Método de alta duração para medir o tempo de sedação de álcool de melanogaster individual drosophila

A drosophila fornece um excelente modelo para estudar os fundamentos genéticos da sensibilidade ao álcool porque você pode quantificar a sensibilidade ao álcool precisamente sob antecedentes genéticos controlados e condições ambientais. Métodos atuais para medir a sensibilidade ao álcool em grupos de teste de Drosophila de moscas. Apresentamos um método simples, de baixo custo e de alto rendimento para avaliar a sensibilidade ao álcool em um grande número de moscas simples.

A variação da sensibilidade ao álcool em Drosophila pode ser traduzida para fenótipos semelhantes em humanos porque as moscas compartilham cerca de 75% de seus genes com ortologs humanos. O ensaio que desenvolvemos também pode ser aplicado para medir os efeitos da toxicidade aguda de voláteis em outros insetos, incluindo outras espécies de moscas ou vetores de doenças. Comece criando um modelo de papelão de uma placa de cultura celular de 24 poços.

Rastreie a placa e corte a área designada. Em seguida, use o modelo de papelão para criar um pedaço de tela de insetos pequenos do tamanho da placa. Coloque uma pequena linha de cola quente ao redor do perímetro de uma placa de cultura de 24 poços, e afixe a malha de tela em cima dos poços.

Em seguida, use a pistola de cola quente para fixar uma vara de madeira em três lados da placa de cultura. Prepare quantas placas puderem caber na câmara de filmagem. Para criar a câmara de filmagem, corte um furo do tamanho da lente da câmera de vídeo em um lado de uma caixa de poliestireno e uma fenda adicional no tamanho da almofada de iluminação no lado oposto.

Insira a almofada de iluminação na fenda e posicione a câmera no orifício da lente acima da almofada de iluminação. Coloque todos os materiais de teste em um ambiente controlado, de preferência uma câmara comportamental com aproximadamente 30% de umidade, temperatura de 25 graus Celsius, fluxo de ar uniforme e níveis de ruído inferiores a 65 decibéis. Use o modelo de papelão feito anteriormente para cortar dois pedaços de pano de queijo.

Em seguida, pipeta um mililitro de 100% etanol através da malha de tela em cada poço. Seque a malha e coloque os dois pedaços de pano de queijo por cima. Corte um pequeno pedaço de placa de corte fina, flexível e de plástico usando o modelo de papelão como guia para expandir a área em um a dois centímetros em um dos lados curtos.

Após o corte, certifique-se de que o plástico ainda se encaixa entre as três varas artesanais de madeira no aparelho de teste, mas pendura uma extremidade. Prepare um aspirador de acordo com as instruções do manuscrito, e use-o para transferir uma mosca por poço em uma placa de cultura celular de 24 poços, cobrindo quaisquer poços com moscas previamente aspiradas com o plástico flexível. Regisso cargo e qualquer genótipo ou informações de fenótipo relevantes de cada mosca.

Segure o plástico flexível alinhado com a parte superior da placa de cultura celular contendo as moscas, e inverta a placa na parte superior da placa de cultura celular modificada com o etanol. Use as varas de artesanato para alinhar a placa de cultura celular invertida, certificando-se de que cada poço com etanol se alinha com cada poço contendo uma mosca. Certifique-se de que a almofada de iluminação está acesa com brilho total e comece a gravar com a câmera de vídeo.

Exponha as moscas ao etanol removendo cuidadosamente o plástico entre as duas placas, certificando-se de não desalojar o pano de queijo. Quando se suspeita-se que todas as moscas perderam o controle postural, toque firmemente no centro da placa. Se houver movimento, continue gravando, tocando a cada um a dois minutos até que não ocorra movimento.

Termine a gravação assim que não houver movimento. Para recuperar as moscas, remova a placa superior do aparelho de teste e aspire as moscas individuais em recipientes escolhidos. Substitua o etanol nas placas de cultura celular modificada pelo menos uma vez por hora para manter a exposição consistente ao etanol durante todo o ensaio, e repita o experimento para quantas amostras desejarem.

Assista à gravação de vídeo para determinar o tempo de sedação da mosca, que é definido como o momento em que uma mosca perde o controle postural e a capacidade locomotor. Para garantir a precisão, assista o filme ao contrário e registe o tempo em que a mosca começa a se mover. Este método pode ser usado para gerar dados sobre um grande número de moscas dentro de 10 minutos.

Duas placas de 24 poços foram utilizadas para medir simultaneamente os tempos de sedação do etanol para 48 moscas individuais de duas linhas DGRP com sensibilidades diferentes ao álcool. Grandes tamanhos de amostra aumentam a precisão e reduzem o erro à variação ambiental. RAL_555 moscas eram menos sensíveis que as moscas RAL-177.

Os machos e fêmeas de RAL_177 não apresentaram efeito sexualmente damórfico, enquanto as fêmeas de linha RAL_555 eram menos sensíveis à exposição ao etanol do que os machos. Ao tentar este protocolo, é crucial realizar a aspiração das moscas e a inversão da placa de cultura celular com precisão para alcançar o resultado desejado. Uma vez que a capacidade de avaliar moscas simples evita efeitos confusos devido às interações em grupo, este ensaio aumenta a utilidade do modelo Drosophila para estudos de alta produtividade sobre efeitos agudos da exposição ao álcool.