Usando elegans caenorhabditis para tela para interações de acompanhantes específicas de tecido

Summary

Para estudar as interações acompanhante-acompanhante e acompanhante-substrato, realizamos telas de interação sintética em elegans caenorhabditis usando interferência de RNA em combinação com mutações leves ou sobre-expressão de acompanhantes e monitorar disfunção proteica específica do tecido no nível do organismo.

Abstract

A dobra correta e a montagem de proteínas e complexos proteicos são essenciais para a função celular. As células empregam vias de controle de qualidade que corrijam, sequestram ou eliminam proteínas danificadas para manter um proteome saudável, garantindo assim proteostase celular e prevenindo danos adicionais à proteína. Devido a funções redundantes dentro da rede de proteostase, a triagem de fenótipos detectáveis usando knockdown ou mutações em genes codificadores de acompanhantes no organismo multicelular Caenorhabditis elegans resulta na detecção de fenótipos menores ou não na maioria dos casos. Desenvolvemos uma estratégia de triagem direcionada para identificar acompanhantes necessários para uma função específica e, assim, preencher a lacuna entre fenótipo e função. Especificamente, monitoramos interações de acompanhantes novos usando telas de interação sintética RNAi, expressão de acompanhante, um acompanhante de cada vez, em animais carregando uma mutação em um gene codificante de acompanhantes ou expressando demais um acompanhante de interesse. Ao interromper dois acompanhantes que individualmente não apresentam fenótipo bruto, podemos identificar acompanhantes que agravam ou expõem um fenótipo específico quando ambos perturbados. Demonstramos que essa abordagem pode identificar conjuntos específicos de acompanhantes que funcionam juntos para modular a dobra de um complexo de proteínas ou proteínas associados a um determinado fenótipo.

Introduction

As células lidam com danos proteicos empregando máquinas de controle de qualidade que reparam, sequeram ou removem quaisquer proteínas danificadas^1,2. O dobrável e a montagem de complexos proteicos são suportados por acompanhantes moleculares, um grupo diversificado de proteínas altamente conservadas que podem reparar ou sequestrar proteínas danificadas^3,4,5,6,7. A remoção de proteínas danificadas é mediada pelo sistema ubiquitina-proteasome (UPS)

Protocol

1. Preparação de placas de mídia de crescimento de nematoide para RNAi

1. A uma garrafa de 1 L, adicione 3 g de NaCl, 2,5 g de Bacto-Peptone, 17 g de ágar e água destilada até 1 L e autoclave.
2. Frie a 55 °C.
3. Adicione 25 mL de 1 M KH₂PO₄, pH 6.0, 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de 1 M MgSO₄e 1 mL de solução decolesterol (Tabela 1) para fazer mídia de crescimento nematode (NGM).
4. Adicione 1 mL de ampicilina (100 mg/mL) e 0,5 mL de 1 M IPTG(Tabela 1) para fazer a solução NGM-RNAi.
   NOTA: As bactérias HT115(DE3) E. coli comumente utilizadas contêm uma polime....

Results

Usando mutações sensíveis à temperatura no UNC-45 para testar para agravar ou aliviar interações em condições permissivas ou restritivas, respectivamente
A montagem e manutenção muscular oferecem um sistema eficaz para estudar interações de acompanhantes específicas do tecido. A unidade funcional de músculos contratuais, o sarcomere, apresenta um arranjo cristalino de proteínas estruturais e regulatórias. A estabilidade da miose da proteína motora e sua incorporação nos filamentos espessos de sarcomer.......

Discussion

Uma imagem integrada da rede de proteostase refletindo como ela é organizada e funciona em diferentes células metazoanas e tecidos permanece em falta. Para supridamente essa deficiência, são necessárias informações específicas sobre as interações de diversos componentes dessa rede, como acompanhantes moleculares, em tecidos específicos durante o desenvolvimento e envelhecimento. Aqui, mostramos como o uso de perturbações específicas do tecido nos permitiu examinar a rede de acompanhantes em um determinado tecido. Para ex.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placas de 12 poços	SPL	BA3D16B
placas de 40 mm	Greiner Bio-one	627160
Placas de 60 mm	Greiner Bio-one	628102
placas de 6 poços	Thermo Scientific	140675
96 poços 2 mL 128,0/85mm	Greiner Bio-one	780278
Agar	Formedium	AGA03
Ampicilina	Formedium	69-52-3
azul de bromofenol	Sigma	BO126-25G
CaCl2	Merck	1.02382.0500
Câmera	Qimaging	q30548
Colesterol	Amresco	0433-250G
Confocal	Leica	DM5500
Filtro (0,22 µ m)	Sigma	SCGPUO2RE
estereomicroscópio fluorescente	Leica	MZ165FC
Glicerol	Frutarom	2355519000024
IPTG	Formedium	367-93-1
KCl	Merck	104936
KH2PO4	Merck	1.04873.1000
KOH	Bio-Lab	001649029100
MgSO4	Fisher	22189-08-8	Presente do laboratório Morimoto
Anticorpo de miosina MHC A (MYO-3)	Hybridoma Bank	5-6
Na2HPO4· 7H2O	Sigma	s-0751
NaCl	Bio-Lab	001903029100
Peptona	Merck	61930705001730
Bomba de derramamento	de placa Integra	faz isso p920
RNAi Biblioteca de acompanhantes	NA	NA
SDS	VWR Ciências da Vida	0837-500
ß- mercaptoetanol	Bio world	41300000-1
estereomicroscópio	Leica	MZ6
Tetraciclina	Duchefa Biochemie	64-75-5
Tris	Bio-Lab	002009239100
Tween-20	Fisher	BP337-500