Método de alta duração para medir o tempo de sedação de álcool de melanogaster individual drosophila

O Instituto Nacional de Abuso de Álcool e Alcoolismo relata que, em 2015, o consumo excessivo de álcool, designado como "transtorno do uso de álcool", afetou cerca de 16 milhões de pessoas nos Estados Unidos. O abuso de álcool causa uma ampla gama de efeitos fisiológicos adversos e é uma das principais causas de morte nos EUA. Em humanos, a diminuição da sensibilidade, ou um baixo nível de resposta ao álcool, tem um forte componente genético e está associada a um maior risco de desenvolver distúrbios do uso de álcool^1,2,3,4. Estudos de risco genético em populações humanas são desafiadores devido à mistura populacional, histórias de desenvolvimento diversas e exposições ambientais, e dependência de questionários autorreferidos para quantificar fenótipos relacionados ao álcool, que muitas vezes são confundidos com outras condições neuropsiquiátricas.

Drosophila melanogaster fornece um excelente modelo para estudar os fundamentos genéticos da sensibilidade ao álcool^5,6,7,8. O modelo de Drosophila permite um controle rigoroso sobre o fundo genético, e um número praticamente ilimitado de indivíduos do mesmo genótipo pode ser criado rapidamente sob condições ambientais bem controladas sem restrições regulatórias e a um custo relativamente baixo. Além das mutações disponíveis publicamente e das linhas RNAi que visam a maioria dos genes no genoma, a disponibilidade do Painel de Referência Genética Drosophila melanogaster (DGRP), uma população de 205 linhas derivadas de sangue selvagem com seqüências completas de genoma, possibilitou estudos de associação genoma^9,10. Tais estudos identificaram redes genéticas associadas aos efeitos no tempo de desenvolvimento e viabilidade na exposição ao desenvolvimento do etanol^11,12. A conservação evolutiva dos processos biológicos fundamentais permite que inferências translacionais sejam desenhadas sobrepondo ortologs humanos em suas contrapartes de moscas.

As moscas expostas ao etanol sofrem alterações fisiológicas e comportamentais que se assemelham à intoxicação por álcool humano, incluindo perda do controle postural⁸, sedação e desenvolvimento da tolerância^13,14,15. A sedação induzida pelo álcool em Drosophila pode ser quantificada usando inebriômetros. Estas são colunas de vidro verticais de 122 cm de comprimento com divisórias de malha inclinadas às quais as moscas podem anexar^16,,17,,18. Um grupo de pelo menos 50 moscas (sexos podem ser analisados separadamente) são introduzidos na parte superior da coluna e expostos a vapores de etanol. Moscas que perdem o controle postural caem através da coluna e são coletadas em intervalos de 1 min. O tempo médio de elução serve como medida de sensibilidade à intoxicação alcoólica. Quando as moscas são expostas ao álcool uma segunda vez após a recuperação da primeira exposição, elas podem desenvolver tolerância, como evidente a partir de uma mudança no tempo médio de elusão^13,15,19,20. Considerando que os ensaios do inebriômetro levaram à identificação de genes, redes genéticas e vias celulares associadas à sensibilidade à sedação de álcool e ao desenvolvimento da tolerância^12,,13,14,21, o ensaio é demorado, de baixa produtividade e ineficaz para medir a sensibilidade ao álcool em moscas únicas.

Ensaios alternativos de sedação de etanol que não requerem a configuração elaborada do inebriômetro permitem medidas mais convenientes, mas ainda são limitados em throughput e geralmente requerem análises de grupos de moscas em vez de indivíduos^{21,22,23,24,25}. Avaliar moscas simples minimiza o potencial de confundir efeitos devido a interações em grupo, como as decorrentes de comportamentos sociais. Aqui, apresentamos um ensaio simples, de baixo custo e de alto nível para avaliar a sensibilidade à sedação de álcool em um grande número de moscas simples.

1. Construção do aparelho de teste

1. Crie um modelo de papelão do tamanho de uma placa de cultura de célulade 24 poços, traçando em torno da placa em papelão e cortando a área designada.
2. Corte um pedaço de tela de inseto pequeno do tamanho da placa de cultura celular usando o modelo de papelão do passo 1.1.
3. Prepare uma placa de cultura de célula de 24 poços colocando uma pequena linha de cola quente ao redor do perímetro da parte superior da placa usando uma pistola de cola quente e afixando a malha de tela em cima dos poços abertos.
4. Segure uma vara artesanal de madeira em cada um dos três lados da mesma placa de cultura celular do passo 1.3 usando uma pistola de cola quente. A placa de cultura de célula modificada deve agora se assemelhar ao diagrama da placa mostrado na Figura 1A e a configuração experimental mostrada na Figura 2.
   NOTA: Prepare pelo menos quantas placas de cultura celular cabernas câmaras de filmagem (veja abaixo).

Figura 1: Diagrama do aparelho de teste e da câmara de filmagem. (A)Diagramas Superiores. As vistas superior, lateral e frontal do aparelho de teste são mostradas, respectivamente. Uma tela de malha fica plana em cima de uma placa de cultura de célula de 24 poços. Os bastões artesanais de madeira, representados pelas pontas de flecha, são anexados a três lados adjacentes para auxílio de estabilidade e alinhamento, dois na lateral da placa do poço com seis poços e um na lateral da placa com quatro poços. Todos os acessórios estão quentes colados no aparelho. (B)Diagramas inferiores. As vistas superior, lateral e frontal da configuração do ensaio são mostradas, respectivamente. Uma fenda é cortada no lado direito da caixa, desde a abertura para a tampa até a parte de trás da abertura, com a parte inferior do nível de fenda até a superfície interna. O orifício na parte superior da caixa, a superfície paralela ao solo, está centrado para exposição máxima de vídeo. A caixa sombreada representa a câmera de vídeo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fotografia do sistema de ensaios. A câmera de vídeo é colocada em cima da câmara de poliestireno, com a lente inserida no orifício de recorte, ilustrada nos diagramas da Figura 1B. Dois conjuntos de placas de cultura celular modificadas de 24 poços repousam sobre uma almofada de iluminação que é inserida em uma fenda através da lateral da câmara. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Construção da câmara de filmagem

1. Crie uma câmara de filmagem cortando um buraco do tamanho da lente da câmera de vídeo na lateral de uma caixa de poliestireno. Corte uma fenda adicional da largura da almofada de iluminação no lado oposto da caixa de poliestireno. A câmara de filmagem deve se assemelhar à câmara de filmagem mostrada na Figura 1B e figura 2.
2. Prepare a câmara de filmagem para uso inserindo a almofada de iluminação na fenda e posicionando a câmera no orifício da lente acima da almofada de iluminação.
3. Coloque todos os materiais e realize todos os testes subseqüentes em um ambiente controlado, de preferência uma câmara comportamental com aproximadamente 30% de umidade, temperatura de 25 °C, fluxo de ar uniforme e níveis de ruído inferiores a 65 dB.

3. Preparação do aparelho de teste e moscas

1. Pipeta 1 mL de 100% etanol através da malha da tela em cada poço.
2. Seque a tela com um pedaço de pano de queijo.
3. Corte dois pedaços de pano de queijo as dimensões da placa de cultura celular usando o modelo de papelão criado na etapa 1.1. Coloque-os em cima da malha de tela seca da placa de cultura de célula modificada contendo etanol do passo 3.2.
4. Crie um pequeno pedaço de placa de corte de plástico fina e flexível, traçando em torno do modelo de papelão criado na etapa 1.1 como guia geral e expandindo a área traçada em 1-2 cm em um dos lados curtos. Corte a área traçada expandida da fina e flexível placa de corte de plástico. Após o corte, certifique-se de que o plástico ainda se encaixa entre as três varas artesanais de madeira no aparelho de teste, mas pendura uma extremidade por 1-2 cm.
5. (Opcional) Se um aspirador precisar ser criado, monte um aspirador como o mostrado na Figura 3 cortando primeiro uma ponta de pipeta P1000 ao meio. Insira a peça com um diâmetro maior em uma extremidade de um pedaço de tubo flexível de ~30 cm para servir como porta-voz.

Figura 3: Um aspirador de moscas no qual as moscas são coletadas com um bocal intercambiável ligado a tubos flexíveis e uma pipeta sorológica de furo largo com uma rolha de gaze de algodão. O operador pode aspirar uma única mosca na pipeta para transferência sem anestesia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. (Opcional) Para completar o conjunto aspirador, cubra a extremidade larga de um pedaço de pipeta sorológica de 10 cm com gaze para evitar que as moscas entrem na tubulação e insira a pipeta, gaze primeiro, na extremidade aberta da tubulação para servir como uma câmara de mosca. O aspirador deve se assemelhar ao mostrado na Figura 3.
7. Usando um aspirador(Figura 3, passos 3.5 e 3.6), aspirar uma mosca por poço em uma placa de cultura celular separada de 24 poços. Use o plástico flexível para cobrir quaisquer poços que contenham moscas aspiradas anteriormente. Registre a posição do poço e qualquer informação relevante de genótipo ou fenótipo de cada mosca.
8. Segure o plástico flexível nivelado com a parte superior da placa de cultura celular contendo as moscas para evitar sua fuga e inverter a placa na parte superior da placa de cultura de célula modificada com o etanol. A folha de plástico flexível deve estar apoiada em cima das folhas de pano de queijo. Alinhe a placa de cultura celular invertida contendo moscas usando as varas artesanais para garantir que cada poço com etanol se alinhe com cada poço contendo uma mosca.
9. A configuração experimental deve se assemelhar à Figura 2.

4. Testando as moscas

1. Certifique-se de que a almofada de iluminação esteja acesa com brilho total para o máximo contraste visual. Comece a gravar com a câmera de vídeo.
2. Para expor as moscas ao etanol, remova cuidadosamente o plástico entre a placa do poço e o aparelho de teste, tomando cuidado para não desalojar a toalha de queijo.
3. Termine a gravação de vídeo uma vez que todas as moscas perderam o controle postural. Uma vez que se suspeite que todas as moscas perderam o controle postural, toque firmemente no centro da placa para garantir que todas as moscas tenham perda completa do controle postural. Se houver movimento, continue a gravar. Continue a tocar periodicamente (a cada 1-2 min) até que não ocorra nenhum movimento.
4. (Opcional) Para recuperar rapidamente as moscas, remova apenas a placa superior do aparelho de teste, revelando moscas sedadas descansando sobre a toalha de queijo. Aspirar moscas individuais em recipientes escolhidos para recuperação.
5. Substitua o etanol nas placas de cultura celular modificadas por 1 mL de etanol fresco 100% a cada hora para controlar a evaporação e a umidificação do etanol e manter a exposição consistente ao etanol durante todo o ensaio. Seque a tela com pano de queijo.
6. Repita para quantas amostras desejarem.
   NOTA: Para maior produção, aspirar a próxima rodada de moscas em novas placas de cultura celular durante a gravação de vídeo. O protocolo pode ser pausado aqui, pois a gravação de vídeo pode ser revisada mais tarde.

5. Determinação do tempo de sedação de moscas

1. Gravar o tempo de sedação para cada indivíduo voar assistindo a gravação de vídeo. O tempo de sedação é definido como o momento em que uma mosca perde o controle postural completo e a capacidade locomotor. Recomenda-se assistir o filme ao contrário e registrar o tempo que a mosca começa a se mover para garantir a precisão.

Duas placas microtiter de 24 poços poderiam gerar dados simultaneamente em 48 moscas individuais dentro de apenas 10 minutos. A Tabela 1 lista as medidas dos tempos de sedação de etanol para 48 moscas individuais, machos e fêmeas separadamente, de duas linhas DGRP com sensibilidades diferentes à exposição ao álcool no tempo de desenvolvimento e viabilidade13. As moscas de linha RAL_555 foram menos sensíveis que a linha RAL_177 (Figura 4, Tabela 2; p < 0,0001, ANOVA). Machos e fêmeas de RAL_177 não apresentaram efeito sexualmente dimórfico (Figura 4, Tabela 2; p > 0,1, ANOVA), enquanto as fêmeas de linha RAL_555 foram menos sensíveis à exposição ao etanol do que os machos ( Figura4, Tabela 2; p < 0,006, ANOVA). O grande número de moscas que podem ser medidas simultaneamente e a capacidade de medir sexos e diferentes linhas contemporaneamente podem aumentar a precisão reduzindo o erro devido à variação ambiental.

Tabela 1: Medições dos tempos de sedação de etanol (s) das linhas individuais de (A) DGRP RAL_177 e (B) RAL_555 para sexos separados (n = 48). Veja também tabela 2, Figura 4.

Figura 4: Tempos de sedação de álcool das linhas DGRP RAL_177 e RAL_555. As barras representam meios e as barras de erro SEM (n = 48). Os tempos de sedação para moscas RAL_177 foram menores do que os das moscas RAL_55 (p < 0,0001, ANOVA). Os pontos de dados individuais são indicados na Tabela 1. Diferenças estatisticamente significativas adicionais entre sexos e linhas são indicadas no texto e na Tabela 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 2: Análises de variância para tempo de sedação através do sexo e linha DGRP. O modelo utilizado foi Y = μ + L + S + LxS + ε, onde μ é a média geral, L é o efeito fixo da linha DGRP (RAL_177, RAL_555), S é o efeito fixo do sexo (masculino, feminino), LxS é o termo de interação (fixo), e ε é o termo de erro. Os modelos Y = μ + L + ε e Y = μ + S + ε foram utilizados para os modelos reduzidos. Linha, Sexo e o termo de interação Linha x Sexo foram todos significativos no modelo completo em α < 0,05. Modelos reduzidos por sexo e linha DGRP RAL_555 também foram significativos em α < 0,01. Veja também tabela 1, Figura 4. df = graus de liberdade, SS = Tipo I Soma de Quadrados.

Os autores não têm nada para revelar.