इस लेख में एकल या थोक सी elegans नमूनों में जीन अभिव्यक्ति के स्तर के तेजी से और विश्वसनीय निर्धारण के लिए एक उच्च थ्रूपुट प्रोटोकॉल वर्णित है । इस प्रोटोकॉल आरएनए अलगाव की आवश्यकता नहीं है और नमूनों से सीधे सीडीएनए का उत्पादन करता है। इसका उपयोग उच्च-थ्रूपुट मल्टीप्लेक्स्ड नैनोफ्लुइडिक रियल-टाइम क्यूपीसीआर प्लेटफार्मों के साथ किया जा सकता है।
यह पेपर कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस के लिए एक उच्च-थ्रूपुट रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन मात्रात्मक पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर) परख प्रस्तुत करता है जो तेज, मजबूत और अत्यधिक संवेदनशील है। यह प्रोटोकॉल एकल कीड़े से या थोक नमूनों से जीन अभिव्यक्ति के सटीक माप प्राप्त करता है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल पूरक डीएनए (सीडीएनए) तैयारी के लिए मौजूदा तरीकों का एक उपन्यास अनुकूलन प्रदान करता है जो नैनोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर प्लेटफॉर्म के साथ मिलकर है। इस प्रोटोकॉल का पहला भाग, जिसका नाम ‘वर्म-टू-सीटी’ है, सीडीएनए उत्पादन को पूर्व एमएनए अलगाव की आवश्यकता के बिना सीधे सूत्रकृमि से अनुमति देता है। यह 3.5 घंटे में 96 कीड़े से सीडीएनए की तैयारी की अनुमति देकर प्रयोगात्मक थ्रूपुट बढ़ाता है। प्रोटोकॉल का दूसरा हिस्सा सीडीएनए पर हाई-थ्रूपुट आरटी-क्यूपीसीआर चलाने के लिए मौजूदा नैनोफ्लुइडिक तकनीक का इस्तेमाल करता है । यह पेपर दो अलग-अलग नैनोफ्लुइडिक चिप्स का मूल्यांकन करता है: पहला 96 नमूने और 96 लक्ष्य चलाता है, जिसके परिणामस्वरूप बेंचवर्क के लगभग 1.5 दिनों में 9,216 प्रतिक्रियाएं होती हैं। दूसरी चिप प्रकार में छह 12 x 12 सरणी होती हैं, जिसके परिणामस्वरूप 864 प्रतिक्रियाएं होती हैं। यहां, कीड़ा से सीटी विधि जीन के mRNA स्तर की मात्रा निर्धारित करके प्रदर्शित किया जाता है एक कीड़े से और थोक नमूनों से गर्मी सदमे प्रोटीन encoding । बशर्ते सी एलिगेंस जीनोम के भीतर कोडिंग जीन के बहुमत के लिए प्रसंस्कृत आरएनए को बढ़ाना करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमर की एक व्यापक सूची है।
एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण और क्यूपीसीआर के अनुकूलन से पता चला है कि ट्रांसक्रिप्शनल दालें या फटने से प्रति सेल1आरएनए अणुओं की संख्या में भारी भिन्नता हो सकती है । इसके अलावा, इन प्रौद्योगिकियों ने पहले मानक थोक ट्रांसक्रिप्टोर्मिक मापन से चूक गए पर्याप्त सेलुलर विषमता का पर्दाफाश किया। संदर्भ के आधार पर, कुछ एकल-कोशिका प्रतिलेखन परिवर्तनशीलता ऊतकों की मिश्रित सेलुलर संरचना के कारण होती है। हालांकि , एक ही वातावरण के तहत उगाई जाने वाली आइसोजेनिक सेल आबादी में भी व्यापक ट्रांसक्रिप्शनल विषमता2,3है। इस ‘ जैविक परिवर्तनशीलता ‘ तेजी से सेलुलर नेटवर्क की एक सर्वव्यापी संपत्ति के रूप में पहचान की है, बैक्टीरिया से आदमी के लिए । कुछ मामलों में, यह विकास, कैंसर की प्रगति, एचआईवी विलंबता, और कीमोथेरेपी4,5के लिए प्रतिक्रिया में फेनोटाइपिक परिणाम हो सकता है ।
नेमाटोड कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस व्यक्तियों के बीच जैविक परिवर्तनशीलता के कारणों और परिणामों का अध्ययन करने के लिए आदर्श विशेषताओं के साथ एक अद्वितीय मॉडल जीव है। ये सूत्रकृमि 959 कोशिकाओं से बना एक सरल मॉडल जीव हैं, और उनका पारदर्शी क्यूटिकल उन्हें वीवो इमेजिंग अध्ययन6में उत्तरदायी बनाता है। सी एलिगेंस एक हर्मैफ्रोडिटिक प्रजाति है जो मुख्य रूप से आत्म-निषेचन के माध्यम से पुन: उत्पन्न होती है; इसके परिणामस्वरूप आइसोजेनिक प्रयोगशाला उपभेदों में हुई। आइसोजेनिकिटी और नियंत्रित संस्कृति की स्थितियों के बावजूद, कई फेनोटाइप और ट्रांसक्रिप्ट व्यक्तियों में परिवर्तनशील होते हैं, जो यह सुझाव देते हैं कि स्टोचस्टिक या माइक्रोएनवायरमेंटल मतभेद व्यक्तियों में विषमता में योगदान देते हैं7,8। जीन अभिव्यक्ति में इस तरह की परिवर्तनशीलता के कई फिटनेस परिणाम होते हैं, जिनमें उत्परिवर्तन, अस्तित्व, विकासात्मक समय औरफेक्यूंटी7,8,9के पेनेट्रेंसी में परिवर्तनशीलता शामिल है। इन विशेषताओं के कारण, एकल-कृमि अध्ययन पूरे जीव में जैविक परिवर्तनशीलता का अध्ययन करने का अभूतपूर्व अवसर प्रदान करते हैं।
एकल-कृमि स्तर पर टेप का सटीक पता लगाने के लिए प्रौद्योगिकियों को विकसित और अनुकूलित करने के लिए क्षेत्र में एक बुनियादी आवश्यकता है । नई प्रौद्योगिकियां, जैसे एकल-कीड़ा आरएनए अनुक्रमण10,अलग ऊतकों से आरएनए अनुक्रमण11,और एकल सेल अनुक्रमण12 अब सी एलिगेंसके लिए उपलब्ध हैं। हालांकि, एक मुख्य चुनौती बनी हुई है: जब अंतरविभावैद्यता की निगरानी, कमजोर व्यक्त जीन अक्सर पता लगाने योग्य स्तर13से नीचे गिर जाते हैं । यह विशेष रूप से दुर्लभ टेप शुरू करने वाली सामग्री की छोटी मात्रा से अलग करने के लिए प्रासंगिक है, क्योंकि मतलब अभिव्यक्ति और तकनीकी विचरण के बीच एक अच्छी तरह से स्थापित, व्युत्क्रम संबंध है, जिससे अक्सर दुर्लभ प्रतिलिपियां सांख्यिकीय कटऑफ13से नीचे गिर जाती हैं। उच्च-थ्रूपुट मल्टीप्लेक्स क्यूपीसीआर प्रौद्योगिकियों का अनुकूलन स्तनधारी एकल-कोशिका अध्ययनों के लिए उपयोगी साबित हुआ है, विशेष रूप से दुर्लभ प्रतिलिपियों14, 15की अभिव्यक्ति का अध्ययन करते समय। इस तकनीक का उपयोग अन्य एकल-कृमि प्रौद्योगिकियों के बेंचमार्किंग और सत्यापन उद्देश्यों के लिए भी किया जा सकता है।
कृमि से सीटी एक तेज, मजबूत विधि है जो सेल बायोलॉजी अध्ययन में उपयोग की जाने वाली किट से अनुकूलित होती है, एकल वर्म सीडीएनए तैयारी के लिए। इस विधि द्वारा प्राप्त सीडीएनए को मल्टीप्लेक्स नैनोफ्लुइडिक क्यूपीसीआर प्रौद्योगिकी के साथ मिलकर चुना गया था क्योंकि यह उच्च प्रयोगात्मक थ्रूपुट प्रदान करता है, जो पता लगाने की एक व्यापक गतिशील रेंज है और इसे एकल-कोशिका प्रयोजनों14, 15के लिए मान्य किया गया है । सीडीएनए की तैयारी मानक पीसीआर प्रौद्योगिकियों के साथ उपयोग के लिए भी लागू है। थ्रूपुट दो तरीकों से बढ़ जाता है: पहला, सीडीएनए तैयारी पारंपरिक ग्वानिडियम थियासाइनेट-फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण की तुलना में तेज और अधिक विश्वसनीय है, क्योंकि कीड़े सीधे लाइसिस बफर में जोड़े जाते हैं, आसानी से डिग्रेडेबल आरएनए के सीधे अलगाव को छोड़ देते हैं। दूसरा, नैनोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियों का उपयोग करने से नमूनों और लक्ष्यों की संख्या में काफी वृद्धि होती है जिन्हें एक साथ चलाया जा सकता है। इस पेपर में, दो चिप्स की तुलना की जाती है: एक एकल-सरणी चिप और एक बहु-सरणी चिप। एक एकल सरणी चिप 96 एकल कीड़े और 96 प्राइमर सेट चला सकती है, जिसके परिणामस्वरूप प्रति प्रयोग 9,216 प्रतिक्रियाएं होती हैं। मानक क्यूपीसीआर प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके समान थ्रूपुट को पूरा करने के लिए 96 अच्छी प्लेटों का उपयोग करके 96 अलग क्यूपीसीआर प्रयोगों की आवश्यकता होगी। छोटे और अधिक लचीला बहु-सरणी चिप में छह 12 x 12 सरणी होती हैं जिसके परिणामस्वरूप 864 प्रतिक्रियाएं होती हैं। विधि की बेहतर विश्वसनीयता और संवेदनशीलता नैनोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकी द्वारा और एक प्रीएम्पिलिफिकेशन चरण की शुरूआत से बढ़ाया जाता है। इस पेपर में प्रस्तुत विधि का उपयोग जैविक विचरण निकालने के लिए अत्याधुनिक सांख्यिकीय एल्गोरिदम के साथ किया जाना है। यह लेख एकल-कीड़े और बैच कृमि नमूनों दोनों के लिए तेजी से सीडीएनए तैयारी और उच्च-थ्रूपुट क्यूपीसीआर के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है; एल्गोरिदम कहीं और प्रकाशित किया जाएगा। इस प्रोटोकॉल के लिए, प्रयोग से पहले प्रत्येक चिप का संगठन तैयार किया जाना चाहिए। तालिका 1 और तालिका 2 क्रमशः एक बहु-सरणी और एकल-सरणी चिप के लिए इन योजनाओं के उदाहरण दिखाते हैं। चित्रा 1 में विस्तृत कीड़ा-टू-सीटी प्रोटोकॉल का अवलोकन भी कर रहे हैं और चित्रा 2में बहु-सरणी और एकल-सरणी चिप्स चला रहे हैं।
इस पेपर में, कीड़ा-से-सीटी प्रोटोकॉल को एकल कीड़े या कीड़े के एक छोटे पूल से आरएनए निकालने के लिए एक तेजी से और कुशल विधि दिखाई गई है। नैनोफ्लुइडिक सिस्टम द्वारा पेश किया गया उच्च-थ्रूपुट इसे अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता मापों के परिमाणीकरण के लिए आदर्श बनाता है। इसके अलावा, इस विधि की उच्च संवेदनशीलता कम स्तर पर व्यक्त जीन का पता लगाने की अनुमति देती है जो एकल-कृमि आरएनए-सेक्यू प्रौद्योगिकियों 9 का उपयोग करते समय पता लगाने से नीचेगिरतेहैं।
एकल कीड़े से सीडीएनए तैयार करने के लिए विधि के विकल्प पर विचार करते समय। Ly एट अल29 ने एक प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जो क्यूटिकल पाचन के लिए प्रोटीनेज के पर निर्भर करता है। क्यूटिकल कीड़े से अणुओं के अलगाव के लिए एक बड़ी बाधा है और प्रोटीन के इसे तोड़ने के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है। हालांकि, प्रोटीन के लिए गर्मी निष्क्रिय करने के लिए रिवर्स प्रतिलेखन के लिए एंजाइमों का उपयोग करने में सक्षम होना चाहिए । जबकि Ly et al. 96 डिग्री सेल्सियस के लिए एक 10 मिनट जोखिम का इस्तेमाल किया, इस कदम से बचा गया था क्योंकि आरएनए आसानी से अपमानजनक है। प्रोटीनेज कश्मीर का उपयोग करने के बजाय, क्यूटिकल को तोड़ने के लिए बार-बार फ्रीज-गल चक्रों का उपयोग किया जाता था। फ्रीज-गल क्यूटिकल को तोड़ने के लिए एक प्रभावी तरीका है क्योंकि अधिक आरएनए को प्रति कीड़ा अलग किया जा सकता है। Ly et al. रिपोर्ट है कि प्रति कीड़ा निकाले गए कुल आरएनए प्रोटीन के का उपयोग करके 35 एनजी है, जबकि यह प्रोटोकॉल प्रति कीड़ा कुल आरएनए के 51.75 एनजी ± 6.74 एसईएम प्राप्त करता है। प्रीएम्पलिफिकेशन चरणों के साथ मिलकर हीट एक्सपोजर से बचना जाहिरा तौर पर मानक प्रोटोकॉल की तुलना में कीड़ा-टू-सीटी की गतिशील रेंज का पता लगाने को चौड़ा करता है। Ly et al. हीट शॉक के बाद एचएसपी-16.2 के लिए 0.15 ± 0.15 और एचएसपी-70 के लिए 0.17 ± 22.8 के पूर्ण सीटी मूल्यों की रिपोर्ट करें। इसी हीट शॉक स्थितियों (30 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे) का उपयोग करते हुए, यह प्रोटोकॉल एचएसपी-16.2 के लिए 0.57 ± 17.93 और एचएसपी-70 के लिए 21.13 ±0.33 के पूर्ण सीटी मूल्य प्राप्त करता है। यह इंगित करता है कि फ्रीज-गल लाइसिस विधि आरएनए की अधिक पैदावार प्रदान करती है और नीच व्यक्त किए गए टेप के लिए अधिक उपयुक्त है।
लक्ष्य टेप के दिए गए सेट की जांच करते समय नैनोफ्लुइडिक सिस्टम आदर्श होते हैं और प्रयोग के पैमाने पर अनुकूलन की अनुमति देने वाले नमूनों की छोटी (बहु-सरणी चिप) या बड़ी (एकल-सरणी चिप) संख्या का उपयोग करते हैं। एक ही कीड़े में व्यक्त सभी टेप की एक निष्पक्ष तस्वीर प्राप्त करने के लिए, स्पष्ट विकल्प आरएनए अनुक्रमण का उपयोग करना है। यदि, हालांकि, प्रयोग का ध्यान एक छोटा लेकिन अभी भी लक्ष्य जीन का अपेक्षाकृत बड़ा सेट है, तो इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए अधिक लागत प्रभावी है, बशर्ते शोधकर्ता के पास नैनोफ्लुइडिक्स पीसीआर मशीन तक पहुंच हो। नैनोफ्लुइडिक सिस्टम रिएजेंट्स और सिंगल-ऐरे चिप की लागत लगभग £१३ प्रति कीड़ा के रूप में अनुमानित है, जबकि एकल-कृमि अनुक्रमण के लिए अभिकर्मकों की लागत लगभग £६० प्रति कीड़ा होगी, जिसमें अनुक्रमण लागत शामिल नहीं है ।
पीसीआर प्लेटफॉर्म का उपयोग करने पर विचार करते समय, नैनोफ्लुइडिक क्यूपीसीआर के साथ मिलकर कीड़ा-टू-सीटी विधि समय और थ्रूपुट के संबंध में फायदे प्रदान करती है। लगभग 2 दिनों के काम में 9,216 आरटी-क्यूपीसीआर परिणाम प्राप्त करना संभव है, जबकि एक मानक क्यूपीसीआर प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके समान संख्या के लक्ष्यों का प्रवर्धन लगभग 5 कार्य सप्ताह लेगा, 96 अच्छी प्लेट का उपयोग करके, एक दिन में चार प्लेटें चलाना। हालांकि, यदि परीक्षण किए जाने वाले लक्ष्यों की संख्या छोटी है, तो मानक क्यूपीसीआर मशीन के साथ मिलकर कीड़ा-टू-सीटी का उपयोग करना अधिक लागत प्रभावी है। एकल सरणी चिप्स को फिर से नहीं चलाया जा सकता है, इसलिए खाली कुओं को चलाने से लागत दक्षता कम हो जाती है ।
विधि की एक सीमा मल्टीप्लेक्सिंग चरण के दौरान प्राइमर-प्राइमर डिमर का संभावित गठन है, लेकिन यह 1% से भी कम मामलों में होता है। यद्यपि कीड़ा-टू-सीटी प्रोटोकॉल कुशल है और एकल कीड़े पर लागू होने पर विश्वसनीय परिणाम प्रदान करता है, लगभग 5% की विफलता दर होती है, जो संभवतः उन मामलों से मेल खाती है जहां कीड़ा कटाई चरण के दौरान टोपी या ट्यूब के शीर्ष में फंसा रहता है।
साथ में, यह बहुमुखी और विश्वसनीय विधि अधिक मानक तकनीकों की तुलना में थ्रूपुट और संवेदनशीलता में वृद्धि प्रदान करती है। यह विधि उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन के सत्यापन के लिए बहुत उपयोगी हो सकती है और एकल-कृमि जीन अभिव्यक्ति के स्तर की निगरानी या मान्य करने के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प है। इस विधि को अन्य चुनौतीपूर्ण तकनीकों पर लागू किया जा सकता है, जैसे कि अलग-थलग ऊतकों से जीन अभिव्यक्ति का मात्रा। उदाहरण के लिए, पूर्ण ऊतकों का अलगाव, जैसे आंत, गोनाड, या एफएसी द्वारा अलग की गई कोशिकाएं, आरएनए अनुक्रमण प्रयोगों को करने के लिए पर्याप्त सामग्री प्रदान करती हैं। हालांकि, सीमित मात्रा में सामग्री अक्सर डुप्लिकेट पढ़ता है, जो दुर्लभ प्रतिलिपियों के मात्रा को पहले से ही रोकता है। इस परिदृश्य में, नैनोफ्लुइडिक्स आधारित प्रौद्योगिकी का उपयोग करके प्रयोगों के प्रति अतिरिक्त संवेदनशीलता प्रदान करनी चाहिए और लागत दक्षता में वृद्धि करनी चाहिए यदि शोधकर्ताओं को उन ऊतकों या कोशिकाओं में सभी प्रतिलिपियों के केवल सबसेट की निगरानी करने की आवश्यकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम शरलीन मर्डोक और बाबरहाम इंस्टीट्यूट की सुविधाओं को उनके समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं । जेएलपी को वेलकम ट्रस्ट (093970/Z/10/Z) द्वारा समर्थित किया गया था और ओसी ईआरसी ६३८४२६ और BBSRC [BBS/E/B000C0426] द्वारा समर्थित है ।
100µM stock primers for genes of interest. | |||
20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | for 96.96 chip (Single-Array Chip) |
2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | 100-7611 | |
384 well plates | |||
8-strip PCR tubes | |||
96 well ice block | |||
96 well plates | |||
96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M-96.96 | Referenced throughout the manuscript as "Single-Array Chip" |
96-well sealing tape | |||
BioMark & EP1 Software | Fluidigm | 101-6793 | Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software |
BioMark or BioMark HD system | Fluidigm | 100-2451 K1 | Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics thermocycler" |
Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs | Fluidigm | 89000021 | Referenced throughout manuscript as "control line fluid" |
DNA Suspension buffer | TEKnova | T0021 | |
domed PCR caps | |||
Exonuclease I | New England BioLabs | M0293L | |
Exonuclease I reaction buffer | New England BioLabs | B0293S | |
FLEXsix DELTAgene Sample Reagent | Fluidigm | 100-7673 | referenced throughout manuscript as "sample reagent" |
FLEXsix Gene Expression IFC | Fluidigm | 100-6308 | referenced throughout manuscript as "Multi-Array Chip" |
Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide | Fluidigm | 68000088 | This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript. |
IFC Controller MX | Fluidigm | 68000112 I1 | Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics PCR priming machine" |
IFC Controllers SOFTWEAR | Fluidigm | 100-2297 | Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX |
liquid nitrogen in dewar | |||
Microcentrifuge | StarLab | C1301B-230V | Used to spin down PCR tube strips in the protocol. |
Nuclease Free Water | |||
plate spinner | Labnet | K4050725 | mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as "tabletop plate spinner" |
Power SYBR Green Cells-to-Ct kit | invitrogen | 4402955 | This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20°C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR®Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions. |
PreAmp Master Mix | Fluidigm | 100-5580, 100-5581 | |
Reverse Transcription Master Mix—480 reactions | Fluidigm | 100-6299 | One tube also available for 96 reactions (PN100-6298) |
Rnase Free water | |||
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad Laboratories | 172-5211 | referenced throughout the manuscript as "fluorescent probe supermix" |
Standard 96 and 384-well Thermal Cycler | |||
TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA | TEKnova | T0224 | Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000031 | Referenced throughout the text as "thermal mixer" |
Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | Referenced through the protocol as "guanidium thiocyanate-phenol-chloroform" |
Warm water bath |