Linha de worm e Worm_CP, dois gasodutos de código aberto para endireitar e quantificação de dados de imagem fluorescência obtidos de elegans caenorhabditis

Resumo

Worm-align/Worm_CP é um simples fluxo de trabalho FIJI/CellProfiler que pode ser usado para endireitar e alinhar amostras de elegans de Caenorhabditis e para marcar ensaios baseados em imagens de vermes inteiros sem a necessidade de etapas de treinamento prévias. Aplicamos o alinhamento/Worm_CP de vermes à quantificação da expressão induzida por choque de calor em animais vivos ou gotículas lipídicas em amostras fixas.

Resumo

Um problema frequentemente encontrado ao adquirir dados de imagem de C. elegans fixos ou anestesiados é que os vermes cruzam e se agrupam com seus vizinhos. Esse problema é agravado com o aumento da densidade de vermes e cria desafios para a imagem e quantificação. Desenvolvemos um fluxo de trabalho baseado em FIJI, worm-align, que pode ser usado para gerar montagens de um ou vários canais de worms selecionados pelo usuário, endireitados e alinhados a partir de dados de imagem bruta de C. elegans. Worm-align é um fluxo de trabalho simples e fácil de usar que não requer treinamento prévio do usuário ou do algoritmo de análise. Montagens geradas com worm-align podem auxiliar na inspeção visual de vermes, sua classificação e representação. Além disso, a saída do Worm-align pode ser usada para quantificação subsequente da intensidade da fluorescência em worms únicos, seja em FIJI diretamente ou em outras plataformas de software de análise de imagem. Demonstramos isso importando a saída de alinhamento worm para Worm_CP, um pipeline que usa o software CellProfiler de código aberto. A flexibilidade do CellProfiler permite a incorporação de módulos adicionais para triagem de alto conteúdo. Como exemplo prático, usamos o pipeline em dois conjuntos de dados: o primeiro conjunto de dados são imagens de worms repórteres de choque térmico que expressam proteína fluorescente verde (GFP) sob o controle do promotor de um gene indutível de choque térmico hsp-70, e o segundo conjunto de dados são imagens obtidas de vermes fixos, manchados para lojas de gordura com um corante fluorescente.

Introdução

Um organismo relativamente simples, o nematode C. elegans,é um sistema modelo extremamente útil para estudar doenças humanas. Cerca de 38% dos genes do genoma de C. elegans têm contrapartes funcionais em humanos^1,2. Uma das características únicas de C. elegans é que ele é opticamente transparente, permitindo fácil acesso a informações in vivo sobre (sub) expressão celular de repórteres fluorescentes através de tecidos. Isso faz da C. elegans um organismo modelo principal para telas de alto conteúdo usando plataformas baseadas em imagem³. No entanto, uma questão que muitas vezes complica esses estudos é que, quando imagens densas populações de vermes, elas tendem a se cruzar e agrupar, fazendo comparações entre vermes individuais desafiando, ofuscando a análise de imagens a jusante e a quantitação.

As soluções existentes que superam esse problema normalmente dependem da otimização do protocolo de cultivo e imagem, como através do uso de configurações micro fluidicas⁴, permitindo que worms únicos sejam capturados em imagens separadas^5,6. Outros aplicaram algoritmos de aprendizagem de máquina permitindo o reconhecimento de vermes únicos, mesmo em uma população desajeitada. Um excelente exemplo deste último é o WormToolbox, que é uma extensão modular da plataforma de análise de imagem de código aberto, CellProfiler⁷. O WormToolbox oferece uma solução de alto rendimento e alto conteúdo para análise de C. elegans, e claramente se beneficia de sua inclusão no CellProfiler, pois módulos de análise adicionais podem ser facilmente incluídos. Embora o WormToolbox venha fornecido com um modelo pré-treinado (DefaultWormModel.xml), a requalificação do algoritmo de aprendizagem de máquina é geralmente necessária para cada nova aplicação. Tutoriais online sobre como fazer isso estão disponíveis no Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). Apesar disso, instalar e usar o WormToolbox requer um investimento significativo para usuários iniciantes.

Aqui, descrevemos um protocolo simples e econômico e de tempo efetivo para a cultura, e populações de imagens de C. elegans. Para permitir a avaliação de worms individuais nas imagens adquiridas, desenvolvemos um simples fluxo de trabalho baseado em FIJI de código aberto, chamado Worm-align. O worm-align pode ser usado para gerar montagens de worms endireitados e alinhados. Em primeiro lugar, o usuário deve selecionar manualmente worms individuais para análise, desenhando uma linha da cabeça para a cauda. O worm-align usará essa seleção para cortar worms selecionados a partir da imagem de visão geral e gerar uma montagem na qual os worms selecionados são endireitados e alinhados para facilitar a comparação visual e a apresentação.

Além disso, a saída do Worm-align pode ser usada para quantificação subsequente da intensidade da fluorescência em worms únicos, seja em FIJI diretamente ou em outras plataformas de software de análise de imagem. Demonstramos isso importando a saída de alinhamento worm para Worm_CP, um pipeline que usa o software CellProfiler de código aberto. A flexibilidade do CellProfiler permite a incorporação de módulos adicionais para triagem de alto conteúdo. Usamos o Worm_CP pipeline para quantificar a resposta ao choque térmico, um mecanismo de proteção bem conservado que repatos proteínas que são mal dobradas devido a estressores como alta temperatura⁸. Especificamente, aplicamos o gasoduto a vermes que transportam um transgênico multi-cópia integrado, onde o promotor de um gene indutível de choque térmico, hsp-70(C12C8.1), conduz proteína fluorescente verde (GFP)⁹. Também usamos o Worm_CP pipeline em animais fixos que foram rotulados com um corante fluorescente que visualiza gotículas lipídicas (LDs), a principal organela de armazenamento de gordura em C. elegans¹⁰. Embora este fluxo de trabalho não tenha o throughput oferecido pelo WormToolBox, é uma alternativa fácil e simples para apresentação visual e análise de experimentos C. elegans baseados em imagem.

Protocolo

1. Fixação de worms para imagem de teor de gordura usando um corante fluorescente para gotículas lipídicas (BODIPY)¹⁰

1. Prepare uma população sincronizada de C. elegans branqueando de acordo com os procedimentos padrão². Placa de cerca de 1.000 vermes de estágio L1 em uma placa de 9 cm de mídia de crescimento de nematoides (NGM) por condição.
   NOTA: Mais vermes são preparados do que realmente quantificados no final, devido à perda de vermes ao manusear.
2. Para imaginar animais em estágio adulto jovem (cerca de 50h pós L1 emplacando a 20 °C), lave cada placa de 9 cm com 15 mL de M9 em um tubo cônico, centrífuga a 252 x g por 1 min, e remova o supernascido.
3. Repita a lavagem e deixe 1 mL de M9 sobre a pelota de vermes.
4. Transfira 1 mL de M9 contendo os vermes em um tubo de microcentrifuge de baixa proteína de 2 mL, usando pontas de baixa retenção.
5. Gire a 252 x g em um microcentrifuuge por 1 min e remova o supernascer, tomando cuidado para não tocar na pelota de verme na parte inferior do tubo.
6. Para monitorar o teor de gordura usando 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY)^{coloração 0ma10} (Tabela de Materiais), fixar vermes adicionando 0,5 mL de isopropanol de 60% à pelota de verme por 3 min¹¹, ou adicionando 2 mL de metanol gelado por 10 min. Para ambos os procedimentos, inverta o tubo a cada 30 s.
   ATENÇÃO: Se o metanol for o reagente de fixação escolhido, esta etapa deve ser realizada em um capô de fumaça devido à sua toxicidade.
7. Remova o máximo de fixação possível sem tocar na pelota de minhoca e adicione 1 mL de M9. Deixe os vermes se estabelecerem no fundo do tubo por 3-5 min.
8. Lave novamente com 1 mL de M9, deixe os vermes se acalmarem e remova o supernante, deixando cerca de 50 μL no tubo. Fixar o tubo usando um grampo.
9. Congele os vermes mergulhando o tubo seguramente fechado em nitrogênio líquido e, em seguida, em um banho de água quente a ~40 °C.
10. Repita o passo 1.9 mais uma vez.
11. Adicione 0,5 mL de BODIPY diluído em M9 em uma concentração final de 1 μg/μL e coloque em um rotador em temperatura ambiente por 1h.
12. Depois de 1h, deixe os vermes se estabelecerem no fundo do tubo por 3-5 min.
13. Remova o supernaspe e adicione 1 mL de M9.
14. Deixe os vermes se estabelecerem na parte inferior e remover supernaspe.
    NOTA: Alternativamente, é possível girar a 252 x g por 1 min, pois isso não parece afetar a morfologia.
15. Adicione 0,5 mL de M9.
    NOTA: Se o fixador for 60% isopropanol, os vermes só podem ser utilizados dentro de 48 h. Se o fixador for metanol, os vermes devem ser utilizados dentro de 24h.

2. Preparando almofadas de ágarose para montar os vermes

NOTA: O passo crítico durante a preparação de uma almofada de agarose é obter uma almofada de espessura regular. Caso contrário, os vermes através da plataforma estarão em diferentes planos focais, tornando difícil obter uma imagem focada de um campo de visão mais amplo.

1. Prepare 2% de almofadas de agarose adicionando 0,2 g de agarose a 10 mL de H₂O esterilizado em um béquer ou um frasco cônico. Aqueça no micro-ondas por 30 s até que a agarose comece a ferver.
   NOTA: Não superaqueça e pare assim que as bolhas aparecerem; caso contrário, aumenta a viscosidade da agarose tornando mais difícil alcançar a espessura desejada da almofada.
2. Uma vez que a agarose seja derretida, dispense uma gota de agarose derretida no centro de um deslizamento de vidro microscópio usando uma ponta de pipeta de 1000 μL com seu corte muito final. Imediatamente, mas delicadamente, segure outro deslizamento de vidro muito perto da gota de agarose e solte-o sobre a agarose para formar uma almofada de espessura regular para melhores resultados de microscopia.
   NOTA: Liberar o slide superior de uma altura não só formará bolhas, mas resultará em uma almofada irregular. Alternativamente, também é possível usar dois slides de vidro flanqueando o slide com a almofada, com uma fina camada de fita em cada slide.
3. Após um mínimo de 2-3 min, remova suavemente o slide superior. Usando a lateral do slide superior, corte a almofada para torná-la em forma quadrada. Monte os vermes dentro de 5 minutos, para evitar que a almofada seque antes do uso.

3. Montagem de worms fixos para imagem

1. Crie uma micropipette bucal estendendo um capilar de vidro fino na chama de um queimador de Bunsen(Figura 1A). Após a extensão da chama, quebre o capilar em dois pedaços(Figura 1B). Escolha o mais adequado, geralmente o mais longo, e teste se a extremidade do capilar está aberta tentando aspirar água.
   NOTA: Se o líquido não entrar no capilar, ele está muito fino ou bloqueado. Corte suavemente a extremidade do capilar com um par de tesouras, evitando cortar muito, pois os vermes serão aspirados se o buraco for muito grande.
2. Conecte o capilar de vidro da etapa 3.1 ao adaptador capilar(Figura 1C),ligado ao tubo de silicone de 6 mm e conecte a outra extremidade do tubo de silicone de 6 mm em um filtro de 0,2 μm, ligado a um tubo de silicone de 3 mm na outra extremidade(Figura 1C). Conecte uma ponta de filtro de 1 mL(Figura 1C) na extremidade livre do tubo de silicone de 3 mm para aspirar líquido.
   NOTA: O filtro de 0,2 μm é adicionado entre a boca do experimentador e o capilar, para garantir a máxima segurança do experimentador. Uma solução semelhante é usada para micropipettos bucais usados para lidar com embriões de camundongos¹². Altere o filtro (geralmente a cada poucos meses) se a micropipette bucal não estiver mais aspirando líquido.
3. Usando a micropipette bucal sob um microscópio de dissecção, remova o máximo de líquido possível ao redor da pelota de vermes fixos(Figura 2).
   NOTA: A tubulação supernascera usando uma micropipette manual pode ser usada como alternativa às pipetas da boca nas etapas 3.1 a 3.3 para remover o máximo de supernascer possível. Adicione 6 μL de meio de montagem. Descobrimos, no entanto, que esse método não funciona tão eficientemente porque o excesso de líquido nas almofadas cria uma densidade de vermes esparsas, o que torna a imagem mais demorada. Retomar a etapa 3.6. Olhe para a parte inferior do tubo e certifique-se de que a pipeta não aspira os vermes.
4. Adicione rapidamente 10 μL de meio de montagem(Tabela de Materiais) à parte inferior do tubo.
5. Enxágüe uma ponta de 10 μL em PBS com traços de detergente (Tritão 0,01%), para evitar que os vermes grudem nas laterais da ponta de pipeta plástica. Corte a ponta da ponta com uma tesoura.
6. Transfira 8 μL de meio de montagem contendo os vermes na almofada de agarose preparada na etapa 2.3. Sob o microscópio, agite suavemente o slide, para evitar a sobreposição dos vermes.
7. Cubra a gota do meio de montagem na almofada de agarose com um deslizamento de cobertura de 18 mm x 18 mm(Figura 3).
   NOTA: As tampas menores são preferidas, pois exercem menos pressão sobre os vermes. Segure a tampa com um par de pinças e aplique uma borda da tampa contra a almofada de agarose, antes de depositar suavemente a tampa com a pinça.

4. Montagem de vermes vivos para imagens

NOTA: Para imaginar vermes vivos, eles têm que ser imobilizados na almofada. Uma maneira de conseguir isso é paralisá-los com o agonista receptor nicotinático: levamisole (Tabela de Materiais).

1. Pipeta 3−4 μL de 3 mM levamisole dissolvido em M9 na almofada de agarose criada na etapa 2.3.
   NOTA: Deve haver volume líquido suficiente para que os vermes não estejam em cima uns dos outros, mas não muito líquido que os vermes sejam muito escassos na almofada. Catadores de vermes experientes podem usar 3 μL de levamisole. Catadores menos experientes podem precisar adicionar um volume maior de levamisole, para que o levamisole não evapore totalmente.
2. Escolha 30-50 vermes por condição na gota de levamisole.
3. Cubra a gota de levamisole na almofada de agarose com uma tampa de 18 mm x 18 mm. Vermes de imagem dentro de 1 h, como o agente paralisante eventualmente levará à morte dos vermes.

5. Slides de imagem com um microscópio de epifluorescência

1. Com uma almofada de espessura uniforme, imagem todos os vermes no slide de uma só vez usando uma imagem grande 6 x 6 ou 7 x 7, por exemplo, com o objetivo de 20x de um microscópio fluorescente. Se a espessura do bloco não estiver uniforme, adquira várias imagens menores 3 x 3 ou 4 x 4 do mesmo slide.
2. Use as mesmas configurações para intensidade de fluorescência e tempo de exposição para todas as condições. Ajuste cada configuração para combinar com o slide que tem a intensidade mais brilhante, garantindo que não haja saturação de pixels. Para obter instruções específicas sobre aquisição de imagens, siga as instruções do fabricante do microscópio.

6. Criando imagens de montagem de worms únicos alinhados usando o pipeline FIJI alinhado ao Worm

1. Instale o pacote de software de análise de imagem de código aberto FIJI¹³/ImageJ¹⁴ a partir de https://imagej.net/Fiji. Se uma instalação prévia do FIJI estiver disponível, certifique-se de que ela seja atualizada para a versão 1.52a ou posterior, pois algumas das funções utilizadas na macro (por exemplo, funções de tabela) requerem isso. Baixe a macro worm-align do Github: https://github.com/hannekeo/Worm-align.
2. Abra FIJI e execute a macro de alinhamento worm. Execute o worm-align clicando em Plugins | Macros | Execute na barra de menu principal FIJI(Figura S1). Agora localize o script Worm-align.ijm no computador.
3. A macro inicializa pedindo a localização das imagens. O pipeline funcionará em imagens de fluorescência de um canal único e multicanal(Figura S2). Selecione uma pasta de entrada e a macro gerará automaticamente uma pasta de saída onde todos os resultados serão salvos(Figura S3).
   NOTA: É importante que a pasta selecionada contenha apenas arquivos de imagem, pois a presença de outros formatos de arquivo fará com que a macro fale. Idealmente, apenas agrupar imagens que foram capturadas com as mesmas configurações de microscópio. O worm-align aceitará muitos formatos de arquivo diferentes, incluindo nd2, czi, tif, rgb, jpg e png. O nome da pasta de saída será o mesmo da pasta de entrada, com '_output' adicionado como um postfix, ou seja, se a pasta de entrada for 'imagens', a saída será encontrada em 'images_output'. A pasta de saída conterá quatro subpastas, nas quais os dados serão salvos.
4. Permita que a macro prossiga para abrir a primeira imagem na pasta de entrada e usá-la como uma imagem representativa para extrair uma configuração para gerar a montagem.
   NOTA: O worm-align selecionará automaticamente a primeira imagem na pasta de entrada para gerar as configurações que serão aplicadas a todas as outras imagens da pasta. Se outra imagem for considerada mais representativa do conjunto de dados, certifique-se de que essa imagem seja selecionada salvando uma cópia da imagem na pasta de entrada, alterando o nome para que agora esteja listado no topo da lista (por exemplo, '0_RepresentativeImage').
5. Com a ferramenta de desenho linha reta, desenhe uma linha através da largura de um worm (Figura S4) e use o comprimento desta linha para determinar a altura das regiões cortadas para worms únicos. Para cada canal, especifique o nome, tabela de procuração (LUT), configurações de intensidade (B&C) e se ele deve ser incluído na montagem(Figura S4).
   NOTA: Esses parâmetros são gravados e salvos em um arquivo de configurações, Configurações.csv, localizado na subpassa CellProfiler da pasta de saída.
6. Uma vez que todas as configurações tenham sido capturadas, o usuário é mostrado como serão as imagens após a aplicação das configurações aplicadas(Figura S5). Marque a caixa superior se as configurações forem suficientes. Selecione opções para geração de montagem (remover carrapatos, se não for necessário): 1. Gere uma montagem de worms selecionados para cada imagem ou 2. Gere uma montagem combinada na qual todos os worms selecionados em todas as imagens da pasta de entrada serão combinados em uma única montagem. Clique em OK para executar o resto da macro.
   NOTA: Se a caixa superior não estiver marcada antes de clicar em 'OK' a macro irá refazer a configuração, para que as configurações de imagem possam ser otimizadas.
7. O pipeline de alinhamento worm agora prossegue para abrir todas as imagens na pasta de entrada. Para cada imagem, desenhe linhas no eixo longitudinal de todos os worms a serem incluídos na montagem e/ou quantificação(Figura 4 e Figura S6) usando a ferramenta 'linha segmentada' (na barra de menu principal fiji). Para garantir o alinhamento adequado do worm, desenhe linhas consistentemente da cabeça ao final da cauda (ou vice-versa), e ao longo de toda a extensão do worm (veja exemplos de desenho de linha "boa" e "ruim" na Figura 4B).
8. Adicione cada linha ao gerenciador de ROI,clicando em Ctrl+T. O worm-align usa as linhas adicionadas ao gerenciador de ROI, em combinação com o parâmetro de largura do worm (definido na etapa 6.4) para gerar imagens cortadas de worms selecionados único. A coleta de ROIs de linha é salva na subpasta 'dados'. Esta pasta também contém uma cópia da imagem original mostrando as linhas, bem como o número do worm. As linhas são codificadas por cores com a Glasbey_on_dark tabela de procuração. As imagens de vermes endireitados são salvas na single_worms subpasta da pasta de saída. Além disso, se selecionado na etapa 6.6 deste protocolo, o Worm-align produz montagens de todos os worms selecionados por imagem de visão geral e/ou para todas as imagens de visão geral na pasta de entrada (ver Figura 4C e Figura S7). Essas montagens podem ser encontradas na subpasta 'alinhada' da pasta de saída.

7. Analisando a intensidade de fluorescência de um único verme usando a saída do Worm-align em um pipeline automatizado cellProfiler

1. Para processamento e análise de dados a jusante da saída de linha worm, baixe e instale o pacote de software de análise de imagem de código aberto 'CellProfiler^15,16 de https://cellprofiler.org/. Baixe o pipeline Worm_CP.cpproj do GitHub: https://github.com/hannekeo/Worm-align
   NOTA: O pipeline de exemplo descrito aqui foi construído usando o CellProfiler2.2.0 e pode não ser executado em versões posteriores do CellProfiler.
2. Antes de iniciar o pipeline Worms_CP.cpproj, garantir que todas as imagens de saída esperadas estejam presentes na subpasta CellProfiler da pasta de saída de alinhamento worm: uma cópia processada da imagem original (chamada: Original_), uma máscara de imagem binária da população de vermes (chamada: Mask_), uma máscara de linha das linhas desenhadas em worms selecionados (chamado: Lines_) e uma imagem representando cada um dos canais presentes na imagem original (nomeada pelo número do canal).
3. Para quantificar a intensidade da fluorescência em worms únicos, clique no módulo de entrada Imagens e simplesmente arraste a pasta de saída do CellProfiler para a janela que diz arquivos e pastas Drop aqui. Se uma lista de imagens estiver presente a partir de análises anteriores, remova-as primeiro clicando com o botão direito do mouse na janela e selecionando Lista de Arquivos Claras. Para excluir o arquivo 'Configurações.csv' da lista de imagens, selecione 'Somente imagens' ou 'Personalizado' com 'Extensão é tif, tiff, ome.tif ou ome.tiff' para as configurações do filtro(Figura S8).
4. Clique no módulo de entrada Metadados. No segundo método de extração, clique na pasta amarela e localize a subpastora CellProfiler na pasta de saída WormAlign (Figura S9). Selecione as Configurações.csv arquivo e vincule as configurações do arquivo à saída CellProfiler, combinando os metadados nos arquivos CSV com os das imagens (Metadados do canal).
5. Clique no módulo de entrada NamesAndTypes e insira uma nova imagem para cada canal da imagem original a ser quantificada.
   NOTA: Já estão presentes no pipeline de exemplo a máscara de verme, duas imagens coloridas, a máscara de linha e a imagem original, e três imagens em escala cinza (o verde e o canal vermelho). A lista neste módulo precisa ser ajustada se as imagens originais tiverem mais ou menos canais do que as imagens de exemplo.
6. Verifique se o nome das imagens em cada rótulo/máscara/worms da coluna está correto.
   NOTA: Os nomes das imagens em uma linha devem corresponder à mesma imagem inicial a ser analisada. Se um erro for cometido durante o processo de análise de imagem, algumas das imagens de saída estarão faltando e os nomes sob a etiqueta/máscara/worms de três colunas não corresponderão mais à mesma imagem inicial para cada linha. Se este for o caso, descubra onde está o erro.
7. Pressione a configuração de saída de exibição para selecionar a pasta para salvar a saída do Cellprofiler.
8. Clique em Iniciar o modo de teste. Uma vez no Modo de Teste, verifique novamente as configurações do pipeline aplicando-as à primeira imagem no conjunto de dados, clicando em Run (que passará por todos os módulos ativos no pipeline) ou Step (que passará pelo pipeline um módulo de cada vez).
   NOTA: Enquanto estiver no modo de teste, as medidas extraídas não serão exportadas, mesmo que um módulo ExportToSpreadsheet esteja presente (e ativo) no pipeline.
9. Uma vez que o pipeline funcione da maneira que deve, clique no Modo de Teste de Saída e, em seguida, pressione Analisar imagens. Como configurado atualmente, o Worms_CP (1) usará a imagem Mask_ para segmentar uma máscara de verme áspera e a imagem Lines_ (Figura S10A) para destacar os vermes selecionados e produzir máscaras de vermes únicos(Figura S10C), (2) medir a intensidade de fluorescência de todos os canais presentes nas imagens de entrada nos worms identificados e mascarados. O pipeline também pode medir a intensidade de fundo(Figura S10B) e corrigir todas as imagens de acordo (indicada pelo limiar de palavra em nome do parâmetro medido, por exemplo: Intensity_MeanIntensity_green_threshold), (3) medir o tamanho dos vermes selecionados e (4) exportar todos os parâmetros medidos(Figura S10D).
10. Abra a saída Worm_CP composta por dois arquivos csv, worms.csv e linhas.csv que são salvos na pasta de saída selecionada (ver Figura S11). Esses arquivos podem ser abertos em Excel ou R (Studio) para pós-processamento e emissão de relatórios. Se for necessária uma saída adicional, por exemplo, por dados de imagem, isso pode ser selecionado no módulo ExportToSpreadsheet no pipeline.

Resultados

Culturing e imagem C. elegans de acordo com o método descrito neste protocolo produz grandes imagens de visão geral de populações de vermes. Para facilitar a inspeção visual e a classificação de worms a partir dessas imagens desenvolvemos o Worm-align. Worm-align é um script FIJI simples e fácil de usar que pode ser usado para criar montagens de worms endireitados e alinhados. Os worms são selecionados a partir de imagens de visão geral desenhando uma linha ao longo do eixo longitudinal dos worms. Cada worm selecionado é atribuído um número, cortado e endireitado, e adicionado a uma montagem. Montagens podem ser geradas por imagem ou combinando todas as imagens da pasta de entrada original.

Como esperado, a saída do gasoduto depende em grande parte da qualidade das linhas desenhadas em cima das imagens. Para ilustrar este ponto, a Figura 4 mostra vários exemplos de linha e sua saída de Worm-align. Uma linha completa da cabeça até a ponta da cauda produz um verme devidamente alinhado (rotulado de "bom"). A Figura 4 também mostra como o rastreamento de imprecisões durante a execução do Worm-align afeta a saída do alinhamento. A partir da montagem anotada incluída na Figura 4C,deve-se tomar cuidado para evitar os seguintes erros, pois dificultam o alinhamento adequado dos worms:

• Rastreamento inconsistente do verme da cabeça à cauda (rotulado de "cauda à cabeça"). Isso resulta em vermes sendo orientados em diferentes direções (ou seja, cauda-a-cabeça versus cabeça-a-cauda) no alinhamento.
• Rastreamento incompleto (rotulado como "incompleto"). Isso resulta apenas na parte do verme que foi traçada para ser cortada para a montagem.
• Incluindo múltiplos vermes em um único traço (rotulado de "verme com duas cabeças"). Isso resulta em vermes mais (seções significativas de) seus vizinhos sendo inseridos no mesmo painel da montagem.
• Adicionando linhas aleatórias à imagem (rotulada como "aleatória"). Isso resulta na inserção de painéis aleatórios na montagem.

Para a criação da montagem, não é um problema se duas linhas individuais se cruzam (rotuladas como "interseção") ou forem unidas em cada extremidade do worm (rotulado "unidos"), desde que cada linha rastreie todo o comprimento de um worm individual: o script de alinhamento worm individualmente e sequencialmente seleciona cada linha ROIs, culturas e endireita-lo, de modo que cada painel na montagem final representará um único traço de linha. No caso dos vermes interseccionais, no entanto, embora vermes endireitados de comprimento total apareçam para vermes "intersecting1" e worm "intersecting2" na montagem (ver Figura 5A-B), é claramente perceptível que esses vermes se cruzam na imagem geral original. Portanto, pode-se concluir que a identificação visual de linhas intersetoriais é possível a partir da imagem de sobreposição encontrada na subpastora 'dados'(Figura 5A),bem como dos painéis de vermes individuais namontagem (Figura 5B). Além disso, qualquer sobreposição de worms/linhas pode ser identificada a partir da tabela de controle de qualidade (QC) gerada para cada imagem processada pelo Worm-align e salva na subpasta de dados. Esta tabela registra três parâmetros para cada uma das linhas ROIs desenhadas na imagem (ver Figura 5C): Destes, o comprimento indica o comprimento do ROI de linha, que é um bom indicador do tamanho do worm; e o número do Worm indica a ordem em que as linhas foram desenhadas na imagem de visão geral. Finalmente, a última coluna indica se há sobreposição entre o worm/linha em questão e qualquer um dos outros worms/linhas selecionados na imagem. Em caso de sobreposição, o número nesta coluna será diferente do listado na coluna número worm. Em combinação com a imagem de sobreposição, a tabela QC deve ajudar o pesquisador a tomar decisões aprendidas sobre quais vermes devem ser excluídos da montagem e/ou quantificação.

A saída de Worm-align pode ser usada para quantificação subsequente da intensidade da fluorescência em worms únicos. Em FIJI, os ROIs de linha podem ser usados para medir a intensidade da fluorescência nos dados de imagem originais, por exemplo, executando o simples script FIJI ' Worm-quant.ijm', que também pode ser encontrado no repositório de linha worm no Github. Alternativamente, a saída de alinhamento worm pode ser importada para software de análise de imagem de terceiros. Demonstramos isso importando a saída de dois conjuntos de dados de alinhamento worm em Worm_CP, um pipeline que geramos no CellProfiler. Worm_CP usa os arquivos na subpaste 'CellProfiler' da pasta de saída de alinhamento worm para ajustar máscaras de segmentação desses worms individuais selecionados durante a execução da macro de alinhamento worm. Especificamente, ele usa a máscara de linha (chamada: Lines_) para isolar vermes selecionados da população de vermes vistas na máscara binária (chamada: Mask_). Deve-se notar que as linhas que se cruzam na imagem de visão geral(Figura 5A),embora não seja um problema para a geração de montagens, são problemáticas para o Worm_CP pipeline. Por que este é o caso, é ilustrado na Figura 5 D-E. Worm_CP usa a máscara de linha (Figura 5D), e não ROIs individuais para auxiliar na identificação de vermes individuais. A linha de intersecção desenhada em segundo lugar durante a execução do Worm-align é sobreposta na primeira linha e, portanto, a intensidade ao longo desta linha será a de ROI2, incluindo na broca onde a linha 1 e 2 se sobrepõem. Como resultado, o CellProfiler segmentará a linha2 como um objeto, mas a linha1 como dois objetos separados onde ele se cruza com a linha2. Isso significa que o CellProfiler produzirá duas (metade) máscaras de verme para worm 'intersecting1'(Figura 5E). A maneira mais fácil de excluir esses eventos da análise final (se necessário), é identificar o número de worms de interceptação da tabela QC (subpatos de dados) e remover medições desses worms dos arquivos de saída cellProfiler. Observe que os worms não serão necessariamente alocados no mesmo número em FIJI e CellProfiler: Para identificar o número de worm FIJI na saída cellProfiler, olhe os valores de Intensity_Max_Intensity no arquivo de saída 'Linhas.csv'. Qualquer Intensity_Max_Intensity valor que aparece na tabela 'Linhas.csv' mais de uma vez por imagem é uma indicação dessa linha ROI resultando em uma máscara de verme fraturada.

Uma vez segmentadas máscaras de vermes individuais, Worm_CP pode medir a intensidade da fluorescência nos worms selecionados para todos os canais registrados. Todas as medidas são tomadas a partir dos dados originais (brutos) da imagem, embora deva ser observado que o CellProfiler redimensiona automaticamente a intensidade do pixel em uma escala de 0-1. Isso é conseguido dividindo o valor de intensidade de pixel bruto pela intensidade máxima possível de pixels para a imagem. No caso de imagens de 8 bits este valor é de 255, e no caso de imagens de 16 bits é 65535. Os valores de intensidade do CellProfiler precisam, portanto, ser multiplicados pelo valor máximo de intensidade possível para recuperar valores equivalentes aos dados de imagem bruta. A saída Worm_CP consiste em dois arquivos csv, 'worms.csv' e 'Linhas.csv' que são salvos na pasta de saída selecionada. Ao inspecionar esses arquivos, é claro que o CellProfiler registra um grande número de parâmetros relacionados à intensidade da fluorescência. Destes, o Intensity_IntegratedIntensity corresponde à fluorescência total por verme (ou seja, a soma da intensidade da fluorescência dentro de todos os pixels que interpretam a máscara de um verme individual). O parâmetro Intensity_MeanIntensity refere-se à intensidade média de fluorescência dentro de um verme individual (ou seja, a intensidade média de fluorescência por pixel para todos os pixels contidos dentro de um worm individual). Devido à ocorrência ocasional de (pequenos) erros na segmentação das máscaras de vermes, recomenda-se que as medidas da MeanIntensity sejam utilizadas ao comparar medições de fluorescência de vermes individuais entre duas condições. Se quiser substratar a fluorescência de fundo de medições quantificadas, use as medições chamadas MeanIntensity_Threshold.

Utilizamos o Worm_CP pipeline para quantificar a intensidade de fluorescência de animais fixos que foram rotulados com um corante fluorescente que incorpora gotículas lipídicas (LDs)(Figura 6). Para validar a quantificação da fluorescência do pipeline worm-align/Worm_CP, quantificamos a intensidade de fluorescência no mesmo conjunto de worms do conjunto de dados BODIPY pelo pipeline de linha de worm/Worm_CP ou quantificação manual em FIJI/ImageJ. A quantificação manual foi realizada em FIJI/ImageJ circulando cada verme, bem como uma zona de fundo escura em cada imagem. A intensidade da fluorescência foi medida no gerenciador do ROI e o valor medido para o fundo da imagem foi subtraído da medição da fluorescência do verme de cada verme, conforme descrito¹⁷. Comparamos vermes N2 do tipo selvagem (WT) com mutantes dbl-1(nk3), que exibem menor teor de gotículas lipídicas¹⁸. Como esperado, a intensidade da fluorescência verde é significativamente diminuída entre os vermes WT e dbl-1(nk3) com ambos os métodos(Figura 6A,B). Exemplos de vermes alinhados podem ser observados na Figura 6C,D. O teor de gotícula lipídica é reduzido em 17% (p-value<0,0001, t-test não pago) entre WT e dbl-1(nk3) usando quantificação manual e 14% (p-value=0,0051 t-test não pago) usando o Worm_CP pipeline. A diminuição do teor de gotículas lipídicas observada aqui no dbl-1(nk3) com ambos os métodos de quantificação está de acordo com a literatura¹⁸. Isso mostra que a quantificação de imagens de fluorescência adquiridas com o Worm_CP pipeline CellProfiler é comparável à quantificação manual.

Também usamos Worm_CP para quantificar a resposta de choque térmico em vermes vivos expressando GFP sob controle do gene indutível de choque térmico hsp-70(C12C8.1)⁹. A Figura 7 mostra imagens representativas de C. elegans ao vivo carregando o hsp-70(C12C8.1)p::Repórter GFP. Na ausência de estresse térmico, os vermes não induzem a expressão GFP(Figura 7A,B). No entanto, quando os vermes são expostos a um curto choque térmico de 30 min a 34 °C, eles induzem a expressão GFP(Figura 7C,D). Os níveis de expressão GFP com e sem choque térmico são quantificados na Figura 7E.

Do jeito que está, Worm_CP é um oleoduto muito básico. No entanto, essa abordagem permite uma segmentação mais precisa de máscaras de vermes individuais, o que permite uma quantificação mais precisa da intensidade de fluorescência nesses vermes selecionados a partir da imagem. Por essa razão, preferimos essa abordagem em vez de uma quantificação áspera em FIJI, usando apenas as máscaras de linha. Além disso, o CellProfiler oferece a vantagem de que módulos de análise adicionais podem ser facilmente incluídos no pipeline. Por exemplo, para o conjunto de dados que analisa o conteúdo de gotículas lipídicas, a inserção de módulos adicionais no Worm_CP pipeline poderia investigar números de gotículas lipídicas e intensidade de fluorescência de gotículas individuais nesses worms selecionados nas imagens de visão geral.

Figura 1: Gerando uma micropipette bucal. Um capilar de vidro é estendido na chama de um queimador bunsen(A),até que forneça extremidades alongadas finas(B). O capilar de vidro estendido é então conectado à peça adaptadora da micropipette bucal. (C) Esquema de uma micropipette bucal. A micropipette bucal foi montada com um capilar de vidro conectado a um adaptador. Um tubo de silicone de 6 mm conecta o adaptador a um filtro de seringa de 0,2 μm, usado para segurança. A outra extremidade do filtro é anexada a um tubo de silicone de 3 mm terminando com uma ponta de filtro de 1mL. O experimentador pode aspirar através da ponta do filtro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Aspiração do líquido ao redor da pelota de minhoca, utilizando a micropipette bucal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Adicionando o deslizamento de tampas nos worms que estão na almofada de agarose Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Exemplos de alisamento de vermes usando worm-align em imagens de fluorescência adquiridas de animais vivos carregando o repórter transcricional fat-7p::GFP no intestino e um marcador vermelho de co-injeção na faringe(mio-2p::tdtomato). (A) Captura de tela de uma imagem composta adquirida no microscópio fluorescente de vermes vivos no terceiro dia da vida adulta. A imagem foi aberta com Worm_align e linhas foram desenhadas ao longo do eixo longitudinal dos vermes usando worm-align. (B) Captura de tela da mesma imagem que em (A), com exemplos comentados de desenho bom e ruim das linhas ao longo do eixo dos worms, usando Worm-align. (C) Exemplos de linhas desenhadas em cima de vermes que podem subir a vermes alinhados incorretamente. Saída alinhada com worms dos worms selecionados em B. As imagens foram tiradas com um objetivo de 20x em um microscópio widefield invertido (ver tabela materiais) com intensidade de fluorescência verde=1, exposição=60 ms e intensidade de fluorescência vermelha = 8, exposição=60 ms. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Exemplos de endireitamento de vermes usando worm-align em worms interseccionais. (A) Captura de tela de uma imagem composta adquirida no microscópio fluorescente de vermes vivos no 3º dia de animais adultos carregando o repórter transcricional fat-7p::GFP no intestino e um marcador vermelho de co-injeção na faringe(mio-2p::tdtomato). Os vermes interseccionais são rotulados como "intersecting1" e "intersecting2", enquanto os vermes não sobrepostos são rotulados como "good3" e "good4". (B) Montagem criada por Worm-align representando vermes endireitados selecionados em (A). É perceptível na montagem que os vermes 1 e 2 estavam se cruzando na imagem original (vermes rotulados como "intersecting1" e "intersecting2"). (C) Captura de tela da tabela QC do Worm-align que permite detectar casos em que os worms se cruzam. Comprimento: comprimento da linha ROI; número de verme: ordem em que as linhas foram desenhadas; última coluna indica se há uma sobreposição entre o worm/linha de interesse e qualquer outro verme. Neste exemplo, o verme na primeira bruto (número de verme1) se sobrepõe ao worm número 2, conforme indicado pelo número "2" na última coluna. (D) Captura de tela das linhas desenhadas com worm-align nos quatro worms selecionados em A. (E) Captura de tela das máscaras geradas pelo Worm-align nos quatro worms selecionados em A, mostrando como as máscaras para os dois vermes interseccionais são renderizadas. Neste caso, duas máscaras em vez de uma estão agora correspondendo ao verme "intersecting1". As imagens foram tiradas com um objetivo de 20x em um microscópio widefield invertido (ver tabela Materiais) com intensidade de fluorescência verde=1, exposição=60ms e intensidade de fluorescência vermelha = 8, exposição = 60 ms. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: O Worm_CP pipeline quantifica a fluorescência tão precisamente quanto a quantificação manual. Comparação da quantificação da fluorescência de vermes adultos jovens fixados e manchados para conteúdo de gotícula lipídica com o corante fluorescente verde BODIPY, utilizando Worm_CP pipeline (A) ou quantificação manual(B). O teor de gotículas lipídicas de WT e dbl-1 (nk3) foi monitorado por animais de fixação e coloração com BODIPY, que se intercala em ácidos graxos de gotículas lipídicas (ver protocolo A). Os animais adultos jovens foram fixados com isopropanol de 60% e manchados com BODIPY por 1h. O mesmo conjunto de animais foi quantificado utilizando o Worm_CP pipeline (ver etapa 7) ou por quantificação manual de acordo com os procedimentos padrão¹⁷. (A) Quantificação da fluorescência usando Worm_CP pipeline. WT: n=22 animais, fluorescência média= 1,016 (A.U) ± 0,206 SD; dbl-1(nk3): n=25 animais, fluorescência média= 0,8714 (A.U) ± 0,126 SD. Teste t não pago. (B) Quantificação manual da fluorescência. WT: n=22 animais, fluorescência média = 1,048 ± 0,153 SD; dbl-1(nk3): n=25 animais, fluorescência média = 0,8632 ± 0,109 SD. Teste t não não pago. (C, D) Exemplo representativo ou saída worm-Align para animais WT(C) e dbl-1(nk3) (D) endireitados com o pipeline de alinhamento worm. As imagens foram tiradas com um objetivo de 20x em um microscópio widefield invertido (ver tabela Materiais) com intensidade de fluorescência verde=2, exposição=60ms. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Exemplo de quantificação de fluorescência e alinhamento de vermes vivos a partir de imagens de fluorescência de vermes vivos carregando o repórter transcricional hsp-70(C12C8.1)p::GFP após choque térmico. (A) Após um curto choque térmico (30 min a 34 °C), vermes adultos jovens foram recuperados em sua temperatura de cultivo (25 °C) e montados em seguida, imagens 3,5h após choque térmico. Cerca de 30 vermes foram quantificados após choque térmico usando o oleoduto de alinhamento worm. (A-B) Exemplos de vermes alinhados que não foram expostos ao choque térmico. (C-D) Exemplos de vermes chocados com o calor carregando hsp-70(C12C8.1)p::GFP usando worm-align. (E) mostra a intensidade média do GFP (Worm_CP parâmetro: MeanIntensity_Threshold) de MCC jovens adultos adultos cultivados, sem choque térmico ou após exposição a choque térmico (34 °C por 30 min). As imagens foram tiradas com um objetivo de 20x em um microscópio widefield invertido (ver tabela materiais) com intensidade de fluorescência verde=1, exposição=60ms; sem HS: n=12, HS: n=32. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Localização em FIJI onde a macro de alinhamento de worm pode ser encontrada, uma vez instalada. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Seleção da pasta contendo todas as imagens tiradas com as mesmas configurações. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Geração de 4 subpastas na pasta de saída em FIJI. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4: Desenho de uma linha através da largura do worm e configurações do canal para a montagem. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 5: Visualização da imagem com as configurações aplicadas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 6: Desenho de uma linha ao longo do eixo longitudinal dos vermes de interesse para inclusão na montagem e/ou quantificação. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 7: Montagem dos worms selecionados na pasta de saída, em pasta "alinhada". Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 8: Eliminando imagens anteriores de análises anteriores em Cell Profiler. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 9: Importação de metadados para CellProfiler da pasta de saída de alinhamento de worms selecionando a subpasta Configurações.csv. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 10: O pipeline CellProfiler Worm_CP.cpproj usa as imagens Lines_ para acionar os worms selecionados (A), e produz máscaras de vermes únicos dos worms de interesse (C). O gasoduto também mede a intensidade de fundo (B). Perspectiva de todos os parâmetros medidos pelo pipeline Worm_CP.ccproj que são exportados em um arquivo csv (D). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 11: Seleção de arquivos de saída no "ExportToSpreadsheet no pipeline Worm_CP.cpproj. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Worm-align é um pipeline de processamento de imagem baseado em FIJI que facilmente gera montagens de worms selecionados pelo usuário, nos quais os worms são endireitados e alinhados para ajudar a comparação visual, classificação e representação. Embora esse recurso também seja oferecido por algumas ferramentas existentes, notadamente o módulo WormToolbox no CellProfiler⁷, o Worm-align requer relativamente pouca experiência de análise de imagem prévia: os usuários precisam apenas rastrear os worms que gostariam de selecionar para a montagem (e análise). Embora rastrear os worms nos dados de imagem bruta seja um processo fácil - particularmente quando um computador ou tablet touch-screen está disponível - é primordial, que as linhas são corretamente desenhadas ao longo do eixo longitudinal dos worms. Linhas incompletas, que seguem apenas parte do verme, resultarão em vermes parciais na montagem (ou seja, vermes faltando cabeças de extremidades traseiras) e máscaras de segmentação parcial durante a análise do CellProfiler. Além disso, se linhas de dois vermes individuais se cruzarem, os vermes não serão processados corretamente na montagem de alinhamento de vermes, bem como para quantificação da fluorescência. Para controle de qualidade, uma imagem sobreposta das seleções de linha na imagem original é salva na pasta de dados, juntamente com uma tabela QC. A partir dessas, linhas problemáticas que levarão a vermes segmentados incorretamente podem ser facilmente identificadas e excluídas da montagem e/ou análise subsequente.

Embora a entrada direta do experimentador na seleção de worms talvez pareça um pouco demorada, ela apresenta uma clara vantagem do fluxo de trabalho sobre outros em experimentos onde vermes de diferentes estágios de desenvolvimento estão presentes na mesma imagem: Os worms podem ser selecionados durante a "etapa de rastreamento", delineando apenas os vermes que estão no estágio de desenvolvimento certo. Alternativamente, os worms podem ser filtrados usando a saída de Worm_CP com base no comprimento da linha de rastreamento, ou na área da máscara de segmentação, ambos indicadores confiáveis do comprimento/tamanho dos worms. Indiscutivelmente, algoritmos de aprendizagem de máquina podem lutar para reconhecer vermes de diferentes estágios de desenvolvimento, já que seu tamanho e aparência nas imagens DIC são tão diferentes.

A saída do Worm-align pode ser usada para quantificação subsequente da intensidade da fluorescência em worms únicos, seja em FIJI diretamente ou em outras plataformas de software de análise de imagem. Demonstramos isso importando a saída de worm-align em um simples pipeline CellProfiler (Worm_CP), que permite a quantificação da intensidade de fluorescência multicanal nesses worms individuais que foram selecionados durante a execução do pipeline de alinhamento worm. Escolhemos essa abordagem devido à flexibilidade do software CellProfiler: É simples incorporar módulos adicionais no pipeline para analisar recursos adicionais em worms individuais (por exemplo, medir o tamanho de gotículas lipídicas, ou grânulos de estresse, núcleos, mitocôndrias). Além disso, as máscaras de vermes individuais poderiam potencialmente ser usadas para treinar um novo modelo para WormToolbox⁷.

As principais vantagens deste método são que ele é rápido e requer uma configuração simples de montagem de vermes. Este método é mais rápido, pois não requer gastar tempo aprendendo operação de software nem executando conjuntos de treinamento através de um algoritmo de máquina⁷. Além disso, este método funciona com vermes vivos ou fixos simplesmente montados em almofadas de agarose regulares. Não há necessidade de uso de câmaras microfluidas complexas, conforme desenvolvido em outros métodos^5,6.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose	MeLford Biolaboratories Ltd	MB1200
Tubo de aspiração	Sigma-Aldrich	A5177	para criar micropipeta bucal (ver etapa do protocolo)
Béquer
BODIPY 493/593	Invitrogen	D3922	solução estoque preparada em DMSO a 1mg/mL
Centrífuga	MSE MISTRAL 1000
Frasco
Cover Slip	VWR	631-0120
Filtro 0.2 µ m para Seringa	Sartrius	16534-K	Filtro, para criar micro-pipeta bucal (ver etapa do protocolo)
Cloridrato
instalação	nitrogênio
L	Starlab	S1182-1830
Metanol	VWR produtos químicos	20847.307
Lâminas de microscópio, MENZEL GLASSER	Microscópio Thermo Scientific	BS7011/2
Forno de microondas
			Placas
		NGM de >9cm	preparadas em laboratório de acordo com15
PBS			preparadas em laboratório
Tubo Protein LoBind 2ml	Eppendorf	22431102
Triton	SIGMA	T9284-500ML
Tampas de anel	SIGMA-ALDRICH	Z611247-250EA	tubos microcapilares de vidro para criar boca micro-pipeta (ver passo do protocolo)
Rotator	Stuart Scientific
Silicone tubine translúcido	Laboratório Científico Fornecedores	TSR0600200P	parede de 6,0 mm x 2,0 mm - para criar micro-pipeta de boca (ver passo do protocolo)
Água H2O			MilliQ esterilizada autoclavada no laboratório
10µ Pontas L		Starlab S1120-3810
200µ Pontas L		Starlab S1120-8810
1000µ L Tips	Starlab	S1122-1830
15mL Tubo de Centrífuga	CORNING	430791
Vecta Shield	VECTOR	94010	meio de montagem antifade (H-1000) sem DAPI