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Ensaio fluorométrico baseado em química de cliques para apolipoproteína N-aciltransferase da caracterização enzimática à triagem de alto rendimento

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DOI:

10.3791/61146

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13 de maio de 2020

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1Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France

Neste artigo

Resumo

Apresentamos aqui um ensaio de fluorescência sensível para monitorar a atividade da apolipoproteína N-aciltransferase usando peptídeo diacilglicerilo e alquino-fosfolipídios como substratos com click-química.

Resumo

As lipoproteínas de proteobactérias são modificadas pós-translacionalmente por ácidos graxos derivados de fosfolipídios de membrana pela ação de três enzimas integrais de membrana, resultando em proteínas triacilatadas. O primeiro passo na via de modificação da lipoproteína envolve a transferência de um grupo diacilglicerila do fosfatidilglicerol para a prolipoproteína, resultando em prolipoproteína diacilglicerila. Na segunda etapa, o peptídeo de sinal da prolipoproteína é clivado formando uma apolipoproteína, que por sua vez é modificada por um terceiro ácido graxo derivado de um fosfolipídio. Esta última etapa é catalisada pela apolipoproteína N-aciltransferase (Lnt). A via de modificação da lipoproteína é essencial na maioria das γ-proteobactérias, tornando-se um alvo potencial para o desenvolvimento de novos agentes antibacterianos. Descrito aqui é um ensaio sensível para Lnt que é compatível com triagem de alto rendimento de pequenas moléculas inibitórias. A enzima e os substratos são moléculas embutidas na membrana; por conseguinte, o desenvolvimento de um ensaio in vitro não é simples. Isso inclui a purificação da enzima ativa na presença de detergente, a disponibilidade de alquinofosfolipídios e substratos peptídicos diacilglicerilos e as condições de reação em micelas mistas. Além disso, para usar o teste de atividade em uma configuração de triagem de alto rendimento (HTS), a leitura direta do produto da reação é preferida às reações enzimáticas acopladas. Neste ensaio enzimático fluorométrico, o produto peptídico alquino-triacilado é tornado fluorescente através de uma reação de click-chemistry e detectado em um formato de placa multipoço. Este método é aplicável a outras aciltransferases que utilizam substratos contendo ácidos gordos, incluindo fosfolipídios e acil-CoA.

Introdução

As lipoproteínas bacterianas são caracterizadas por ácidos graxos covalentemente ligados em seus amino-termini através dos quais são ancoradas em membranas 1,2. A parte madura da proteína é altamente diversificada em estrutura e função, explicando assim o papel das lipoproteínas em vários processos biológicos no envelope celular bacteriano.

As lipoproteínas são modificadas por ácidos graxos derivados de fosfolipídios após a inserção na membrana citoplasmática. As prolipoproteínas contêm um motivo de assinatura, a lipocaixa, que contém um resíduo de cisteína invariante que se torna acilado e o primeiro aminoácido na proteína madura. O primeiro passo desta via é catalisado pela prolipoproteína fosfatidilglicerol::d iacylglyceryl transferase (Lgt), que transfere o grupo diacilgliceril do fosfatidilglicerol para a prolipoproteína através de uma ligação tioéter entre diacilgliceril e cisteína. A peptidase de sinal II (Lsp) cliva o peptídeo de sinal da prolipoproteína diacilglicerila, resultando em uma apolipoproteína que é ancorada na membrana através de sua porção diacilgliceril. A terceira e última etapa é catalisada pela apolipoproteína N-aciltransferase (Lnt), que adiciona um ácido graxo da posição sn-1 do fosfolipídeo à apolipoproteína, resultando em lipoproteína madura triacilada (Figura 1)3. A reação Lnt é uma reação de pingue-pongue de duas etapas onde um intermediário estável da enzima tioéster acila é formado. O subproduto lisofosfolipídio é liberado antes da acilação do substrato apolipoprotéico na segunda etapa da reação.

A especificidade do substrato fosfolipídico é determinada em um ensaio de Lnt com base no deslocamento de mobilidade do peptídeo N-acilo diacilglicerilo em uma alta porcentagem de ureia Tris-Tritrina SDS-PAGE4. Fosfolipídios com pequenos grupos polares, saturados [sn-1] e não saturados [sn-2], foram substratos preferenciais 4. O ensaio de deslocamento de gel não é apropriado para estudos cinéticos extensivos da apolipoproteína N-aciltransferase nem para a HTS identificar moléculas inibitórias. A química do clique usando ácidos graxos alquinos tem sido usada com sucesso para estudar a modificação de lipoproteínas em bactérias5 e o metabolismo de ácidos graxos em eucariotas6. Recentemente, um ensaio in vitro de palmitoilação de Ras foi relatado para identificar inibidores7.

No método descrito aqui, o Lnt ativo purificado em detergente é incubado com substratos em micelas mistas para formar peptídeo alquino-triacilado que é subsequentemente detectado por espectrometria de fluorescência.

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Protocolo

1. Preparação de enzimas e substratos

  1. Purificação da enzima
    1. Produzir e purificar a enzima Lnt a partir de membranas solubilizadas em detergente, conforme descrito anteriormente 4,8. Resumidamente, induzir a expressão do gene lnt-strep, codificando Lnt com uma etiqueta Strep C-terminal, a OD 600 de 0,6 com tetraciclina anidra (200 ng/mL) a 37 °C por 16 h.
    2. Colher as células por centrifugação a 4.000 x g durante 10 min e descartar o sobrenadante.
    3. Ressuspeite o pellet celular em buffer WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) para 100 OD600 unidades por mL.
    4. Quebre as células por duas passagens através de uma prensa de células de pressão francesa a 10.000 psi.
    5. Remova células ininterruptas e detritos por centrifugação a 13.000 x g por 20 min. Mantenha o sobrenadante e descarte o pellet.
    6. Centrifugar o sobrenadante a 120.000 x g durante 60 min e recolher as vesículas da membrana (pellet de cor castanha translúcida). Descarte o sobrenadante.
    7. Solubilizar as proteínas integrais da membrana do pellet de membrana com 1% (p/v) de n-dodecil β-D-maltosídeo (DDM) em tampão WA por 30 min à temperatura ambiente (RT). Centrifugar e remover o material insolubilizado a 120.000 x g durante 30 min. Use a fração sobrenadante para purificação.
    8. Purificar o estreptococo Lnt numa coluna de cromatografia de afinidade (ver Tabela de Materiais) e numa coluna de filtração em gel S400 (ver Tabela de Materiais), conforme descrito por Nozeret et al.8.
    9. Conservar a enzima purificada em tampão WA contendo 0,05% de DDM e 10% de glicerol a -80 °C.
      NOTA: A enzima é estável por mais de 5 anos.
  2. Preparação de substratos alcinofosfolipídicos e ligantes estimuladores de fibroblastos biotinilados (FSL-1-biotina)
    1. Alíquota de 100 μL de alquino-PAPA sintetizado sob medida (1-hexadec-15-ynoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, ver Tabela de Materiais) solubilizado em clorofórmio em tubos de 1,5 mL.
    2. Perfure os tubos com uma seringa e evapore o clorofórmio numa cápsula de velocidade a RT durante 2 h. Conservar as amostras de fosfolipídios secos a -20 °C.
    3. Dissolva o alquino-PAPA em 0,1% de Triton X-100 a 500 μM antes do uso. Adicione uma etapa de sonicação de 3 minutos em um banho de água ultra-sônico no RT para solubilizar o alquino-PAPE, se necessário.
    4. Resuspender FSL-1-biotina em água a 445 μM.
      NOTA: Ambas as soluções podem ser armazenadas a -20 °C durante, pelo menos, 2 meses.

2. Ensaio do tubo

NOTA: No Dia 1, configure a reação de Lnt em tubos de 1,5 mL (etapa 2.1) e cubra as placas de 96 poços com estreptavidina (etapa 2.2).

  1. Preparação de mistura de reagentes e reação enzimática
    1. Para um ensaio Lnt padrão, misture alquino-PAPE (50 μM final do estoque de 500 μM) e FSL-1-biotina (concentração final de 50 μM de um estoque de 445 μM) em tampão de reação Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 contendo 1% BSA) a um volume final de 18 μL em tubos de 1,5 mL. Executar todas as condições em triplicado.
    2. Sonicar a mistura de substrato (preparada na etapa 2.1.1) durante 3 minutos num banho-maria ultra-sónico e incubar a 37 °C durante 5 min antes da adição da enzima Lnt (etapa 2.1.3).
      NOTA: MTSES (2-sulfonatoetil)metanoetiossulfonato), um reagente específico do tiol, inibe o Lnt8. Adicionar 10 mM MTSES (solução-mãe de 100 mM em DMSO a 100%) aos tubos de reacção (passo 2.1.1) a utilizar como amostras de controlo negativo. Ajuste o volume do tampão de reação Lnt de modo que o volume total seja de 18 μL.
    3. Adicionar Lnt ativo (1 ng/μL, correspondente a 17,2 nM) ou inativo (C387S) (2 μL de 10 ng/μL em buffer WA contendo 0,05% DDM) e misturar com os substratos (etapa 2.1.2) pipetando para cima e para baixo.
    4. Incubar a reacção a 37 °C durante 16 h numa termineira com tampa aquecida.
  2. Revestimento de estreptavidina de 96 placas de poço
    1. Preparar uma solução-mãe de estreptavidina a 2 mg/ml em H2O.
      NOTA: Esta solução pode ser armazenada a -20 °C até 6 meses.
    2. A partir da solução-mãe, preparar 10 μg/ml de estreptavidina em água como solução de trabalho. Adicionar 100 μL da solução a cada alvéolo da placa de 96 alvéolos. Ligar a estreptavidina à placa incubando a 37 °C durante a noite sem tampa para secar os poços ao ar.

NOTA: No Dia 2, execute a química de cliques (etapa 2.3), ligue a mistura de reação de Lnt a placas revestidas com estreptavidina (etapa 2.4) e detecte a fluorescência e analise os resultados (etapa 2.5).

  1. Reação de click-chemistry
    1. Preparar soluções-mãe de Azido-FAM (5 mM em DMSO), TCEP (cloridrato de Tris(2-carboxietil)fosfina; 50 mM preparado em água), TBTA (Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina; 2 mM em tert-butanol:DMSO (4:1)) e CuSO4∙5H 2 O (50 mM preparados na hora em H2O).
    2. Nos tubos de 1,5 mL contendo a mistura de reação Lnt preparada na etapa 2.1.4, realizar click-chemistry adicionando os reagentes na seguinte ordem: 0,2 μL de estoque Azido-FAM (concentração final 50 μM), 0,4 μL de estoque TCEP (concentração final 1 mM), 0,2 μL de estoque TBTA (concentração final 0,02 mM).
    3. Vórtice a solução para 5 s. Em seguida, adicione 0,4 μL de CuSO4 de estoque (concentração final de 1 mM). Vórtice novamente por 5 s. Incubar as amostras no escuro no RT por 1 h.
  2. Ligação da mistura de reação de Lnt a placas revestidas de estreptavidina
    1. Lavar os poços das placas revestidas com estreptavidina após a incubação durante a noite a partir da etapa 2.2.2 3x com 200 μL de PBS-T1 (PBS contendo 0,05% Tween-20).
      NOTA: As placas de estreptavidina podem ser utilizadas imediatamente ou armazenadas secas a 4 °C.
    2. Transferir 18 μL da mistura click-chemistry da etapa 2.3.3 para um poço em uma placa revestida com estreptavidina de 96 poços e adicionar 100 μL de PBS-T1 para ligar o produto N-acil-FSL-1-biotina-FAM às placas de estreptavidina.
    3. Use biotina-fluoresceína (0,26 μM de um estoque de 3,1 mM em DMSO) como controle positivo para ligação de estreptavidina e leitura de fluorescência.
    4. Incubar as placas no RT por 1 h no escuro em um termifrê, agitando a 300 rpm.
    5. Execute as etapas de lavagem manual das placas de 96 poços com uma pipeta eletrônica multicanal da seguinte forma: seis lavagens com 200 μL de PBS-T2 (PBS contendo 1% de Tween-20), três lavagens com uma pipeta, três lavagens com 200 μL de PBS, três lavagens com uma pipeta.
  3. Detecção e análise de fluorescência
    1. Adicione 200 μL de PBS e registre a fluorescência a 520 nm em um leitor de microplacas de fluorescência. Salve os resultados em um software de planilha.
      NOTA: A biotina-fluoresceína é usada como um controle positivo para a ligação da estreptavidina e detecção de fluorescência a 520 nm. Espera-se uma leitura reprodutível de 30.000–40.000 U.A. com biotina-fluoresceína de 0,26 μM. Todas as amostras são analisadas em triplicata, incluindo os controles.
    2. Calcular o desvio padrão para cada reação e calcular os valores de P para controles negativos e amostras positivas usando o teste t não emparelhado usando um software estatístico.

3. Ensaio de placa multipoço

NOTA: No dia 1 configurar a reacção Lnt em placas de 384 poços (passo 3.1) e revestir 384 placas de poço com estreptavidina (passo 3.2).

  1. Preparação de mistura de reagentes e reação enzimática
    NOTA: A quantidade de reagentes e enzima é reduzida em comparação com o ensaio do tubo e a reação de Lnt é realizada diretamente em placas de 384 poços. Isso permite o uso de menos material e uma redução de etapas que podem ser ainda mais automatizadas.
    1. Misture os substratos da seguinte forma: alquino-PAPE (concentração final de 50 μM do estoque de 500 μM) e FSL-1-biotina (50 μM final do estoque de 500 μM) em tampão de reação Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 contendo 1% BSA) a um volume de 13,5 μL por reação por poço em um formato de placa de 384 poços. Executar todas as condições em triplicado. Calcule a quantidade total de reagentes necessários para o número de reações a serem realizadas (ou seja, 5.184 μL para uma placa de 384 poços).
    2. Sonicate a mistura de substrato por 3 minutos em um banho de água ultra-sônico.
    3. Alíquota 13,5 μL da mistura de substrato por poço em uma placa de 384 poços.
      NOTA: Como um controle negativo, 10 mM de MTSES (solução de estoque de 625 mM em 100% DMSO) podem ser adicionados por poço. Ajustar o volume do tampão Lnt (passo 3.1.1) para atingir um volume de reacção final de 13,5 μL.
    4. Incubar a 37 °C durante 5 minutos antes da adição da enzima Lnt (etapa 3.1.5).
    5. Adicionar 0,5 ng/μL (correspondente a 8,6 nM) da enzima Lnt ativa, ou variante inativa (C387S) (1,5 μL do estoque de 5 ng/μL em buffer WA contendo 0,05% DDM) no tampão de reação Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 1% BSA) a cada poço contendo a mistura de reação da etapa 3.1.3. Misture os reagentes pipetando para cima e para baixo. O volume total de reação é de 15 μL.
    6. Sele a placa com folha de plástico para placas de vários poços.
    7. Incubar a 37 °C durante 16 h numa termineira com tampa aquecida.
  2. Revestimento de estreptavidina 384 placas de poço
    1. Use 75 μL de estreptavidina (10 μg/mL em H 2 O) daetapa 2.2.2 para revestir poços de uma placa de 384 poços. Deixar a estreptavidina ligar-se à placa incubando a 37 °C durante a noite sem tampa para secar os poços ao ar.

NOTA: No dia 2, execute a química de cliques (etapa 3.3), ligue a mistura de reação de Lnt a placas revestidas com treptavidina (etapa 3.4), detecte a fluorescência e analise os resultados (etapa 3.5).

  1. Reação de click-chemistry
    1. Preparar soluções-mãe de Azido-FAM (1,2 mM em DMSO), TCEP (cloridrato de fosfina tris(2-carboxietil); 24 mM preparado em H 2 O), TBTA (Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina; 0,48 mM em tert-butanol:DMSO (4:1)) e CuSO4∙5H 2 O (24 mM preparados na hora em H2O).
    2. Combine os três reagentes de click-chemistry: uma mistura de Azido-FAM (concentração final de 50 μM), TCEP (1 mM final) e TBTA (0,02 mM final), cada um a 0,75 μL em volume final de 2,25 μL por poço. Calcule o volume necessário por placa de 384 poços (ou seja, use 864 μL quando todos os poços da placa de 384 poços forem usados). Misture vigorosamente.
    3. Adicionar 2,25 μL da solução reagente por alvéolo directamente à reacção Lnt concluída na placa de 384 alvéolos da fase 3.1.7.
    4. Misture pipetando para cima e para baixo com uma pipeta eletrônica multicanal.
    5. Adicione CuSO4 (0,75 μL do estoque de 24 mM para uma concentração final de 1 mM) e misture pipetando para cima e para baixo com uma pipeta eletrônica multicanal.
    6. Incubar no RT por 1 h no escuro.
  2. Ligação da mistura de reação de Lnt a placas de 384 poços revestidas com estreptavidina
    1. Lavar os poços das placas revestidas com estreptavidina após a incubação durante a noite a partir do passo 3.2.1 1x com 85 μL PBS-T1.
    2. Transferir 11 μL da reacção click-chemistry de cada alvéolo da placa de incubação do passo 3.3.6 para a placa revestida de estreptavidina a partir do passo 3.4.1 para ligar o produto N-acil-FSL-1-biotina-FAM às placas de estreptavidina.
    3. Adicione 64 μL de buffer PBS-T1.
    4. Incluir biotina-fluoresceína (0,19 μM de um estoque de 3,1 mM em DMSO) como um controle para ligação a poços revestidos com estreptavidina.
    5. Incubar as placas de 384 poços em RT por 1 h no escuro em uma termificante, agitando a 300 rpm.
    6. Lave as placas usando uma lavadora de placas automatizada da seguinte forma: 10 lavagens com 85 μL PBS-T2, as placas são agitadas entre as lavagens; 5 lavagens com PBS de 85 μL, as placas são agitadas entre as lavagens.
  3. Detecção e análise de fluorescência
    1. Adicionar PBS (85 μL) e registrar a fluorescência em um leitor de microplacas de fluorescência a 535 nm.
    2. Analise os dados conforme descrito (etapa 2.5.2).

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Resultados

Na reação Lnt, o ácido graxo sn-1 dos fosfolipídios é transferido para um peptídeo diacilglicerila, resultando em peptídeo triacilado maduro8. O ensaio de Lnt in vitro descrito aqui é projetado para usar fosfolipídios contendo um ácido graxo alcino (alquino-POPE) e FSL-1-biotina como substratos, resultando na formação de alquino-FSL-1-biotina. Após uma reação de click-chemistry com azido-FAM, este produto deve ser marcado fluorescentemente e detectado por espectrometria de fluorescência (...

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Discussão

O protocolo para o ensaio de Lnt aqui descrito, baseado na detecção de fluorescência do produto triacilado, é sensível e reprodutível. A ligação específica e eficiente da biotina à estreptavidina é um elemento-chave no ensaio. O substrato Alquino-PAPA deixado após a conclusão da reação Lnt também é marcado fluorescentemente com FAME, mas é eficientemente removido após a ligação às placas de estreptavidina por várias etapas de lavagem. Além disso, a adição de DMSO não afeta a atividade de Lnt e não tem impacto no ensaio. ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a Fabrice Agou e Alix Boucharlat da Plataforma de Triagem Quimiogenômica e Biológica, Centro de Recursos Tecnológicos e Pesquisa (C2RT) do Institut Pasteur Paris por sugestões úteis sobre o protocolo, a todos os membros da Unidade BGPB por apoio e discussões científicas e a Simon Legood pela leitura crítica do manuscrito. O trabalho foi financiado pelas Iniciativas de Cuidados Globais do Instituto Carnot Doenças Infecciosas e do Instituto Carnot Micróbios e Saúde (15 CARN 0017-01 e 16 CARN 0023-01).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ä Sistema FPLC Purificadorkta GE HealthcareNAPureza: NA
Purificação
Lnt alcino-POPEAvanti Lipídios Polares900414PPureza: >99%
Substrato Lnt
Azido-FAMLumiprobeA4130Pureza: 100% (puro)
Reagente Click
Biofotômetro PlusEppendorfN/APureza: NA
OD 600 nm
BioTek ELX 405 Selecione a arruela de placasBioTekN° série 115800, n° material 405 Selecionea pureza: NA
Etapas de lavagem
biotina-fluoresceínaSigma53608Pureza: ≥ 90%
Controle de fluorescência
Sulfato de cobre(II) pentahidratadoSigmaC3036Pureza: ≥ 98%
Clique no reagente
DDMAnatraceD310APureza: ≥ 99% β+α; < 15% α
Detergente para purificação de Lnt
Dimetilsulfóxido (DMSO)InvitrogenD12435Pureza: anidro
Solbilização Reagente de clique
Pipeta eletrônica Voyager 8 canais 0,5-12,5 uLINTEGRA4721Pureza: NA
Manuseio de reagentes
Célula de pressão francesaN/AN/APureza: NA
Ruptura celular
FSL-1-biotinaMicrocoleções EMCL7030Pureza: substrato NA
Lnt
Greiner Bio-One Microplaca de poliestireno CELLSTAR padrão de 384 poçosGreiner781091Pureza: NA
Preto com fundo transparente (leitura para cima ou para baixo)
Placa de poliestireno estéril Greiner Bio-One de 96 poços, 655097 de alta ligaçãoPureza: NA
Preto com fundo transparente (leitura para cima ou para baixo)
Leitor de microplacas Infinite M1000 proTecanN/APureza: NA
Detecção de fluorescência
MTSES (sódio (2-sulfonatoetil)metantiossulfonato)AnatraceS110MTPureza: ~100%
Inibidor específico de tiol
Folhas de vedação adesiva opticamente transparentesThermo ScientificAB-1170Pureza: NA
Folha para selar placa multipoços
Sephacryl S400 HR 16/60 gel coluna de filtraçãoGE HealthcareGE28-9356-04Pureza: NA
Lnt purificação
StrepTactin Sepharose 50 %IBA Biotechnology2-1201-010Pureza: NA
Lnt purificação
streptavidinSigmaS4762-1MGPureza: ≥ 13 unidades/mg de proteína
Ligação à biotina
TBTA (tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]aminaSigma678937Pureza: 97%
Clique no reagente
TCEP (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfinaSigma75259Pureza: ≥ 98%
Reagente de clique
TECAN Infinite F500TecanN/APureza: NA
Detecção de fluorescência
TECAN Infinite M1000 proTecanN/APureza: NA
Detecção de fluorescência
Thermomixer CEppendorf5382000015Pureza: NA
Tampa aquecida
Triton X-100Sigma93443Pureza: 10% em H2O
Tampão de reação Lnt
Ultra centrífugaBeckman LCN/APureza: NA
Fracionamento celular

Referências

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