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利用纳米流体技术在单个及批量 C. elegans 样本中进行高通量定量 RT-PCR

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DOI：

10.3791/61132

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2020年5月28日

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1Babraham Institute, 2Gurdon Institute, University of Cambridge, 3Department of Genetics, University of Cambridge, 4Wellcome Trust Genome Campus, Wellcome Trust Sanger Institute, 5Laboratory of Virology and Infectious Disease, The Rockefeller University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种高通量、快速且可靠的基因表达水平检测方法，适用于单个或批量的 C. elegans 样品。该方法无需进行RNA提取，可直接从样品中生成cDNA，并可与高通量多重纳米流控实时qPCR平台联合使用。

摘要

本文介绍了一种针对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的高通量逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测方法，该方法快速、稳健且高度灵敏。本方案可对单条线虫或批量样品中的基因表达水平进行精确测量。文中所述方案对现有的互补DNA（cDNA）制备方法进行了创新性改进，并结合纳米流体RT-qPCR平台实现高效检测。该方案的第一部分称为“Worm-to-CT”，可直接从线虫中制备cDNA，无需预先分离mRNA，通过该方法可在3.5小时内完成96个线虫样品的cDNA制备，显著提高了实验通量。方案的第二部分利用现有的纳米流体技术对cDNA进行高通量RT-qPCR分析。本文评估了两种不同的纳米流体芯片：第一种芯片可运行96个样品与96个靶标，约1.5天的实验操作即可完成9,216个反应；第二种芯片包含六个12×12阵列，共可进行864个反应。文中以单条线虫和批量样品中编码热激蛋白的基因mRNA水平测定为例，展示了Worm-to-CT方法的应用效果。此外，本文还提供了一份广泛的引物列表，这些引物设计用于扩增秀丽隐杆线虫（C. elegans）基因组中大多数编码基因的成熟RNA序列。

引言

单细胞RNA测序和qPCR技术的优化表明，转录脉冲或转录爆发可导致每个细胞中RNA分子数量的巨大差异1。此外，这些技术揭示了以往通过常规群体转录组测量所未能发现的显著细胞异质性。根据具体背景，部分单细胞转录变异是由组织中混合的细胞组成所致。然而，即使在相同环境下培养的同基因型细胞群体中，也普遍存在广泛的转录异质性2,3。这种“生物学变异性” increasingly被认定为从细菌到人类的细胞网络中普遍存在的特性。在某些情况下，它可能在发育、癌症进展、HIV潜伏以及对化疗的反应中产生表型效应4,5。

线虫 Caenorhabditis elegans 是一种独特的模式生物，具有理想特性，可用于研究个体间生物学变异的原因及其后果。这些线虫是一种由959个细胞组成的简单模式生物，其透明的角质层使其适用于活体成像研究6。C. elegans 是一种雌雄同体物种，主要通过自体受精繁殖，从而形成了同基因型的实验室品系。尽管具有同基因型和受控的培养条件，许多表型和转录本在个体间仍存在差异，表明随机性或微环境差异可能导致个体间的异质性7,8。基因表达的这种变异性具有多种适合度后果，包括突变外显率、存活率、发育时序以及繁殖力的个体间差异7,8,9。由于这些特性，单条线虫研究为在完整生物体中研究生物学变异性提供了前所未有的机会。

该领域迫切需要开发和优化能够在单条线虫水平上准确检测转录本的技术。目前已有若干新技术可用于秀丽隐杆线虫（C. elegans），例如单线虫RNA测序10、从分离组织中进行的RNA测序11以及单细胞测序12。然而，一个主要挑战仍然存在：在监测个体间差异时，低表达水平的基因常常低于可检测阈值13。这一问题在起始材料量较少的情况下尤为突出，特别是对于稀有转录本而言，因为基因平均表达水平与技术变异之间存在明确的负相关关系，这常常导致稀有转录本低于统计学显著性阈值13。高通量多重qPCR技术的优化已被证明在哺乳动物单细胞研究中具有重要价值，尤其是在分析稀有转录本表达时尤为有效14,15。该技术也可用于其他单线虫技术的基准评估和验证。

Worm-to-CT 是一种快速、稳健的方法，改编自细胞生物学研究中使用的试剂盒，用于单条线虫的 cDNA 制备。本研究选择通过该方法获得的 cDNA 并结合多重纳米流控 qPCR 技术，因其具有更高的实验通量、更宽的检测动态范围，并且已被验证适用于单细胞目的14,15。所描述的 cDNA 制备方法同样适用于标准 PCR 技术。该方法通过两种方式提高了通量：首先，cDNA 制备比传统的异硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提法更快、更可靠，因为线虫可直接加入裂解缓冲液中，省去了易降解 RNA 的直接分离步骤；其次，利用纳米流控技术可显著增加同时运行的样本和靶标数量。本文比较了两种芯片：单阵列芯片和多阵列芯片。单阵列芯片可运行 96 条单条线虫和 96 对引物，每次实验可实现 9,216 个反应。若使用标准 qPCR 技术达到类似的通量，则需要使用 96 孔板进行 96 次独立的 qPCR 实验。更小且更灵活的多阵列芯片包含六个 12 × 12 阵列，共产生 864 个反应。该方法的高可靠性与高灵敏度得益于纳米流控技术以及预扩增步骤的引入。本文所述方法旨在与先进的统计学算法结合使用，以提取生物学变异。本文提供了针对单条线虫及批量线虫样本的快速 cDNA 制备和高通量 qPCR 的实验方案；相关算法将另文发表。对于本实验方案，应在实验前预先规划每张芯片的布局。表 1 和 表 2 分别展示了多阵列芯片和单阵列芯片的布局示例。此外，图 1 详细概述了 Worm-to-CT 实验流程，图 2 展示了多阵列和单阵列芯片的操作流程。

方案

注意：在整个实验方案中，Caenorhabditis elegans 均简称为“线虫”或“线虫样本”。多种 C. elegans 品系可通过在线数据库订购，或直接联系使用该模式生物的研究实验室获取。本实验方案的第一部分（第1−3节）描述了通过 Worm-to-CT 方法制备 cDNA 的流程。第二部分（第4−13节）介绍了利用微流控技术进行高通量 RT-qPCR 的操作步骤，该部分改编自 Fluidigm 开发的实验方案16。本方案适用于前述两种微流控芯片：单阵列芯片可对96个样本中的96个靶标进行检测（共9,216个 RT-qPCR 反应）；多阵列芯片则由6个独立的12靶标×12样本子阵列组成，可同时或分别运行。例如，使用完整的多阵列芯片可检测72个靶标×12个样本（或反之），或36个靶标×24个样本（或反之）。有关本实验方案中所用材料的更多信息，请参见材料表。

1. RT-qPCR 引物验证

注意：实时引物的设计基于 MIQUE 指南最初发布的推荐特性17。为使引物特异性针对加工后的 RNA，设计时确保两个引物分别结合于至少一个剪接位点的两侧。合适的引物需满足以下要求：鸟嘌呤和胞嘧啶含量为 20%–80%，熔解温度为 58–60 °C，引物对之间的熔解温度差异 ≤0.5 °C，产物长度为 70–120 bp。所生成引物的序列见补充表 1。用于生成引物的脚本的开源代码可在 https://github.com/s-andrews/wormrtpcr 获取。针对具有剪接位点的转录本设计引物对时，使其位于内含子两侧的两个外显子中，但未设计为剪接变异体特异性，使用的是 NCBI Primer Blast 软件18。在本研究中，将引物组与C. elegans基因组进行比对，以检测是否存在脱靶互补性。

  1. 从RT-qPCR引物数据库中获取引物（补充表1）。或者，使用NCBI Primer Blast18等在线工具设计qPCR引物对。
  2. 采用标准的批量qPCR技术19并遵循MIQUE指南17,20，进行qPCR标准曲线实验，以监测每对引物的特异性和PCR扩增效率。
    注意：仅应使用R2 > 0.98且PCR扩增效率在85%至115%之间的引物对。本研究中所用引物的序列、PCR扩增效率及R2值详见表3。

2. 通过 Worm-to-CT 裂解线虫

  1. 将线虫从其细菌菌苔中挑取至新鲜的未接种NGM平板上，让线虫在平板上移动约5分钟，以通过其活动去除大部分附着的细菌。
    注意：细菌菌苔及培养条件将根据实验设计的不同而有所差异。本实验所用的条件为：在6 cm NGM平板上接种OP50 Escherichia coli，将目标线虫在20 °C培养箱中培养至L4.9期。
  2. 在无RNase的超净台中，为每个样本配制主混合液，包含12.5 µL的2x逆转录缓冲液、1.25 µL的20x逆转录酶缓冲液和0.25 µL的无核酸酶水。将14 µL主混合液加入来自步骤2.8的每个11 µL样本中。
  3. 将PCR条带的盖子倒置放在解剖显微镜的载物台上，在复式显微镜下向凸起的PCR管盖中各加入10 µL裂解液。
    注意：当仅处理一至两个样本时，建议使用至少包含四个管的PCR条带，以降低后续冻融步骤中管盖爆开的风险。或者，也可使用橡皮筋固定管盖。若采用此方法，每次转移管子时均需确保管盖已正确闭合。
  4. 通过“舀取”方式（即用挑虫针从线虫下方将其挑起）将平板上的线虫逐一转移至含有裂解液的管盖中，以避免细菌污染。关闭管盖后，使用台式微量离心机（材料表）离心5秒，随后将样本置于装有液氮的杜瓦瓶中。
    注意：批量实验应使用15至30条线虫，单条线虫实验则使用1条线虫。
    警告：操作液氮时必须佩戴防冻手套和护目镜，并遵守标准防护着装规定，因为液氮接触皮肤或眼睛可导致严重冻伤。
  5. 通过在液氮与约40 °C水浴之间反复转移PCR管，进行10次冻融循环。每次在液氮中至少停留5秒，以确保样本完全冻结；每次在水浴中停留至样本完全解冻即可，不可延长，以免导致RNA降解。
    注意：样本可在液氮中长时间保存，因为其温度可降至约-200 °C，从而减缓RNA降解。但不应将此步骤作为常规暂停点，因为液氮会迅速挥发。
  6. 将样本置于设定为4 °C、转速约1,800 rpm的温控混合仪（材料表）上混匀20−30分钟。
  7. 在样本混匀的同时，将终止液置于冰上解冻。
  8. 使用台式微量离心机（材料表） 将样本离心后，向每管中加入1 µL终止液。
    注意：样本可在-80 °C保存最多1周，之后再进行RNA逆转录（第3节）。

3. 逆转录

注意：对于单条线虫的逆转录，此处展示的结果使用了纳米流控芯片配套试剂盒中的试剂（图1中的选项2）。图1中选项2所标注的试剂也用于混合样本的逆转录。两种方法可互换用于不同类型样本。

  1. 单条线虫的逆转录
    1. 在无 RNase 的超净台中，向新的 PCR 管中加入 1.25 µL 逆转录混合液（材料表）。
      注：若样本数量较多，可使用 96 孔 PCR 板和自动移液器。制造商的说明书中指出，每反应可使用 1 µL 混合液。
    2. 取步骤 2.8 中制备的裂解液与终止液混合物 5 µL，加入含有逆转录混合液的新的 PCR 管中。
      注：制造商的说明书中指出，每反应可使用 1 µL RNA（2.5 pg/μL–250 ng/μL）。可通过将逆转录混合液替换为 5 µL 裂解样本和 1.25 µL 无 RNase 水，为每块板设置一个逆转录阴性对照。
    3. 使用下列逆转录程序在热循环仪中运行样本：25 °C 反应 5 min，42 °C 反应 30 min，85 °C 反应 5 min，4 °C 保存 ∞。
      注：所生成的 cDNA 可在 -20 °C 保存，待后续通过高通量 qPCR 进行扩增与数据采集。
  2. 批量样本（15−30 条线虫）的逆转录
    1. 在无 RNase 的超净台中，为每个样本配制主混合液，每样本包含 12.5 µL 2x RT 缓冲液、1.25 µL 20x RT 酶缓冲液和 0.25 µL 无核酸酶水。将 14 µL 主混合液加入 11 µL 步骤 2.8 中的裂解液与终止液混合物中。
      注：当处理大量样本时，可在 96 孔板中进行。 
    2. 使用下列逆转录程序在热循环仪中运行样本：37 °C 反应 60 min，95 °C 反应 5 min，4 °C 保存 ∞。
    3. 将生成的 cDNA 用无核酸酶水按 1:4 比例稀释。
      注：通常最终体积为 25 µL，此时应加入 75 µL 稀释液。但由于冷凝作用，最终体积可能有所变化，因此应根据实际情况调整，确保最终溶液中达到 1:4 的稀释比例。若对单条线虫进行 qPCR，则无需此稀释步骤。所生成的 cDNA 可在 -20 °C 保存，待后续通过高通量 qPCR 进行扩增与数据采集。

4. 准备多重引物混合液

  1. 为每对引物配制正向/反向（F/R）引物储备液，终浓度为 50 µM。取等体积的 100 µM 正向引物和 100 µM 反向引物混合。
  2. 取 1 µL 50 µM 的 F/R 引物储备液（针对每个待测引物对），加入 DNA 悬浮缓冲液，使总体积达到 100 µL。
    注意：此处引物储备液的浓度与制造商说明书16 中所述不同，但最终浓度仍保持为 500 nM。

5. 靶标特异性预扩增

  1. 配制主混合液，每反应包含 1 µL 预扩增主混合液（材料表）、0.5 µL 混合引物溶液（步骤 4.2）和 2.25 µL 无核酸酶水，并额外增加总体积的 10% 作为富余量。
  2. 在 96 孔板中，根据所需运行的样本数量，向相应数量的孔中分装每孔 3.75 µL 主混合液。
  3. 向每个孔中加入 1.25 µL 在步骤 3.1.3 或 3.2.3 中制备的目标 cDNA 溶液。
  4. 用 96 孔封板膜密封板子，短暂涡旋混匀后，使用台式板式离心机离心。转移至热循环仪并运行以下程序：95 °C 预变性 2 min，随后进行 15 个循环的 95 °C 变性 15 s、60 °C 退火/延伸 4 min，最后 4 °C 保存 ∞。
    注意：试剂制造商建议预扩增反应循环数为 10–20 个16。本方案根据目标基因的表达水平推荐使用 10 或 15 个循环。

6. 外切酶 I 处理

注意：此步骤旨在去除预扩增过程中未结合的引物。

  1. 每样本配制外切核酸酶 I 混合液，包含 0.2 µL 外切核酸酶 I 反应缓冲液（材料表）、0.4 µL 浓度为 20 U/µL 的外切核酸酶 I（材料表）以及 1.4 µL 无核酸酶水。所有试剂均需置于冰上保存，尤其是外切核酸酶 I。
  2. 从热循环仪中取出 96 孔板（步骤 5.4），使用台式板式离心机短暂离心，并小心移除封膜。向每个预扩增反应中加入 2 µL 外切核酸酶 I 混合液。重新封膜后离心，再将 96 孔板放回热循环仪，运行以下程序：37 °C 反应 30 分钟，80 °C 反应 15 分钟，4 °C 保温 ∞。
  3. 从热循环仪中取出样品，加入 18 µL 1x Tris EDTA 缓冲液（材料表）进行 1:5 稀释。
    注意：cDNA 样品可在 -20 °C 保存以供后续使用。根据目标基因的表达水平，制造商建议在此步骤可进行 5 倍、10 倍或 20 倍稀释16。

7. 准备检测反应混合液

注意：可在384孔板中配制检测混合液，因为其孔位间距与纳米流体芯片相同，便于加样。

  1. 为多阵列芯片准备检测混合液
    1. 根据预先制定的方案，为每个孔配制主混合液，包含 2 µL 的 2x 检测加载试剂（材料表）和 1.6 µL 的 DNA 悬浮缓冲液（材料表）。将 3.6 µL 该主混合液分装至 384 孔板的每一孔中。
    2. 根据预先制定的方案，向相应孔中加入 0.4 µL 在步骤 4.1 中配制的 50 µM 正向/反向引物储备液。
      注：每孔检测混合液总体积为 4 µL，其中包含 1 µL 的富余量。
  2. 为单阵列芯片准备检测混合液
    1. 根据预先制定的方案，为每个孔配制主混合液，包含 3 µL 的 2x 检测加载试剂和 2.4 µL 的 DNA 悬浮缓冲液。将 5.4 µL 该主混合液分装至已标记的 384 孔板的每一孔中。
    2. 根据预先制定的方案，向相应孔中加入 0.6 µL 的 50 µM 正向/反向引物储备液。
      注：每孔检测混合液总体积为 6 µL，其中包含 1 µL 的富余量。

8. 准备样品混合液

注意：样品混合液可提前1天配制，并在4 °C下保存。

  1. 为多阵列芯片准备样品
    1. 每份样品准备含有 2 µL 的含低 ROX 荧光探针预混液（材料表）和 0.2 µL 样品试剂（材料表）的样品主混合液。将 2.2 µL 该混合液加入标记好的 384 孔板中。
      注：制造商建议不要对样品试剂进行涡旋震荡16。
    2. 根据预先设计的方案，将步骤 3.2.3 中获得的每份经预扩增并用核酸外切酶 I 处理的样品各 1.8 µL 加入相应孔中。
      注：总体积为 4 µL，多余 1 µL。
  2. 为单阵列芯片准备样品
    1. 每份样品准备含有 3 µL 的含低 ROX 荧光探针预混液（材料表）和 0.3 µL 的 20 倍 DNA 结合染料样品上样试剂（材料表）的样品主混合液。将 3.3 µL 该混合液加入标记好的 384 孔板中。
    2. 根据预先设计的方案，将步骤 6.3 中获得的每份经预扩增并用核酸外切酶 I 处理的样品各 2.7 µL 加入相应孔中。
      注：总体积为 6 µL，多余 1 µL。若有不加样品的孔，则必须用样品主混合液和 2.7 µL 水代替 cDNA 上样。此操作建议适用于两种芯片类型。仪器需要每个入口均含有低 ROX，以检测芯片的网格结构。

9. 纳流控芯片的引物预处理

注意：多阵列芯片仅在首次运行时需要进行预启动。如果后续继续使用同一芯片运行，则可跳过此步骤。这两种芯片类型的这些步骤均相同。

  1. 缓慢而小心地将随附注射器中的全部150 µL控线液注入芯片的蓄液池中。操作时将芯片保持在45°角，并将注射器尖端远离芯片，避免液体接触芯片表面，防止溢出。
  2. 移除芯片底部的蓝色保护膜。
  3. 将芯片放入纳米流体PCR预启动仪中（材料表），条形码朝外。运行“Prime (153x)”程序，该过程约需15–20分钟。
    注意：此时应开启纳米流体热循环仪（材料表），因为相机需要约10分钟时间冷却至0 °C以下。

10. 加载纳米流体芯片

  1. 在加样过程中依次移除屏障塞，以减少加样错误的风险。
  2. 根据预先制定的方案，将每种引物检测混合液和样品混合液分别转移至纳米流体芯片对应的入口，多阵列芯片加 3 µL，单阵列芯片加 5 µL。确保避免引入气泡，否则可能导致实际转移体积小于预期。
    注意：如果某些反应孔无需添加引物，则必须用等体积的水替代引物，同时仍加入主混合液。此要求适用于两种类型的芯片。在此步骤中，可将芯片置于深色表面，以便更清晰地观察反应孔。

11. 运行纳米流体芯片

注意：首次运行多阵列芯片时，需通过选择工具 | Flex Six 使用追踪来设置追踪文件，点击新建，输入文件名，并选择保存位置，然后点击完成。

  1. 打开数据采集软件。点击 开始新运行。将已加载的芯片放入纳米流体热循环仪中，条形码朝外。
  2. 如有必要，选择项目设置，然后点击 下一步 | 加载。若加载多阵列芯片，请选择要运行的分区（阵列）。
  3. 选择应用 参考探针，然后将应用类型更改为 基因表达，并将被动参考设为 ROX。选择 单探针检测，将探针类型更改为 Eva Green，然后点击 下一步。
  4. 选择热循环程序 GE FLEX six Fast PCR+Melt v1 以运行多阵列芯片，或选择程序 GE 96.96 Fast PCR+Melt v2 以运行单阵列芯片。
  5. 确认已选中 自动曝光，然后点击 开始运行。

12. 芯片运行后处理

注意：仅当未使用整个芯片时，此步骤对于多阵列芯片才必要。

  1. 从纳米流体热循环仪中取出芯片，装载到纳米流体PCR预加载仪器中，运行“Post Run (153x)”程序，持续5分钟。
  2. 对插头进行标记，以便个人参考。
    注意：芯片现在可在室温下保存，且芯片上剩余的阵列可在2个月内继续使用。

13. 数据清理与分析

  1. 在“实时 PCR 分析”软件中打开数据（材料表）。检查每对引物的熔解峰温度。对于特定引物对，若出现多个熔解温度峰，则剔除相应结果。
    注意：多个峰仅偶尔出现，推测是由于引物对形成二聚体，或目标引物与混合引物池中其他引物发生相互作用所致。
  2. 将数据导出为“热图”电子表格文件，并剔除失败的样本或引物。
  3. 采用标准的 Delta-Ct 法分析数据21。对相对表达水平进行单因素方差分析（one-way ANOVA）以进行统计学评估。

结果

验证 Worm-to-CT 作为一种 cDNA 制备方法

为了验证Worm-to-CT方案是否是一种有效的cDNA提取方法，将其与标准的硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法进行了比较。图3展示了实验结果，其中cDNA分别由约1,000条线虫采用标准的硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取技术制备22，以及由30条线虫采用Worm-to-CT方法制备。样品同时进行了热激处理（34 °C下30分钟）。总体而言，使用两种方法每100 ng总RNA中hsp-70 mRNA的表达水平相近。然而，在hsp-70表达最高情况下（即N2品系经热激后），Worm-to-CT方法检测到的表达水平更高，表明其具有更高的灵敏度。

为了验证在hsf-1(sy441)23中是否可重复观察到分子伴侣主要转录调控因子突变体中hsp表达预期下降的现象23,24，我们比较了短暂热激后转录水平伴侣蛋白的诱导情况。两种方法均检测到hsf-1(sy441)动物中hsp-70诱导水平下降。这一结果符合预期，因为hsf-1(sy441)突变体动物由于HSF-1反式激活域发生截短，诱导伴侣蛋白的能力降低。与对照组相比，硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法中hsp70表达下降了82.7%，而Worm-to-CT法与野生型动物相比下降了92.3%（图3）。两种方法的结果具有可比性，且与先前报道的结果一致23。这些结果表明，Worm-to-CT方法是标准cDNA合成技术的一种有效替代方案。

用于扩增 mRNA 靶标的纳米流体 PCR 平台的验证

为检验使用纳米流控qPCR进行转录扩增结果的一致性，将Worm-to-CT整体方法获得的PCR结果在标准qPCR系统上进行了比较材料表）以及使用多阵列芯片的纳米流体 qPCR 系统。三种不同基因表达水平的变化倍数， sma-3 (图 4A), sma-10 (图4B），以及 dnj-26，进行监测（图 4C在携带无效等位基因的动物中 dbl-1 (dbl-1(nk3))25 与野生型对应物相比Dbl-1 编码骨形态发生蛋白（BMP）信号通路的唯一配体。 sma-3 和 sma-10 是编码SMAD同源蛋白的基因，为BMP信号通路的关键组分。 Dnj-26 编码一种分子伴侣蛋白，是BMP信号通路的作用靶点。这些结果表明，两种方法在倍数变化上的比较差异极小或无差异，对应的P值分别为0.3113、0.2635和0.3481，均无统计学显著性。 sma-3, sma-10，以及 dnj-26综上所述，这些结果表明，将 Worm-to-CT 方法应用于批量样本时，是一种从少量蠕虫中高效、快速提取 RNA 的有效手段，并且无论与常规 PCR 系统还是高通量纳米流控 qPCR 平台联用，均可提供可靠的数据。

批量样本获得的表达水平与单条蠕虫平均值之间的比较

相对表达水平是使用来自批量样本（25条线虫）的cDNA或来自平均36个单条线虫样本的cDNA计算得出的（图5）。两种cDNA均采用Worm-to-CT方法获得，并通过纳米流体PCR技术进行扩增。如图5A–C所示，对于所有检测的分子伴侣（即hsp16.1、F44E5.4、hsp-70），两种方法检测到的表达水平相当。这些结果表明，从单条线虫获得的参数是可靠的。

应用蠕虫到CT结合纳米流控技术估算单个蠕虫基因表达参数

由于单阵列芯片可在96个独立样品上同时检测多达96种目标转录本，因此非常适合用于监测单条线虫之间转录本表达的个体差异。图6A展示了一个代表性结果，显示了单条线虫在短暂热激后多个hsp转录本的平均表达水平。如图所示，不同基因的转录本表达变异程度存在显著差异（图6A）。为了进一步分析，通过将表达水平的标准差除以均值来计算变异系数（CV）26（图6B）。本研究检测了三个此前已通过其他方法估算了CV值的基因（未发表数据）。其中两个稳定转录本（ife-1和Y45F10D.4）和一个可变转录本（nlp-2927）表现出预期的变异特征。该图还清晰地展示了已知的变异值与表达水平之间的负相关关系26（图6B）。

在使用批量样本时，技术重复对于确保可重复性至关重要。然而，在单细胞实验中情况并非一定如此14,15,28。为了确定在使用单个线虫样本时，技术重复是否对参数估计有必要，研究人员在短暂热激后收集了28条单独的线虫，并对每一样本进行技术重复三次的处理。将三次技术重复获得的单条线虫数据计算得到的变异系数（CV值）（图7中的蓝色圆点，技术CV）与来自单个线虫的每条转录本的CV值（图7中的红色圆点，生物学变异性）进行比较。对于每一条检测的转录本，技术CV均低于生物学CV，表明在参数估计时无需进行技术重复。技术重复的非必要性有助于提高实验通量，同时不牺牲数据质量。

线虫至CT流程图；线虫裂解、逆转录、cDNA合成的PCR设置；实验步骤。
图1：线虫至CT流程的概览。
本图简要展示了通过线虫至CT流程所需的不同步骤。逆转录步骤展示了两种可选方法；这些方法在任一类型的芯片上均可互换使用。请点击此处查看此图的放大版本。

Biomark 系统概述；多阵列、单阵列芯片流程；PCR；热循环仪示意图。
图 2：纳米流控 qPCR 实验的准备与运行概览。
本图展示了使用多阵列芯片和单阵列芯片进行纳米流控 qPCR 系统运行前的准备工作。请点击此处查看该图的放大版本。

hsp-70 mRNA 表达水平柱状图；热休克蛋白分析；苯酚-氯仿法，worm-to-Ct 方法。
图 3：对大量样品采用 worm-to-CT 方案可获得可靠结果。
worm-to-CT 方案与常规硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法22在大量样品上的比较。与先前研究结果一致，在 hsf-1(sy441) 突变体23中，热休克诱导的 hsp 转录本水平下降。上述直方图显示了在无 (-) 或经 (+) 34 °C 短时热休克 30 分钟后 hsp-70 的诱导情况。cDNA 通过硫氰酸胍-苯酚-氯仿法从 1,000 条线虫中提取（左），或通过 worm-to-CT 法从 30 条混合线虫中提取（右）。比较了每 100 ng 总 RNA 所得的 hsp-70 表达水平。如预期所示，在 hsf-1(sy441) 突变体中，热休克诱导的 hsp-70 转录水平分别下降了 82.7%（硫氰酸胍-苯酚-氯仿法）和 92.3%（worm-to-CT 法）。目的基因的 mRNA 水平以三个看家基因 cdc-42、pmp-3 和 ire-1 的平均值进行标准化。每个点代表一个生物学重复。由于数据不符合参数分析的前提条件，因此在统计分析前进行了对数转换。统计分析采用带 Sidak 多重比较检验的重复测量单因素方差分析（RM-One-way ANOVA）。野生型 = N2，hsf-1 = hsf-1(sy441)。柱状图上的误差线表示均值的标准误。请点击此处查看该图的放大版本。

Bar charts comparing qPCR and Multi-Array Chip results for sma-3, sma-10, dnj-26 mRNA expression.
图4：标准qPCR与纳米流体qPCR系统之间的表达模式具有一致性。
(A) 表达水平 sma-3 （A）， sma-10 （B）或 dnj-26 (C) 通过野生型菌株（N2）以及三个生物学重复的cDNA样本，采用常规qPCR和纳米流控qPCR（多阵列芯片）检测mRNA水平，cDNA由Worm-to-CT法生成 dbl-1(nk3) 敲除菌株25采用ΔCt法测定各菌株的相对mRNA表达水平21. 然后通过将获得的表达水平相除来确定倍数变化 dbl-1(nk3) 通过N2品系中相应的mRNA水平对线虫进行分析。如图中所示 A，两种方法在每个独立的生物学重复中均表现出一致的模式。B）和（C）与（A）用于 sma-10 和 dnj-26 mRNA 水平。靶标 mRNA 水平经看家基因标准化后进行分析 cdc-42 和 pmp-3采用配对t检验对标准qPCR和纳米流体qPCR分别产生的三个生物学重复结果进行统计分析，每个基因的P值分别为0.3113、0.2635和0.3481 sma-3, sma-10，以及 dnj-26分别。 请点击此处以查看此图的放大版本。

Bar graphs comparing relative mRNA levels for hsp-16.1/11, F44E5.4, hsp-70 in worm samples.
图5：将Worm-to-CT方法用于批量样本或单条线虫时，在按每条线虫归一化后，其表达水平相似。
表达水平的（A) hsp-16.1/11, (B) F44E5.4，以及（C) hsp-70 （C12C8.1）在未进行热激的年轻成年动物中进行分析，采用对25条线虫的群体样本进行Worm-to-CT检测，或对36个单条个体分别检测。当数据按每条线虫归一化后，两种方法所得每条线虫中各转录本水平之间无显著差异。目标基因的mRNA水平以三个看家基因的平均值为参照进行归一化处理。 cdc-42，pmp-3，和 ire-1条形图表示均值的标准误。统计方法：配对t检验。 请点击此处以查看此图的放大版本。

热激蛋白表达水平、mRNA 图表、CV 散点图、短时热激分析。
图 6：利用 Worm-to-CT 方法对单条线虫进行高通量 RT-qPCR 检测，可监测基因表达的个体间差异。
(A) 经短时热激处理（34 °C 下持续 30 分钟）后，53 个转录本的平均表达水平。箱形图表示来自单条线虫的平均 mRNA 表达分布情况（每条线虫使用三次技术重复的平均值）。圆点代表 28 条单条线虫中的表达水平。目标基因的 mRNA 水平以三个看家基因 cdc-42, pmp-3 和 ire-1 的平均值进行标准化。(B) 在短时热激处理后，基于 28 只单个动物计算出的 53 个转录本的变异系数26（CV）与平均 mRNA 表达水平之间的关系（原始数据见图 B）。该转录本集合包括表达可变的转录本 nlp-2927 以及两个表达稳定的转录本（ife-1 和 Y45F10D.4；未发表数据）。CV 是标准差与均值的比值。该 CV 用于估计单条线虫之间转录本表达的个体间变异性。如预期所示，个体间变异性随平均表达水平的降低而增加。请点击此处查看该图的放大版本。

变异系数散点图；技术变异与生物变异数据分析。
图7：使用纳米流体芯片分析基因表达的个体间变异性时，无需进行技术重复。
本图所示数据来自经历短暂热激（34 °C下30分钟）后的28条个体线虫。每个红色圆点代表在28条个体线虫之间检测的一种转录本的平均转录水平的变异系数（CV）（生物CV）。每个蓝色圆点代表每种检测转录本在单条线虫中获得的三个技术重复之间的表达水平变异系数（技术CV）。该图显示，技术变异性（技术重复之间）远低于生物变异性（个体线虫之间），这表明在对单条线虫进行基因表达检测时，类似于单细胞研究，无需在纳米流体基因表达芯片上进行技术重复14,15,28。请点击此处查看此图的放大版本。

表1：多阵列芯片的布局方案。 上表展示了一种在规划多阵列芯片运行时可采用的简单布局。左侧区域应填入感兴趣的引物靶标，右侧区域应填入感兴趣的样本。每个检测和样本阵列在芯片上按编号一一对应。请点击此处下载该表格。

表2：单阵列芯片的布局方案。 上表展示了一种在规划单阵列芯片实验时可采用的简单布局。左侧位置应填入感兴趣的引物靶标，右侧位置应填入感兴趣的样本。请点击此处下载该表格。

表3：本研究中使用的RT-qPCR引物列表。 请点击此处下载该表格。

补充表1：来自RT-qPCR引物数据库的引物。 请点击此处下载该表格。

讨论

本文表明，Worm-to-CT 方案是一种从单条线虫或少量线虫中快速高效提取 RNA 的方法。纳米流控系统所提供的高通量特性使其非常适合用于个体间变异程度的定量分析。此外，该方法的高灵敏度能够检测到低水平表达的基因，而这些基因在使用单虫 RNA 测序技术时通常低于检测限9。

在考虑从单条线虫制备 cDNA 的方法选择时，Ly 等人29 优化了一种依赖蛋白酶 K 消化角质层的方案。角质层是提取线虫分子的主要障碍，而蛋白酶 K 可有效破坏该结构。然而，使用逆转录酶前必须对蛋白酶 K 进行热失活。Ly 等人采用在 96 °C 下加热 10 分钟的方法，但本方案避免了这一步骤，因为 RNA 极易降解。本方案未使用蛋白酶 K，而是采用反复冻融循环来破坏角质层。冻融法是一种有效的角质层破裂方法，可从每条线虫中提取更多的 RNA。Ly 等人报告称，使用蛋白酶 K 时每条线虫提取的总 RNA 为 35 ng，而本方案每条线虫可获得 51.75 ng ± 6.74 SEM 的总 RNA。避免加热处理并结合预扩增步骤，显然使 Worm-to-CT 方法相比标准方案具有更宽的检测动态范围。Ly 等人在热激后报告的 hsp-16.2 和 hsp-70 的绝对 Ct 值分别为 21.1 ± 0.15 和 22.8 ± 0.17；而在相同的热激条件（30 °C 下 1 小时）下，本方案获得的 hsp-16.2 和 hsp-70 的绝对 Ct 值分别为 17.93 ± 0.57 和 21.13 ± 0.33。这表明冻融裂解法可获得更高的 RNA 产量，更适合低丰度转录本的检测。

当研究一组特定的目标转录本时，纳米流控系统非常理想，其既可使用较小规模（多阵列芯片）也可使用较大规模（单阵列芯片）的样本数量，从而可根据实验规模灵活调整。若要全面无偏地获取单个线虫中所有表达转录本的情况，显然应选择RNA测序。然而，如果实验关注的是一个相对较多但仍属有限的目标基因集合，且研究人员能够使用纳米流控PCR仪器，则采用本方案更具成本效益。纳米流控系统试剂与单阵列芯片的成本预计约为 £每条线虫13美元，而单条线虫测序所需的试剂成本约为 £每条线虫60，不包括测序费用。

在选择PCR平台时，Worm-to-CT方法结合纳米流体qPCR在时间和通量方面具有优势。使用该方法可在约2天内获得9,216个RT-qPCR结果，而若采用标准qPCR平台，以每天运行4块96孔板计算，扩增相同数量的目标则需要约5个工作日。然而，若待检测的目标数量较少，则将Worm-to-CT与标准qPCR仪器结合使用更具成本效益。单阵列芯片无法重复使用，因此运行空孔会降低成本效益。

该方法的一个局限性是在多重扩增步骤中可能形成引物-引物二聚体，但这种情况的发生率低于1%。尽管Worm-to-CT方案在应用于单条线虫时效率高且结果可靠，但仍存在约5%的失败率，这很可能对应于在收获步骤中线虫滞留在帽盖或管子顶部的情况。

综上所述，这种多功能且可靠的方法相较于更常规的技术，具有更高的通量和灵敏度。该方法对于高通量筛选的验证非常有用，也是监测或验证单条线虫基因表达水平的理想选择。该方法还可应用于其他具有挑战性的技术，例如对分离组织中的基因表达进行定量分析。例如，分离完整的组织（如肠道、性腺）或通过流式细胞术（FACs）分离的细胞，可获得足以进行RNA测序实验的材料。然而，由于材料量有限，往往会导致读段重复，从而无法对低丰度转录本进行准确定量。在此情况下，采用基于纳米流控技术的方法可提高实验的检测灵敏度，若研究人员仅需监测这些组织或细胞中部分转录本的表达水平，则还可提升实验的成本效益。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Sharlene Murdoch和Babraham研究所设施提供的支持。JLP由Wellcome Trust（093970/Z/10/Z）资助，OC由ERC 638426和BBSRC [BBS/E/B/000C0426]资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
目的基因的100µM引物储备液。
20X DNA结合染料Fluidigm100-7609用于96.96芯片（单芯片）
2X 引物加载试剂Fluidigm100-7611
384孔板
8联排PCR管
96孔冰块
96孔板
96.96动态阵列IFCFluidigmBMK-M-96.96全文中均称为"单芯片"
96孔封板膜
BioMark & EP1 软件Fluidigm101-6793包含：Biomark HD数据采集软件、实时PCR分析软件、SNP基因分型分析软件、数字PCR分析软件、熔解曲线分析软件
BioMark 或 BioMark HD 系统Fluidigm100-2451 K1全文中均称为"纳米流体热循环仪"
96.96和FlexSix IFC用控制通道流体试剂盒Fluidigm89000021全文中均称为"控制通道流体"
DNA悬浮缓冲液TEKnovaT0021
拱形PCR盖
外切酶INew England BioLabsM0293L
外切酶I反应缓冲液New England BioLabsB0293S
FLEXsix DELTAgene 样品试剂Fluidigm100-7673全文中均称为"样品试剂"
FLEXsix 基因表达IFCFluidigm100-6308全文中均称为"多芯片"
Fluidigm 实时PCR分析用户指南Fluidigm68000088本方案第2部分所依据的协议，文中已引用。
IFC控制器MXFluidigm68000112 I1全文中均称为"纳米流体PCR预加载仪器"
IFC控制器软件Fluidigm100-2297包含运行IFC控制器MX所需的所有软件和脚本
杜瓦瓶中的液氮
微量离心机StarLabC1301B-230V用于本方案中离心PCR管排。
无核酸酶水
板式离心机LabnetK4050725小型板式离心机，mps 1000。本方案中称为"台式板式离心机"
Power SYBR Green Cells-to-Ct试剂盒invitrogen4402955本试剂盒已针对线虫在Worm-to-CT方案中进行了优化。内容物：储存终止溶液、DNase I和20X RT酶混合物于-20°C。储存裂解液、2X SYBR RT缓冲液（全文中称为RT缓冲液）以及Power SYBR®Green PCR主混合液（全文中称为PCR主混合液）。本试剂盒适用于400次反应，亦有适用于40次和100次反应的试剂盒。
预扩增主混合液Fluidigm100-5580, 100-5581
逆转录主混合液—480次反应Fluidigm100-6299另有一管装适用于96次反应（货号100-6298）
无RNase水
SsoFast EvaGreen Supermix（含低ROX）Bio-Rad Laboratories172-5211全文中均称为"荧光探针supermix"
标准96孔和384孔热循环仪
TE缓冲液（10 mM Tris，pH 8.0，1.0 mM EDTA）TEKnovaT0224全文中均称为Tris-EDTA缓冲液
ThermoMixer CEppendorf5382000031全文中均称为"温控混匀仪"
TrizolThermo-Fisher15596026本方案中称为"硫氰酸胍-苯酚-氯仿"
温水浴

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RT qPCR Worm to CT cDNA I
利用纳米流体技术在单个及批量 C. elegans 样本中进行高通量定量 RT-PCR
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