Desenvolver e testar dispositivos endovasculares para tratamento de aneurisma intracraniano ainda é de grande importância. A maioria dos modelos de aneurisma usados hoje sentem falta das características importantes de uma parede arterial degenerada ou da hemodinâmica de uma verdadeira bifurcação. Por isso, buscamos projetar um novo modelo de bifurcação de bolsa arterial em coelhos.
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Artigo de método
Modelo de Aneurisma de Bifurcação Microcirúrgica arterial no Coelho
Neste artigo
Resumo
Resumo
O tratamento endovascular para aneurismas intracranianos ganhou importância nas últimas décadas, consequentemente há uma necessidade crescente de testar dispositivos endovasculares. Modelos animais respeitando as condições reológicas, hemodinâmicas e aneurismas são altamente justificados. Por isso, o objetivo do presente estudo foi projetar uma nova técnica cirúrgica padronizada e reprodutível para criar aneurismas de bifurcação de bolsa arterial autóloga com condições de parede não modificadas e modificadas em coelhos.
Os aneurismas de bifurcação foram criados por anastomose de ponta a ponta da direita na artéria carótida comum esquerda, ambas servindo como artérias parentais para a bolsa arterial, que foi microsurgicamente costurada. Os enxertos foram retirados da artéria carótida comum proximal direita, seja para o controle (n = 7, reimplicação autóloga imediata) ou modificada (n = 7, incubada com 100 unidades internacionais elastase por 20 minutos antes da re-implantação autóloga). A malote e a patência da artéria dos pais foram controladas pela angiografia da fluorescência imediatamente após a criação. No seguimento (28 dias), todos os coelhos foram submetidos à angiografia de ressonância magnética e angiografia de fluorescência, seguida de colheita de aneurisma, avaliação macroscópica e histológica.
Um total de 16 coelhos brancos da Nova Zelândia foram operados. Dois animais morreram prematuramente. No seguimento, 85,72% de todos os aneurismas permaneceram patente. Ambos os grupos revelaram um aumento no tamanho do aneurisma ao longo do tempo; isso foi mais pronunciado no grupo controle (6,48 ± 1,81 mm3 no momento da criação versus. 19,85 ± 6,40 mm3 no seguimento, p = 0,037) do que no grupo modificado (8,03 ± 1,08 mm3 no momento da criação contra 20,29 ± 6,16 mm3 no seguimento, p = 0,054).
Nossos achados demonstram a adequação desse novo modelo de coelho que permite a criação de aneurismas de bifurcação com diferentes condições de parede em uma abordagem microcirúrgica. Dada a excelente patency a longo prazo e a propriedade do crescimento do aneurisma ao longo do tempo, este modelo pode servir como uma importante ferramenta para avaliação pré-clínica de novas terapias endovasculares.
Introdução
Hemorragia subaracnóide resultante da ruptura do aneurisma intracraniano (IA) pode ser efetivamente controlada por técnicas de oclusão endovascular ou microcirúrgica 1,2,3,4. Diferentes terapias endovasculares, para superar a principal limitação da recidiva da IA após o enrolamento, ganharam importância nas últimas décadas gerando uma necessidade crescente de testar dispositivos endovasculares. Para testar essas novas abordagens de tratamento, modelos animais apropriados que respeitam as propriedades reológicas, as condições de hemodinâmica e aneurisma são altamente justificadas 5,6,7. Nesse contexto, estudos clínicos e pré-clínicos já revelaram o importante papel das condições da parede do aneurisma em relação à ruptura e recorrência do aneurisma após a oclusão, especialmente com foco na perda de células mural 7,8,9.
Até agora, aneurismas experimentais em coelhos têm sido mais frequentemente criados por tocos de artéria carótida comum (CCA) incubados por elastase ou por bolsas venosas suturadas em uma bifurcação cca artificial. 10,11,12,13,14,15,16 Assim, nunca foi descrito um verdadeiro modelo de bifurcação de bolsa arterial.
O objetivo deste estudo foi projetar uma técnica segura, rápida e padronizada para a criação microcirúrgica de aneurismas bifurcação com diferentes condições de parede em um modelo de coelho (Figura 1). Isso foi conseguido através da sutura de bolsas arteriais não modificadas e modificadas em uma bifurcação artificial criada de ambos os CCAs.
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Protocolo
Todos os cuidados veterinários foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais (todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Local de Cuidados Com Animais do Cantão Bern, Suíça (BE 108/16)) e realizados sob supervisão de um anestesista veterinário certificado pelo conselho. As diretrizes de ARRIVE e os princípios 3R foram rigorosamente seguidos17,18.
NOTA: Abrigar todos os animais a uma temperatura ambiente de 22\u201224 Celsius (°C) e manter um ciclo claro/escuro de 12 horas.. Forneça acesso gratuito à dieta de água, pelotas e ad libitum hay todas as vezes. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o teste não paramétrico Wilcoxon-Mann-Whitney-U. Considerou-se significativo um valor de probabilidade (p) de ≤ 0,05.
1. Fase pré-úrgica
- Realize um exame clínico pré-operatório detalhado de todos os coelhos planejados para a cirurgia imediatamente próximo a uma sala de cirurgia tranquila e asséptica mantendo uma temperatura de 23 ± 3 °C.
- Registo o peso de cada animal, avalie macroscopicamente as membranas mucosas, o tempo de recarga capilar e a qualidade do pulso.
- Mais adiante, realize a auscultação cardíaca com estetoscópio e palpação abdominal.
- Com base nos achados clínicos, atribuem uma classificação da Sociedade Americana de Anestesiologistas (ASA) a cada coelho19. Inclua apenas animais com pontuação ASA I no estudo.
- Raspe ambas as orelhas externas com um barbeador elétrico e aplique creme prilocaine-lidocaína em artérias e veias auriculares.
- Sedar o coelho com uma combinação de 20 miligramas (mg)/killograma (kg) de cetamina, 100 mg/kg de dexmedetomidina e 0,3 mg/kg de metadona injetada subcutânea (SC) através de uma seringa.
- Deixe cada animal imperturbável por pelo menos 15 minutos.
- A partir daí, sob oxigenação suplementar com 3 litros (l) /minuto (min) através de uma máscara facial solta e monitoramento constante através de um oxímetro de pulso, coloque uma cânula de 22 G na artéria central auricular esquerda e outra cânula de 22 G na veia auricular do ouvido contralateral.
- Raspe o campo cirúrgico (pescoço) e injete 0,75% de ropivacaína peri-incisional intradermicamente. Em seguida, raspe a testa e prepare-se para colocar sensores eletroencefalográficos pediátricos (EEG).
- Induzir anestesia geral com propofol 1-2 mg/kg por via intravenosa (IV) para efeito. Em seguida, entuba imediatamente a traqueia de todos os coelhos com um tubo de silicone (3 milímetros (mm) de diâmetro interno sob controle capnográfico. Depois, transporte todos os coelhos para a sala de cirurgia, coloque-os em recumbência dorsal e conecte o tubo a um sistema de círculo pediátrico.
- Alcançar o aprofundamento e manutenção da anestesia através de isoflurano em oxigênio, visando uma concentração máxima de isoflurane de extremidade máxima de 1,3%.
- Garantir o monitoramento clínico e instrumental (oximetria de pulso, doppler e pressão arterial invasiva, eletrocardiograma de 3 chumbo, EEG, monitoramento da temperatura retal e gases inalados e expirados) até a extubação traqueal.
- Para manter a hidratação, forneça o lactato de Ringer a uma infusão de taxa contínua (CRI) de 5 ml/kg/h através do acesso venoso. Confirme sempre a anestesia adequada usando pinças do dedo do dedo em um intervalo de 10 minutos.
- Desinfete o campo cirúrgico usando iodo povidone do manúbrio sterni para ambos os ângulos da mandíbula. Agora, realize o draping estéril do campo cirúrgico.
- Durante a cirurgia, forneça analgesia com lidocaína a um CRI de 50 microgramas (μg)/kg/min e fentanil a 3\u201210 μg/kg/h. Aplique ventilação espontânea ou assistida, bem como hipercapnia permissiva. Realize a análise de gás arterial pelo menos uma vez durante a cirurgia.
- Tratar hipotensão relevante (pressão arterial média < 60 mmHg) com noradrenalina. Evite hipotermia (temperatura retal ≤ 38 °C) usando uma almofada de aquecimento ou um sistema de aquecimento forçado de aquecimento.
2. Fase cirúrgica – Passo I
- Inicie a cirurgia com uma incisão mediana da pele do manúbrio sterni ao nível dos ângulos da mandíbula/laringe. Dissecar bruscamente a pele e o tecido mole com um bisturi, tesoura cirúrgica e fórceps. Separe o subcutis e o bloco de gordura medialmente por dissecção sem cortes.
- Entre no cume superior anterior do músculo estenicleidomastoide mediadamente no lado esquerdo por dissecção contundente, usando micro fórceps e tesoura cirúrgica.
- Macroscopicamente, realize a preparação contundente e separe cuidadosamente a CCA esquerda do nervo vagal distally para evitar parese laríngea usando ainda mais micro fórceps e tesoura cirúrgica (Figura 2). Note-se que a bifurcação da CCA esquerda serve como marco intraoperatório (Figura 3 e Figura 4A). Para todas as etapas seguintes, use um espalhador de tecido mole para melhorar a visualização cirúrgica.
- Após a preparação bem sucedida e a liberação da CCA distal esquerda do nervo vagal, administre papaverina (40 mg/ml, 1:1 diluída em 0,9% solução isotônica de cloreto de sódio) localmente. Proteja continuamente todos os segmentos de embarcações com micro cotonetes seguidos de uma administração papaverina externamente. Coloque a CCA esquerda encharcada de papaverina abaixo do tecido muscular autólogo para proteger o vaso da secagem sob a luz do microscópio de operação.
- Mude de lado enquanto maximiza o conforto do cirurgião durante o procedimento cirúrgico. Repita o mesmo procedimento cirúrgico no lado direito. Disseque a CCA distral e proximally até os marcos predefinidos (bifurcação carótida ao nível dos ângulos da mandíbula/laringe e veia jugular interna; Figura 4A,B). Reinserir um espalhador e administrar micro cotonetes e papaverina como descrito anteriormente.
- Antes da ligadura do CCA proximal direito, injete heparina (500 unidades internacionais (UI)/kg) sistematicamente através de um cateter auditivo venoso.
- Use um microscópio cirúrgico de agora em diante. Primeiro, ligar a CCA proximal direita com uma sutura 4-0 não absorvível diretamente no final do marco proximal macroscopicamente visível para evitar qualquer tensão no vaso arterial.
- Em segundo lugar, aplique uma ligadura 6-0 não absorvível exatamente 4\u20125 mm distally usando um clipe de vaso para medição, considerando que após cortar distally da primeira ligadura 4-0, a bolsa arterial resultante será de comprimento padronizado de cerca de 3\u20124 mm em cada animal (Figura 5A,C).
- Depois de apertar a ligadura 6-0, aperte a CCA direita o mais longe possível com um clipe de vaso temporário (como normalmente usado em cirurgia de aneurisma cerebral) para evitar qualquer dano endotelial e criar um longo segmento de vaso para irrigação, a fim de prevenir trombogênese (Figura 5B).
- Agora faça um corte distally para a ligadura 4-0 não absorvível. Para colher a bolsa arterial (Figura 5C), realize um segundo corte distally para a ligadura 6-0 não absorvível.
- Limpe a bolsa arterial meticulosamente de todo tecido mole e meça seu comprimento, largura e profundidade (Figura 5C) com um clipe de vaso. Se não for necessário mais modificações, mantenha o enxerto arterial autólogo em uma solução heparinizada (500 UI/100 ml em cloreto de sódio isotônico de 0,9%) à temperatura ambiente até uso posterior.
3. Degradação da bolsa arterial
- Se for necessária uma degradação da bolsa arterial, limpe-o meticulosamente do tecido mole e pré-insuse com 100 UI de elastase suína dissolvida em 5 ml de tris-tampão à temperatura ambiente no dia do experimento por 20 minutos. Não use uma técnica de escova. Incubar a bolsa arterial intra e extra-luminally usando um shaker.
- Antes de colocar a bolsa em uma solução heparinizada de cloreto de sódio isotônico de 0,9%, deslize-a três vezes por 3 minutos com fórceps anatômicos em 0,9% solução isotônica de cloreto de sódio para lavar o restante da descoramas porcina.
- Se necessário, mantenha o lúmen da bolsa arterial aberto com um microtubo feito de silicone; proteger meticulosamente a CCA esquerda e direita durante todo o procedimento cirúrgico com micro estofamentos molhados.
4. Fase cirúrgica – Passo II
- Para uma preparação adicional da CCA, coloque dois micro cotonetes redondos diretamente abaixo dela para mover a artéria de forma mais superficial. Agora, coloque um micro cotonete com um estofamento roxo sob a CCA esquerda no terço distal para melhor visualização da artéria.
- Lave a CCA proximal direita com uma solução de cloreto de sódio isotônico de 0,9% combinado com 500 UI de heparina dissolvida em 100 ml de cloreto de sódio isotônico de 0,9%. Para criar uma anastomose livre de tensão, coloque a CCA direita sob a musculatura de almofada de gordura/peritracheal usando uma tesoura cirúrgica para túnel para o lado esquerdo. Remova o tecido mole da artéria.
- Agora realize uma incisão bucal de 2 mm no lado proximal da CCA direita usando uma micro tesoura e fórceps.
- Mude o lado da mesa de operação. Corte a CCA distal esquerda com outro clipe temporário de vaso seguido pela CCA esquerda proximal com dois clipes temporários de vaso. Proteja todos os segmentos de vasos expostos de secar sob a luz cirúrgica usando micro cotonetes molhados.
- Liberte o terço distal da CCA esquerda completamente do tecido mole e realize uma arteriotomia. Use micro fórceps cirúrgicos e pegue delicadamente alguns tecidos moles. Agora eleve a artéria e incise a CCA distal esquerda lentamente com uma micro tesoura cirúrgica. Lave os segmentos de vasos com heparina (500 UI dissolvida em 100 ml de solução isotônica de cloreto de sódio 0,9%).
- Após a realização da arteriotomia com micro fórceps curvados e micro tesouras, amplie a arteriotomia localizada no terço distal da CCA esquerda, medindo cerca de 2 vezes do diâmetro da direita da artéria carótida e do enxerto autólogo. Isso permite o fluxo sanguíneo suficiente para a bolsa arterial.
- Tire a bolsa arterial da solução salina heparinizada. Coloque a bolsa no campo cirúrgico, onde a bifurcação está planejada. Comece a suturar a parte traseira da direita carótida sem corte, localizada com uma sutura 9-0 não absorvível, seguida de uma sutura no lado traseiro cranialmente localizado ao nível da incisão da boca do peixe. Finalize a costura da parte traseira do distal ao proximal por pontos únicos.
- Enquanto sutura, mantenha todas as bolsas pré-insubadas elas úmidas com irrigação contínua. Enquanto suturar a parede do vaso da bolsa, use micro fórceps cirúrgicos curvos para abrir suavemente o lúmen com sua ponta. Sempre que suturar partes da CCA direita esquerda ou proximal, use micro fórceps cirúrgicos retos. Depois, suturar a parte traseira horizontal.
- Em seguida, suturar o lado frontal horizontal, começando na cúpula do aneurisma movendo-se para sua base. Depois, comece com pontos individuais no lado da frente movendo-se caudally.
- Para todas as etapas 4.5\u20124.8 enquanto sutura a anastomose preste atenção apenas para pegar a parte do vaso perto da arteriotomia para evitar estenose iatrogênica. Além disso, umedeça continuamente todos os segmentos de vasos durante todo o procedimento cirúrgico extraluminal com uma seringa cheia de solução de cloreto de sódio heparinizado (500 UI dissol dissol em 100 ml de cloreto de sódio isotônico) e proteja-os com micro cotonetes molhados.
- Antes de terminar a anastomose, irrigar todo o complexo com solução de cloreto de sódio isotônico heparinizada de 0,9% intraluminal (500 UI dissol em 100 ml de cloreto de sódio isotônico) de 0,9%). Cuidado para que bolsas arteriais modificadas elastase devem ser costuradas o mais rápido possível devido à sua forte tendência de secar e trombose. Devido ao comportamento agressivo da concentração de elastase residual na bolsa em relação à digestão de vasos circunferenciais, proceda rapidamente com a cirurgia para reutilizar rapidamente o complexo do vaso.
- Remova todos os grampos vasculares temporários em sentido passo a passo.
- Remova o grampo distal da CCA esquerda. Aceite um sangramento menor e agite-o imprimindo suavemente micro cotonetes na anastomose. Em seguida, remova o grampo da CCA direita, pressione suavemente com micro swab e fórceps para evitar a formação de trombos.
- Se necessário, substitua os clipes vasculares temporários para fornecer coagulação suficiente. Depois, alivie os dois clipes do vaso do lado esquerdo proximally. Se necessário em qualquer etapa, substitua os clipes para permitir a coagulação ou para realizar a re-costura.
- Nesta fase realizam a angiografia da fluorescência do complexo vaso (Figura 6 e Figura 7).
NOTA: A angiografia da fluorescência é realizada administrando 1 ml de fluoresceína IV, utilizando 2 filtros de bandpass, um smartphone com câmera de vídeo e um holofote de bicicleta. Este procedimento já foi descrito em outros lugares 20,21,22. - Por último, feche o situs operacional. Readapt e sutura suavemente a almofada de gordura com uma sutura 3-0 resorbável com nódulos únicos para proteger a anastomose. Feche subcutis e pele da mesma forma.
5. Fase pós-úrgica
- Descontinuar a administração de isoflurane e analgesia sistêmica no final da cirurgia e fornecer extubação traqueal assim que o reflexo de engolir tiver retornado.
- Administrar 0,5 mg/kg de meloxicam IV, aspirina 10 mg/kg (ASS) IV, 100 μg de vitamina B12 SC e 20 mg/kg de clamoxyl IV.
- Fornecer oxigenação suplementar e aquecimento ativo até que os coelhos tenham recuperado espontaneamente a recumência severa.
- Realizar acompanhamento pós-operatório e cuidados com animais quatro vezes ao dia nos três primeiros dias, de acordo com as diretrizes para avaliação e manejo da dor em roedores e coelhos23,24.
- Administre analgesia pós-operatória através de um patch de fentanil (12 μg/h) aplicado no ouvido externo, meloxicam uma vez por dia SC por três dias e metadona como terapia de resgate SC, de acordo com a folha de pontuação para avaliação da dor. Administre 250 UI/kg de heparina de baixa molecular (LMH) subcutânea por três dias em todos os coelhos.
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Resultados
Após uma série piloto de sete animais, totalmente 16 animais foram incluídos no protocolo experimental. Dois animais morreram prematuramente e, portanto, foram excluídos da análise final (12,5% de mortalidade). Calculada em 14 animais, a taxa imediata de patência de aneurisma durante a angiografia da fluorescência foi de 71,43% em ambos, no grupo controle e modificado. Quatro aneurismas tiveram que ser reabertos com evacuação consecutiva de trombos e após uma repetida angiografia de fluorescência houve uma patência docum...
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Discussão
Nosso estudo demonstra a viabilidade de criar um verdadeiro modelo de aneurisma de bifurcação com diferentes condições de parede em coelhos. No total, 14 coelhos brancos da Nova Zelândia com peso médio de 3,7 ± 0,09 kg e idade média de 112 ± 3 dias foram incluídos no estudo. 85,72% de todos os aneurismas permaneceram patenteados durante um seguimento aos 28 dias. Dois animais morreram prematuramente (12,5% de mortalidade).
Estudos anteriores sugeriram uma variedade de modelos de aneurisma extr...
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Divulgações
Este trabalho foi apoiado pelos fundos de pesquisa do Conselho de Pesquisa, Kantonsspital Aarau, Aarau, Suíça e da Fundação Nacional de Ciência snf (310030_182450). Os autores são os únicos responsáveis pelo desenho e conduta do estudo apresentado e não declaram interesses concorrentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Olgica Beslac e Kay Nettelbeck pelo excelente apoio e assistência técnica durante a fase peri-operatória e a Alessandra Bergadano, DVM, PhD, pela supervisão dedicada da saúde animal a longo prazo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sutura reabsorvível 3-0 | Ethicon Inc., EUA | VCP428G | |
| Sutura não absorvível 4-0 | B. Braun, Alemanha | G0762563 | |
| Sutura não absorvível 6-0 | B. Braun, Alemanha | C0766070 | |
| Sutura não absorvível 9-0 | B. Braun, Alemanha | G1111140 | |
| Adrenaline | Amino AG | 1445419 | qualquer genérico |
| A Amiodarona | Helvepharm AG | 5078567 | qualquer aparelho de |
| anestesia | Drä ger | qualquer outra | |
| Aspirina | Sanofi-Aventis (Suisse) SA | 622693 | qualquer |
| genérico Atropina | Labatec Pharma SA | 6577083 | qualquer filtro Bandpass genérico |
| azul | Thorlabs | FD1B | qualquer outro |
| filtro Bandpass verde | Thorlabs | FGV9 | qualquer outro |
| Fórceps | qualquer outro | ||
| Projetor | qualquer outro | ||
| clipe de vaso Biemer (2 x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Suíça | FD560R | índice |
| bispectral temporário (neonatal) | qualquer outro | ||
| manguito de pressão arterial (neonatal) | qualquer outro | ||
| Clamoxyl | GlaxoSmithKline AG | 758808 | qualquer genérico |
| Dexmedetomidina | Ever Pharma | 136740-1 | qualquer |
| eletrodo | qualquer outro | ||
| Elastase | Sigma Aldrich | 45125 | AG genérica |
| 1435734 | qualquer | ||
| Esmolol | genérico OrPha Swiss GmbH | 3284044 | qualquer |
| fentanil genérico (uso intravenoso) | Janssen-Cilag AG | 98683 | qualquer |
| Fentanil genérico (transdérmico) | Mepha Pharma AG | 4008286 | qualquer |
| Fluoresceína | Curatis AG | 5030376 | qualquer |
| genérico Fragmin | Pfizer PFE Switzerland GmbH | 1906725 | qualquer |
| Glyco | genérico qualquer | ||
| almofada | qualquer outro | ||
| Solução isotônica de cloreto de sódio (0,9%) | Fresenius KABI | 336769 | genérica |
| Pfizer | 342261 | qualquer | |
| agitador de laboratório | Stuart | SRT6 | qualquer outra |
| lidocaína | Streuli Pharma AG | 747466 | qualquer |
| Longuettes | qualquer outro | ||
| Metacam | A Boehringer Ingelheim | P7626406 | genérica |
| Streuli Pharma AG | 1084546 | qualquer | |
| microtubo | qualquer outro | ||
| porta-agulha | qualquer outro | ||
| Midazolam | Accord Healthcare AG | 7752484 | qualquer |
| porta-agulha | qualquer outro | ||
| O2-Máscara | qualquer outro | ||
| microscópio de operação | Wild Heerbrugg | qualquer outro | |
| Papaverine | Bichsel | qualquer creme genérico | |
| de prilocaína-lidocaína | Emla | qualquer genérico | |
| Propofol | B. Braun Medical AG, Suíça | qualquer | |
| genérico Oxímetro | qualquer genérico | ||
| Sonda de temperatura retal (neonatal) | qualquer outra | ||
| Ropivacaína | Aspen Pharma Schweiz GmbH | 1882249 | qualquer genérico |
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | qualquer outro |
| Barbeador | qualquer outro | ||
| Smartphone | qualquer outro | ||
| Pinça de tecidos moles | qualquer outro | ||
| Espalhador de | qualquer outro | ||
| Tigelas | qualquer outro | ||
| Micro cotonetes | qualquer outro | ||
| Estetoscópio | qualquer outro | ||
| Micro-fórceps | |||
| Micro-tesoura reta e curva | qualquer outro | ||
| reta e curva | qualquer outra | ||
| Cirurgia drapejar | qualquer outra | ||
| tesoura | qualquer outra | ||
| Seringas 1 ml, 2ml e 5 ml | qualquer outro | ||
| Tris-Buffer | Sigma Aldrich | 93302 | qualquer |
| aplicador de clipe vascular | B. Braun, Alemanha | FT495T | |
| Cateter venoso e arterial 22 G | qualquer | ||
| Vitarubin | genérico Streuli Pharma AG | 6847559 | qualquer |
| clipe padrão Yasargil titan genérico (2 x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Suíça | FT242T | temporário |
Referências
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