Método de alta duração para medir o tempo de sedação de álcool de melanogaster individual drosophila

Resumo

Os métodos atuais para medir a sensibilidade ao álcool em Drosophila são projetados para testar grupos de moscas. Apresentamos um ensaio simples, de baixo custo e de alto custo para avaliar a sensibilidade à sedação de álcool em um grande número de moscas simples. O método não requer ferramentas especializadas e pode ser realizado em qualquer laboratório utilizando materiais comuns.

Resumo

Drosophila melanogaster fornece um excelente modelo para estudar os fundamentos genéticos da sensibilidade ao álcool. Em contraste com estudos em populações humanas, o modelo de Drosophila permite um controle rigoroso sobre o fundo genético, e um número praticamente ilimitado de indivíduos do mesmo genótipo pode ser criado rapidamente sob condições ambientais bem controladas sem restrições regulatórias e a um custo relativamente baixo. As moscas expostas ao etanol sofrem alterações fisiológicas e comportamentais que se assemelham à intoxicação por álcool humano, incluindo perda de controle postural, sedação e desenvolvimento de tolerância. Aqui, descrevemos um ensaio simples, de baixo custo e de alto risco para avaliar a sensibilidade à sedação de álcool em um grande número de moscas simples. O ensaio é baseado na gravação em vídeo de moscas simples introduzidas sem anestesia em placas de cultura celular de 24 poços em uma configuração que permite a iniciação síncrona da exposição ao álcool. O sistema permite que uma única pessoa colete dados individuais de sedação de etanol em até 2.000 moscas dentro de um período de trabalho de 8h. O ensaio pode, em princípio, ser estendido para avaliar os efeitos da exposição a qualquer substância volátil e aplicado para medir efeitos da toxicidade aguda de voláteis em outros insetos, incluindo outras espécies de moscas.

Introdução

O Instituto Nacional de Abuso de Álcool e Alcoolismo relata que, em 2015, o consumo excessivo de álcool, designado como "transtorno do uso de álcool", afetou cerca de 16 milhões de pessoas nos Estados Unidos. O abuso de álcool causa uma ampla gama de efeitos fisiológicos adversos e é uma das principais causas de morte nos EUA. Em humanos, a diminuição da sensibilidade, ou um baixo nível de resposta ao álcool, tem um forte componente genético e está associada a um maior risco de desenvolver distúrbios do uso de álcool^1,2,3,4. Estudos de risco genético em populações humanas são desafiadores devido à mistura populacional, histórias de desenvolvimento diversas e exposições ambientais, e dependência de questionários autorreferidos para quantificar fenótipos relacionados ao álcool, que muitas vezes são confundidos com outras condições neuropsiquiátricas.

Drosophila melanogaster fornece um excelente modelo para estudar os fundamentos genéticos da sensibilidade ao álcool^5,6,7,8. O modelo de Drosophila permite um controle rigoroso sobre o fundo genético, e um número praticamente ilimitado de indivíduos do mesmo genótipo pode ser criado rapidamente sob condições ambientais bem controladas sem restrições regulatórias e a um custo relativamente baixo. Além das mutações disponíveis publicamente e das linhas RNAi que visam a maioria dos genes no genoma, a disponibilidade do Painel de Referência Genética Drosophila melanogaster (DGRP), uma população de 205 linhas derivadas de sangue selvagem com seqüências completas de genoma, possibilitou estudos de associação genoma^9,10. Tais estudos identificaram redes genéticas associadas aos efeitos no tempo de desenvolvimento e viabilidade na exposição ao desenvolvimento do etanol^11,12. A conservação evolutiva dos processos biológicos fundamentais permite que inferências translacionais sejam desenhadas sobrepondo ortologs humanos em suas contrapartes de moscas.

As moscas expostas ao etanol sofrem alterações fisiológicas e comportamentais que se assemelham à intoxicação por álcool humano, incluindo perda do controle postural⁸, sedação e desenvolvimento da tolerância^13,14,15. A sedação induzida pelo álcool em Drosophila pode ser quantificada usando inebriômetros. Estas são colunas de vidro verticais de 122 cm de comprimento com divisórias de malha inclinadas às quais as moscas podem anexar^16,,17,,18. Um grupo de pelo menos 50 moscas (sexos podem ser analisados separadamente) são introduzidos na parte superior da coluna e expostos a vapores de etanol. Moscas que perdem o controle postural caem através da coluna e são coletadas em intervalos de 1 min. O tempo médio de elução serve como medida de sensibilidade à intoxicação alcoólica. Quando as moscas são expostas ao álcool uma segunda vez após a recuperação da primeira exposição, elas podem desenvolver tolerância, como evidente a partir de uma mudança no tempo médio de elusão^13,15,19,20. Considerando que os ensaios do inebriômetro levaram à identificação de genes, redes genéticas e vias celulares associadas à sensibilidade à sedação de álcool e ao desenvolvimento da tolerância^12,,13,14,21, o ensaio é demorado, de baixa produtividade e ineficaz para medir a sensibilidade ao álcool em moscas únicas.

Ensaios alternativos de sedação de etanol que não requerem a configuração elaborada do inebriômetro permitem medidas mais convenientes, mas ainda são limitados em throughput e geralmente requerem análises de grupos de moscas em vez de indivíduos^{21,22,23,24,25}. Avaliar moscas simples minimiza o potencial de confundir efeitos devido a interações em grupo, como as decorrentes de comportamentos sociais. Aqui, apresentamos um ensaio simples, de baixo custo e de alto nível para avaliar a sensibilidade à sedação de álcool em um grande número de moscas simples.

Protocolo

1. Construção do aparelho de teste

1. Crie um modelo de papelão do tamanho de uma placa de cultura de célulade 24 poços, traçando em torno da placa em papelão e cortando a área designada.
2. Corte um pedaço de tela de inseto pequeno do tamanho da placa de cultura celular usando o modelo de papelão do passo 1.1.
3. Prepare uma placa de cultura de célula de 24 poços colocando uma pequena linha de cola quente ao redor do perímetro da parte superior da placa usando uma pistola de cola quente e afixando a malha de tela em cima dos poços abertos.
4. Segure uma vara artesanal de madeira em cada um dos três lados da mesma placa de cultura celular do passo 1.3 usando uma pistola de cola quente. A placa de cultura de célula modificada deve agora se assemelhar ao diagrama da placa mostrado na Figura 1A e a configuração experimental mostrada na Figura 2.
   NOTA: Prepare pelo menos quantas placas de cultura celular cabernas câmaras de filmagem (veja abaixo).

Figura 1: Diagrama do aparelho de teste e da câmara de filmagem. (A)Diagramas Superiores. As vistas superior, lateral e frontal do aparelho de teste são mostradas, respectivamente. Uma tela de malha fica plana em cima de uma placa de cultura de célula de 24 poços. Os bastões artesanais de madeira, representados pelas pontas de flecha, são anexados a três lados adjacentes para auxílio de estabilidade e alinhamento, dois na lateral da placa do poço com seis poços e um na lateral da placa com quatro poços. Todos os acessórios estão quentes colados no aparelho. (B)Diagramas inferiores. As vistas superior, lateral e frontal da configuração do ensaio são mostradas, respectivamente. Uma fenda é cortada no lado direito da caixa, desde a abertura para a tampa até a parte de trás da abertura, com a parte inferior do nível de fenda até a superfície interna. O orifício na parte superior da caixa, a superfície paralela ao solo, está centrado para exposição máxima de vídeo. A caixa sombreada representa a câmera de vídeo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fotografia do sistema de ensaios. A câmera de vídeo é colocada em cima da câmara de poliestireno, com a lente inserida no orifício de recorte, ilustrada nos diagramas da Figura 1B. Dois conjuntos de placas de cultura celular modificadas de 24 poços repousam sobre uma almofada de iluminação que é inserida em uma fenda através da lateral da câmara. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Construção da câmara de filmagem

1. Crie uma câmara de filmagem cortando um buraco do tamanho da lente da câmera de vídeo na lateral de uma caixa de poliestireno. Corte uma fenda adicional da largura da almofada de iluminação no lado oposto da caixa de poliestireno. A câmara de filmagem deve se assemelhar à câmara de filmagem mostrada na Figura 1B e figura 2.
2. Prepare a câmara de filmagem para uso inserindo a almofada de iluminação na fenda e posicionando a câmera no orifício da lente acima da almofada de iluminação.
3. Coloque todos os materiais e realize todos os testes subseqüentes em um ambiente controlado, de preferência uma câmara comportamental com aproximadamente 30% de umidade, temperatura de 25 °C, fluxo de ar uniforme e níveis de ruído inferiores a 65 dB.

3. Preparação do aparelho de teste e moscas

1. Pipeta 1 mL de 100% etanol através da malha da tela em cada poço.
2. Seque a tela com um pedaço de pano de queijo.
3. Corte dois pedaços de pano de queijo as dimensões da placa de cultura celular usando o modelo de papelão criado na etapa 1.1. Coloque-os em cima da malha de tela seca da placa de cultura de célula modificada contendo etanol do passo 3.2.
4. Crie um pequeno pedaço de placa de corte de plástico fina e flexível, traçando em torno do modelo de papelão criado na etapa 1.1 como guia geral e expandindo a área traçada em 1-2 cm em um dos lados curtos. Corte a área traçada expandida da fina e flexível placa de corte de plástico. Após o corte, certifique-se de que o plástico ainda se encaixa entre as três varas artesanais de madeira no aparelho de teste, mas pendura uma extremidade por 1-2 cm.
5. (Opcional) Se um aspirador precisar ser criado, monte um aspirador como o mostrado na Figura 3 cortando primeiro uma ponta de pipeta P1000 ao meio. Insira a peça com um diâmetro maior em uma extremidade de um pedaço de tubo flexível de ~30 cm para servir como porta-voz.

Figura 3: Um aspirador de moscas no qual as moscas são coletadas com um bocal intercambiável ligado a tubos flexíveis e uma pipeta sorológica de furo largo com uma rolha de gaze de algodão. O operador pode aspirar uma única mosca na pipeta para transferência sem anestesia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. (Opcional) Para completar o conjunto aspirador, cubra a extremidade larga de um pedaço de pipeta sorológica de 10 cm com gaze para evitar que as moscas entrem na tubulação e insira a pipeta, gaze primeiro, na extremidade aberta da tubulação para servir como uma câmara de mosca. O aspirador deve se assemelhar ao mostrado na Figura 3.
7. Usando um aspirador(Figura 3, passos 3.5 e 3.6), aspirar uma mosca por poço em uma placa de cultura celular separada de 24 poços. Use o plástico flexível para cobrir quaisquer poços que contenham moscas aspiradas anteriormente. Registre a posição do poço e qualquer informação relevante de genótipo ou fenótipo de cada mosca.
8. Segure o plástico flexível nivelado com a parte superior da placa de cultura celular contendo as moscas para evitar sua fuga e inverter a placa na parte superior da placa de cultura de célula modificada com o etanol. A folha de plástico flexível deve estar apoiada em cima das folhas de pano de queijo. Alinhe a placa de cultura celular invertida contendo moscas usando as varas artesanais para garantir que cada poço com etanol se alinhe com cada poço contendo uma mosca.
9. A configuração experimental deve se assemelhar à Figura 2.

4. Testando as moscas

1. Certifique-se de que a almofada de iluminação esteja acesa com brilho total para o máximo contraste visual. Comece a gravar com a câmera de vídeo.
2. Para expor as moscas ao etanol, remova cuidadosamente o plástico entre a placa do poço e o aparelho de teste, tomando cuidado para não desalojar a toalha de queijo.
3. Termine a gravação de vídeo uma vez que todas as moscas perderam o controle postural. Uma vez que se suspeite que todas as moscas perderam o controle postural, toque firmemente no centro da placa para garantir que todas as moscas tenham perda completa do controle postural. Se houver movimento, continue a gravar. Continue a tocar periodicamente (a cada 1-2 min) até que não ocorra nenhum movimento.
4. (Opcional) Para recuperar rapidamente as moscas, remova apenas a placa superior do aparelho de teste, revelando moscas sedadas descansando sobre a toalha de queijo. Aspirar moscas individuais em recipientes escolhidos para recuperação.
5. Substitua o etanol nas placas de cultura celular modificadas por 1 mL de etanol fresco 100% a cada hora para controlar a evaporação e a umidificação do etanol e manter a exposição consistente ao etanol durante todo o ensaio. Seque a tela com pano de queijo.
6. Repita para quantas amostras desejarem.
   NOTA: Para maior produção, aspirar a próxima rodada de moscas em novas placas de cultura celular durante a gravação de vídeo. O protocolo pode ser pausado aqui, pois a gravação de vídeo pode ser revisada mais tarde.

5. Determinação do tempo de sedação de moscas

1. Gravar o tempo de sedação para cada indivíduo voar assistindo a gravação de vídeo. O tempo de sedação é definido como o momento em que uma mosca perde o controle postural completo e a capacidade locomotor. Recomenda-se assistir o filme ao contrário e registrar o tempo que a mosca começa a se mover para garantir a precisão.

Resultados

Duas placas microtiter de 24 poços poderiam gerar dados simultaneamente em 48 moscas individuais dentro de apenas 10 minutos. A Tabela 1 lista as medidas dos tempos de sedação de etanol para 48 moscas individuais, machos e fêmeas separadamente, de duas linhas DGRP com sensibilidades diferentes à exposição ao álcool no tempo de desenvolvimento e viabilidade¹³. As moscas de linha RAL_555 foram menos sensíveis que a linha RAL_177 (Figura 4, Tabela 2; p < 0,0001, ANOVA). Machos e fêmeas de RAL_177 não apresentaram efeito sexualmente dimórfico (Figura 4, Tabela 2; p > 0,1, ANOVA), enquanto as fêmeas de linha RAL_555 foram menos sensíveis à exposição ao etanol do que os machos ( Figura4, Tabela 2; p < 0,006, ANOVA). O grande número de moscas que podem ser medidas simultaneamente e a capacidade de medir sexos e diferentes linhas contemporaneamente podem aumentar a precisão reduzindo o erro devido à variação ambiental.

Um.	Tempo de sedação de etanol (s)						B.	Tempo de sedação de etanol (s)
	Fêmeas			Machos				Fêmeas			Machos
	414	365	477	423	568	309		937	742	622	460	331	498
	201	384	498	411	523	626		791	619	197	467	455	562
	228	364	333	440	403	267		504	744	513	570	582	506
	440	416	404	408	422	384		970	540	369	865	533	492
	888	283	285	322	369	287		595	550	606	392	544	345
	1079	519	315	393	376	284		418	709	553	308	477	388
	718	287	432	275	206	411		366	564	558	385	576	377
	598	337	398	279	631	372		437	692	578	460	511	412
	241	398	364	347	374	808		665	729	484	532	425	354
	229	423	534	386	396	628		312	576	305	334	531	506
	388	488	451	523	322	533		682	638	420	560	548	379
	252	529	375	427	330	540		1045	741	708	832	509	472
	674	401	303	401	307	311		394	675	381	477	449	784
	303	453	351	429	525	262		540	690	520	556	495	226
	258	483	302	389	562	319		356	615	336	454	524	590
	346	426	385	416	596	287		626	678	840	634	677	509

Tabela 1: Medições dos tempos de sedação de etanol (s) das linhas individuais de (A) DGRP RAL_177 e (B) RAL_555 para sexos separados (n = 48). Veja também tabela 2, Figura 4.

Figura 4: Tempos de sedação de álcool das linhas DGRP RAL_177 e RAL_555. As barras representam meios e as barras de erro SEM (n = 48). Os tempos de sedação para moscas RAL_177 foram menores do que os das moscas RAL_55 (p < 0,0001, ANOVA). Os pontos de dados individuais são indicados na Tabela 1. Diferenças estatisticamente significativas adicionais entre sexos e linhas são indicadas no texto e na Tabela 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise	Fonte de Variação	Df	Ss	Valor F	Valor P
Modelo completo agrupado	Linha	1	769627	34.869	<0.0001
	Sexo	1	105001	4.757	0.0304
	Linha x Sexo	1	86021	3.897	0.0498
	Erro	188	4149491
Modelo reduzido de fêmeas	Linha	1	685126	23.58	<0.0001
	Erro	94	2730718
Modelo reduzido masculino	Linha	1	170522	11.3	0.0011
	Erro	94	1418774
Modelo RAL_177 reduzido	Sexo	1	473	0.023	0.8800
	Erro	94	1943741
Modelo reduzido RAL_555	Sexo	1	190549	8.12	0.0054
	Erro	94	2205751

Tabela 2: Análises de variância para tempo de sedação através do sexo e linha DGRP. O modelo utilizado foi Y = μ + L + S + LxS + ε, onde μ é a média geral, L é o efeito fixo da linha DGRP (RAL_177, RAL_555), S é o efeito fixo do sexo (masculino, feminino), LxS é o termo de interação (fixo), e ε é o termo de erro. Os modelos Y = μ + L + ε e Y = μ + S + ε foram utilizados para os modelos reduzidos. Linha, Sexo e o termo de interação Linha x Sexo foram todos significativos no modelo completo em α < 0,05. Modelos reduzidos por sexo e linha DGRP RAL_555 também foram significativos em α < 0,01. Veja também tabela 1, Figura 4. df = graus de liberdade, SS = Tipo I Soma de Quadrados.

Discussão

Aqui, apresentamos um método simples, barato e de alto nível para avaliar o tempo de sedação devido à exposição ao etanol em Drosophila melanogaster. Ao contrário de muitos métodos atuais, que exigem análises de grupo, este ensaio permite que uma única pessoa colete dados de tempo de sedação individual para ~2.000 moscas dentro de um período de trabalho de 8 h. Descobrimos que uma única pessoa pode marcar 48 moscas por tempo de sedação em cerca de 5 minutos. Nesse ritmo, 2.000 moscas podem ser pontuadas em aproximadamente 4h, embora a pontuação possa ser realizada mais tarde. Com nosso ensaio, o tempo de sedação registrado para a maioria das moscas varia de 5 a 15 min em uma exposição a 1 mL de 100% de etanol. Menores concentrações de etanol ou volumes de entrega menores resultarão em tempos de sedação mais longos.

Os métodos atuais para avaliar o tempo de sedação exigem testar um grande número de moscas sem habilitar medidas prontamente em indivíduos individuais^{15,,16,,17,,18,,19,,20,,21,22,,23,,24,,25,26}. Muitos ensaios atuais de sedação e sensibilidade dependem do ST50^22,23,24, o ponto de tempo em que 50% das moscas são sedadas como resultado da exposição ao etanol. Embora a obtenção do ST50 para grupos de moscas não tenha sido a principal motivação para o desenvolvimento desse ensaio, as gravações de vídeo demonstram maior utilidade em relação aos métodos atuais, pois as gravações podem ser usadas para verificar o ST50 para grupos de moscas testadas individualmente e medir a porcentagem de moscas que satisfazem um determinado critério (por exemplo, perda de controle postural) a qualquer momento. Deve-se notar que tais análises de vídeo exigiriam tempo adicional.

Ao contrário dos ensaios atuais do inebriômetro, o método que descrevemos não requer ferramentas especializadas para ser configurado e pode ser realizado em qualquer laboratório usando materiais comuns. Usando este método, obtivemos tempos de sedação confiáveis e consistentes para moscas individuais. O ensaio pode, em princípio, ser estendido para avaliar os efeitos da exposição a qualquer substância volátil. O ensaio também pode ser aplicado para medir efeitos da toxicidade aguda de voláteis em outros insetos, incluindo outras espécies de moscas. Os dados de tempo de sedação individual podem ser utilizados para avaliar a extensão da variação penotípica dentro de uma população, como o DGRP.

Usamos uma pequena tela de insetos para evitar o contato direto com a solução de etanol, permitindo que quantidades adequadas de vapores de etanol chegassem à mosca. A camada de pano de queijo branco no topo da malha da tela fornece contraste visual entre a mosca e a superfície abaixo e garante que as moscas não ficam presas na tela, o que poderia levar à determinação ambígua da perda de controle postural. As membranas comercialmente disponíveis que são porosas à água e ao ar deram resultados inconsistentes e foram insuficientemente penetráveis aos vapores de etanol. Nós usamos intencionalmente malha de tela de insetos pequenos porque é um material uniformemente poroso que minimiza a variação na exposição ao etanol como resultado da posição de mosca dentro de um poço. Modificações podem ser feitas neste protocolo com base em materiais disponíveis, embora recomendamos uma câmara comportamental controlada, acesso a 90%-100% etanol perto da mosca, e exposição uniforme ao etanol.

A posição de vôo dentro das placas de cultura celular deve ser aleatória entre as réplicas para evitar viés posicional. Para experimentos maiores que requerem o uso deste ensaio ao longo de vários dias e, portanto, estão sujeitos a variações ambientais que podem influenciar os resultados do ensaio (por exemplo, mudanças na pressão barométrica)²⁷, recomendamos fortemente que as moscas sejam testadas ao mesmo tempo todos os dias e randomizadas dentro e ao longo dos dias, especialmente se diferentes linhas e/ou sexos forem comparados entre si.

O método que desenvolvemos é mais adequado para medir o efeito da exposição aguda ao álcool, mas não é adequado para obter dados de consumo ou modelagem de vício. Os dados de sensibilidade à sedação de álcool obtidos a partir deste ensaio podem, no entanto, ser integrados com outras medidas de fenótipos relacionados ao álcool. Uma limitação do sistema é que a altura vertical das placas de cultura celular padrão permite o movimento vertical da mosca que não pode ser facilmente rastreado por vídeo para avaliação detalhada da atividade geral ou locomoção. No entanto, essa limitação não afeta a avaliação precisa do tempo de sedação. Ao utilizar moscas de diferentes genótipos (por exemplo, em populações de raças de raça sustais derivadas do DGRP²⁸), este ensaio também permite a recuperação de moscas individuais para coletar piscinas de moscas com fenótipos contrastantes para sequenciamento de DNA em massa e mapeamento extremo de QTL^29,30. No geral, este ensaio permite uma coleta rápida e barata de dados de sedação de álcool em um grande número de moscas simples.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de Cultura de Células de 24 poços	Corning	3526	de fundo plano; abrigará moscas durante todo o ensaio
Aspirador
de Gaze	Genesee Scientific	53-100	Amplamente disponível.
Etanol	Decon Labs	V1001	Amplamente disponível.
Tábua de Corte de Plástico Flexível (Tampa da Placa)	Walmart	550098612	Qualquer plástico plano que possa deslizar facilmente e cobrir completamente uma placa de 24 poços. A tábua de corte de plástico flexível funciona bem.
Gaze (para aspirador)	Honeywell North	67622	Amplamente disponível.
Almofada de iluminação	Amazon (AGPtek)	ASIN B00YA9GP0G	Qualquer almofada de luz para fornecer contraste é adequada.
Varas de artesanato jumbo	Michaels	10334892	Qualquer vara de artesanato com pelo menos 7 cm de comprimento é adequada.
Ponta de pipeta P1000 (para aspirador)	Genesee Scientific	24-165RL	Qualquer ponta de pipeta P1000 é adequada.
Pipeta sorológica (para aspirador)	Genesee Scientific	12-104
Malha de tela de insetos pequena	Lowe's (Saint-Gobain ADFORS)	89322	Qualquer malha de tela de insetos pequena é adequada.
Dimensão			de teste grande o suficiente para abranger a almofada de luz. Pode ser construído a partir de uma caixa de poliestireno.
Tubulação Tygon (para aspirador)	Grainger	9CUG7	Amplamente disponível.
Câmera de vídeo	Canon	1959C001AA	Qualquer câmera de vídeo é adequada.