas fusionadas con diferentes fluoróforos, etc.).
En este caso, para visualizar B. bacteriovorus durante la fase de ataque, se construyó una cepa específica (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) que expresa una versión etiquetada fluorescentemente de la proteína citoplasma, PilZ (disponible en nuestro laboratorio bajo petición)7. Esta cepa produce además DnaN (la abrazadera deslizante, una subunidad de holoenzima DNA polimerasa III, fusionada con una proteína fluorescente. Esto permite que la replicación continua del ADN sea monitoreada dentro de las células depredadoras a medida que crecen dentro de los bdelloplasts.
Aunque el protocolo y el software descritos utilizados para la adquisición de imágenes se refieren a un microscopio invertido proporcionado por un fabricante específico (ver Tabla de materiales),esta técnica puede ajustarse para cualquier microscopio invertido equipado con una cámara ambiental u otro soporte de calefacción externo y capaz de obtener imágenes de lapso de tiempo. Para el análisis de datos, los usuarios pueden elegir cualquier software disponible compatible con los formatos de salida individuales.
Figura 1: B. ciclo de vida de bacteriovorus en E. coli como célula huésped. Durante la fase de ataque, una célula de B. bacteriovorus de natación libre busca y se une a una célula de E. coli huésped. Después de la invasión, la célula depredadora se localiza en el periplasma de la presa, cambiando la forma de la célula huésped y formando un bdelloplast. La fase reproductiva comienza con la formación de bdelloplast. La célula depredadora digiere la célula de presa y reutiliza compuestos simples para construir sus propias estructuras. B. bacteriovorus crece como un filamento único largo dentro del periplasma del huésped. Cuando se agotan los recursos de la célula de presa, el filamento B. bacteriovorus se septúa sincrónicamente y forma células progenie. Después de que las células progenie desarrollan su flagelo, lisan el bdelloplast. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
1. Preparación de B. bacteriovorus lysate para análisis microscópico
- En un matraz de 250 ml, configure la cocultura combinando 1 ml de cultivo fresco de 24 h B. bacteriovorus (por ejemplo, HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) y 3 ml de cultivo de presas durante la noche (por ejemplo, E. coli S17-1 pZMR100) con 50 mL de tampón Ca-HEPES (25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 [pH a 7,6]) complementado con antibióticos cuando sea necesario (aquí, 50 g/ml de kanamicina).
- Incubar la cocultura durante 24 h a 30oC con agitación a 200 rpm.
- Compruebe que las células de presa estén completamente alicentes mediante microscopía de contraste de fase montada en líquido. En este punto, numerosas células de ataque móvil B. bacteriovorus deben estar presentes, y no debe ser visible ninguna célula de E. coli o bdelloplast.
- Filtrar el cultivo de la bacteria B. a través de un filtro de tamaño de poro de 0,45 m para eliminar las células huésped restantes. Las células depredadoras (0,3–0,5 m x 0,5–1,4 m) penetran libremente los poros de 0,45 m, mientras que las células huésped se conservan en la superficie del filtro.
- Gire hacia abajo el filtrado durante 20 min a 2469 x g y 30oC en un tubo cónico de 50 ml para recoger células depredadoras. Resuspender el Pletón B. bacteriovorus en 3 ml de tampón de Ca-HEPES (a un OD final600 de aproximadamente 0,2) e incubar a 30 oC y 200 rpm durante 30 min.
2. Preparación de células huésped para B. bacteriovorus invasión
- Utilice una sola colonia de la cepa huésped ( se recomiendaE. coli S17-1 pZMR100 debido a varios tamaños de células que resultan en la formación de belloplastos de tamaño desigual) para inocular 10 ml de medio YT (0,8% Bacto triptona, 0.5% Extracto de levadura, 0.5% NaCl [pH - 7.5]) que se ha complementado con antibióticos, si es necesario (aquí, 50 g/ml de kanamicina). Células de cultivo durante la noche a 37oC y 180 rpm.
- Transfiera 2 ml de cultivo de E. coli durante la noche (OD600 de 3,0) a un tubo de ensayo de 2 ml y centrífuga a temperatura ambiente (RT) y 2469 x g durante 5 min. Resuspender el pellet en 200 l de tampón Ca-HEPES.
3. Configuración del microscopio (ver Tabla de Materiales)
- Precalcar una cámara microscópica con un objetivo de inmersión de aceite de 100x a 30 oC durante al menos 1 h antes de su uso. Este paso es necesario para evitar errores en el mantenimiento del foco durante el experimento.
- Encienda el microscopio y la automatización de la microscopía. Inicializar el software de control y seleccionar los filtros adecuados para adquirir imágenes de campo brillante/DIC/contraste de fase y fluorescencia, según sea necesario (aquí: imágenes BF, filtro policromático GFP/mCherry y emisión/excitación para mCherry y GFP).
4. Montaje de diseños para microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo
- Mezclar 200 mg de agarosa de bajo grado molecular fluorescente con 20 ml de tampón Ca-HEPES (1% concentración final de agarosa) y disolver la agarosa en un microondas. El lote se puede reutilizar varias veces después de que se solidifique, así que simplemente repita el paso de calentamiento.
- Vierta 3 ml de agarosa fundida en un plato de 35 mm con fondo de cristal(Tabla de Materiales). Permita que la agarosa se solidifique.
- Con una microespátula de laboratorio, retire cuidadosamente la almohadilla de agarosa del plato de 35 mm sin alterar el polo central de la almohadilla de agarosa. Voltee la almohadilla hacia abajo hacia arriba y colóquela en una cubierta de plato de Petri(Figura 2).
- Coloque 5 l de suspensión concentrada de E. coli en la parte superior de la almohadilla volteada y extienda las células en el polo central usando un bucle de inoculación. Añadir 5 l de suspensión concentrada de B. bacteriovorus (OD600 de 0,2) sobre la superficie recubierta de E. coli. No extienda las células.
- Devuelva rápidamente el gel de agarosa a la placa de 35 mm con fondo de cristal (parte superior hacia abajo), luego cúbralo con una tapa. Si es necesario, retire las burbujas de aire presionando suavemente el agar contra la placa.
Figura 2: Representación esquemática del flujo de trabajo experimental. La almohadilla de agarosa se retira de la placa de 35 mm y se voltea de modo que la parte inferior mira hacia arriba. Las suspensiones frescas de las células depredadoras y el cultivo nocturno de las células de presa se colocan en la almohadilla volteada para recubrir el lado "inferior". La almohadilla de agarosa se voltea a su orientación original y se coloca de nuevo en el plato de 35 mm, que se monta en la etapa del microscopio invertido en la cámara del microscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Conducción de la microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo
- Coloque el plato de 35 mm en el porta platos Petri de tal manera que no se mueva durante el transcurso del experimento. Coloque una gota de aceite de inmersión (índice de refracción 1.518) en el objetivo, así como en la parte inferior del plato de 35 mm.
- Monte el soporte en la etapa del microscopio invertido en la cámara del microscopio.
- Configure las opciones en el software de control del microscopio para recopilar varias imágenes en varias posiciones de etapa a lo largo del tiempo.
- Ajuste el aumento (100x) y la lente policromada (GFP/mCherry). Usando una pieza de ojo y un campo brillante (BF), busque el plano focal y abra el administrador de lista de puntos.
- Seleccione al menos 10 posiciones de interés moviendo la etapa y almacenando las coordenadas para cada posición en el software del microscopio haciendo clic en el botón Marcar punto. Evite las posiciones situadas cerca unas de otras para evitar el fotoblanse y la fototoxicidad. Gire la válvula de la cámara del ocular al monitor y calibre cada punto ajustando el plano focal y haciendo clic en el botón Reemplazar punto del gestor de listas de puntos.
- Abra el diseñador de experimentos y establezca todos los parámetros experimentales en cada pestaña de la siguiente manera:
- Desmarque el cuadro de apilamiento Z.
- Elija canales fluorescentes y establezca los ajustes de iluminación óptimos. Aquí se utilizaron los siguientes ajustes: para el canal mCherry, conjuntos de filtros mCherry (EX575/25; EM625/45), intensidad del 50% y tiempo de exposición de 200 ms; para el canal GFP, conjunto de filtros GFP (EX475/28; EM525/48), intensidad del 50% y 80 ms; y para las imágenes BF, canal POL, intensidad del 5% y 50 ms.
- Seleccione intervalos entre la adquisición de imágenes y el tiempo total del experimento. Aquí, se realizaron intervalos de 5 minutos durante el período de 10 h del experimento.
- Habilite el mantenimiento del enfoque para las posiciones elegidas (para el sistema utilizado aquí, marcando la casilla mantener el foco con UltimateFocus).
- Seleccione la carpeta de datos en la que se deben guardar automáticamente los archivos de imagen.
- Vuelva a comprobar todos los ajustes en el control del software del microscopio y, a continuación, inicie el experimento de lapso de tiempo.
- Después de la primera hora del experimento, compruebe que todas las posiciones de la etapa siguen enfocadas. Ajuste el enfoque durante los intervalos de tiempo entre la adquisición de imágenes, si es necesario.
- Cuando termine el experimento de lapso de tiempo, retire la placa Petri y utilice el plato de 35 mm con una almohadilla de agarosa de acuerdo con el protocolo de bioseguridad.
NOTA: Todos los subpasos posteriores al paso 5.2 son específicos para los usuarios de DeltaVision Elite. Los investigadores que utilizan otros sistemas necesitan ajustar la configuración de acuerdo con sistemas individuales.
6. Procesamiento de imágenes de lapso de tiempo y generación de películas utilizando el software Fiji
- Transfiera datos experimentales a un ordenador cargado con el software Fiji. Inicie el programa de Fiji y abra una imagen con Archivo . Abra o simplemente arrastrando y soltando el archivo de imagen en Fiji.
- En Opciones de importación de biotelejas, elija Ver pila con Hyperstack en las opciones de visualización de la pila, Haga clic en el modo de color compuesto en las opciones de color y marque Escala automática.
- Al desplazarse por las pilas de imágenes, evalúe si las celdas y los bdelloplasts permanecieron enfocados en el transcurso del experimento. Compruebe si las manchas fluorescentes verdes de DnaN-mNeonGreen están presentes dentro de las células de B. bacteriovorus dentro de los bdelloplastos a lo largo de la fase de crecimiento, y asegúrese de que se puedan visualizar todas las etapas del ciclo de vida depredador.
- Para analizar un B. bacteriovorus cell/bdelloplast en particular, márquelo utilizando las herramientas de selección del menú de Fiji (Rectángulo, Oval , Polígono o Mano alzada). Duplicar la región elegida con Imagen de imagen Duplicar o mediante Ctrl + Mayús + D.
- Ajuste el brillo y el contraste para cada canal de fluorescencia de la siguiente manera:
- Para elegir un solo canal, abra las herramientas de canal haciendo clic en Imagen . Color ? Canaliza herramientas o Ctrl + Mayús + Z, y seleccione el canal de interés (Canal 1: mCherry, Canal 2: mNeonGreen, Canal 3: brightfield).
- Ajuste el brillo y el contraste de las imágenes en el canal de fluorescencia abriendo el menú B&C en Imagen . Ajustar ? Brillo/Contraste o haciendo clic en Ctrl + Mayús + C.
- Añadir barra de escala usando Analizar . Herramientas ? Barra de escala. Agregue la marca de tiempo a las imágenes haciendo clic en Imágenes . Pilas ? Time Stamper.
- Para guardar las imágenes modificadas, vaya a Archivo . Guardar como y elija TIFF para guardar como una secuencia de imágenes, AVI para producir una película o PNG para guardar una sola imagen del fotograma actual.
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Representative Results
El sistema descrito basado en TLFM permite que las células individuales de B. bacteriovorus sean rastreadas a tiempo (Figura 3, Película 1) y proporciona información valiosa sobre cada etapa del complejo ciclo de vida depredador. La fusión PilZ-mCherry permite etiquetar toda la célula depredadora en la fase de ataque, así como en la fase temprana de la fase de crecimiento (Figura 3). La transición del ataque a la fase replicativa fue visualizada no sólo por la formación de bdelloplast anfitrión, sino también por la aparición del replisoma (maquinaria de replicación), que estuvo marcado por los focos fluorescentes DnaN-mNeonGreen (Figura 3).
Como se ha demostrado anteriormente, el replisome se ensambló en el polo celular invasor (pili-pole)7, y se observó más de un replisome dentro de un filamento B. bacteriovorus en crecimiento a medida que avanzaba la fase de reproducción (Figura 3). Después de que se sintetizaron varias copias del cromosoma, la replicación fue terminada (visualizada como la desaparición de los focos DnaN-mNeonGreen). Finalmente, el filamento multinucleoides se sometió a septación, y las células progenie fueron liberadas del bdelloplast (Figura 3).
El protocolo presentado que describe el procesamiento de imágenes utilizando el software Fiji proporciona una explicación paso a paso de cómo producir una película para su publicación a partir de la serie de lapso de tiempo adquirida (Película 1).
Figura 3: Ciclo de vida de B. bacteriovorus seguido de microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo. (A) Células depredadoras de vida libre (B. bacteriovorus DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) y células anfitrionas (E. coli). (B) Apego de B. bacteriovorus a E. coli. (C) Formación Bdelloplast. (D,E) Crecimiento filamentoso y replicación cromosómica. (F) Terminación de la replicación cromosómica. (G) Inicio de la septación síncrona del filamento. (H) La lysis del bdelloplast y la liberación de células progenie. Los paneles superiores muestran imágenes de campo brillante, los paneles inferiores representan canales de campo brillante y fluorescencia combinados. Barra de escala de 1 m, tiempo, hh:min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1: Imágenes de lapso de tiempo del ciclo de vida de B. bacteriovorus en E. coli como célula huésped. Localización subcelular de DnaN-mNeonGreen (verde) en cepa HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry. El canal rojo indica el etiquetado de las células depredadoras con PilZ-mCherry citoplasmático. El gris indica campo brillante. Las imágenes se recogieron cada 5 min. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Debido al mayor interés en el uso de B. bacteriovorus como un antibiótico vivo, se necesitan nuevas herramientas para observar el ciclo de vida depredador, particularmente las interacciones depredador-patógeno, se necesitan. El protocolo presentado se utiliza para realizar un seguimiento de todo el ciclo de vida de B. bacteriovorus, especialmente durante su crecimiento dentro del huésped, en tiempo real. Además, la aplicación de una cepa que produce una abrazadera beta etiquetada fluorescentemente de la holoenzima DNA polimerasa III permitió el monitoreo de la progresión de la replicación cromosómica a lo largo de la fase de reproducción de B. bacteriovorus.
Un paso crítico en este método es la preparación adecuada de los diseños en el plato de 35 mm. Un desafío en la observación del ciclo de vida de B. bacteriovorus bajo el microscopio es establecer condiciones que apoyen el crecimiento depredador (que involucra otras células bacterianas gramnegativas como células huésped) y proporcionan la motilidad celular depredadora. Uno de los aspectos cruciales de las observaciones microscópicas efectivas es la necesidad de una distribución uniforme de las presas en la almohadilla de agarosa, que se logra mediante la propagación de las células con un bucle inoculante. La densidad de la célula huésped no puede ser demasiado alta, y los puntos de observación elegidos deben contener un número suficiente de celdas host separadas. Mientras tanto, las células de Bdellovibrio deben ser lo suficientemente móviles como para buscar activamente a sus presas. Por lo tanto, no deben extenderse ni secarse al aire antes de que la almohadilla se voltea hacia atrás y se coloca en el plato. A veces se necesitan mayores volúmenes de suspensión de depredadores para proporcionar suficiente motilidad en una fina capa de líquido entre la agarosa y la superficie de vidrio.
Aquí se utiliza un plato de la ins: sin embargo, esto no es esencial para el protocolo. Cualquier plato de fondo de cristal podría ser utilizado. Una ventaja de la "Dish" es la altura y el volumen óptimos del camino de la agarosa, lo que permite colocar la cocultura de depredador y anfitrión en la parte inferior de la almohadilla de agarosa. También es importante utilizar células frescas de B. bacteriovorus en los experimentos, ya que las células pierden su motilidad durante el almacenamiento prolongado. Una limitación de este protocolo es que, en el único campo de visión, los usuarios pueden contar aproximadamente 100 células depredadoras y 100 células huésped, pero el MOI se puede estimar en un 50%-60%.
El conocimiento actual sobre el ciclo celular de Bdellovibrio se basa en gran medida en estudios que han empleado E. coli o P. aeruginosa. Este sistema permite el monitoreo de B. bacteriovorus presas de una variedad de patógenos bacterianos, incluyendo Salmonella spp., S. flexneri, Proteus mirabilis, o K. pneumoniae. Además, esta plataforma puede ser útil en experimentos con patógenos multirresistentes. Por lo tanto, puede ayudar a facilitar las mejoras en la ingeniería genética de B. bacteriovorus como un antibiótico vivo en la medicina humana y veterinaria, particularmente para combatir los patógenos multirresistentes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la subvención Opus 2018/29/B/NZ6/00539 al Centro Nacional de Ciencias a J.Z.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | Rotor ref. 12183 |
| CertifiedMolecular Biology Agarose | BIO-RAD | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
| Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | Open source image processing package |
| Glass Bottom Dish 35 mm | ibidi | 81218-200 | uncoated glass |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart Filter 0.45 µm | Sartorius | 16555----------K | Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet |
| Start SoftWoRx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
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