Artigo de método

Rastreamento de partículas 3D para análise in vivo não invasiva da dinâmica dos microtúbulos sinápticos em dendritos e junções neuromusculares de Drosophila

DOI:

10.3791/61159

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12 de maio de 2020

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1Blavatnik Institute of Cell Biology and Program in Neuroscience, Harvard Medical School, 2DRVision Technologies LLC

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este estudo apresenta uma estratégia de imagem neuronal intravital não invasiva combinada com uma nova estratégia de software para obter rastreamento e análise automatizados e imparciais da dinâmica de microtúbulos (MT) in vivo nos dendritos sensoriais e nas junções neuromusculares de Drosophila.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os microtúbulos (MTs) desempenham papéis críticos no desenvolvimento neuronal, mas muitas questões permanecem sobre os mecanismos moleculares de sua regulação e função. Além disso, apesar do progresso na compreensão dos MTs pós-sinápticos, muito menos se sabe sobre as contribuições dos MTs pré-sinápticos para a morfogênese neuronal. Em particular, estudos da dinâmica de MT in vivo em dendritos sensoriais de Drosophila produziram insights significativos sobre o comportamento em nível de polímero. No entanto, os desafios técnicos e analíticos associados à imagem ao vivo da junção neuromuscular da mosca (NMJ) limitaram estudos comparáveis da dinâmica pré-sináptica da MT. Além disso, embora existam muitas estratégias de software altamente eficazes para análise automatizada da dinâmica de MT in vitro e ex vivo, os dados in vivo geralmente exigem entrada significativa do operador ou análise totalmente manual devido à relação sinal-ruído inerentemente inferior nas imagens e à morfologia celular complexa.  Para resolver isso, este estudo otimizou uma nova plataforma de software para detecção de partículas in vivo automatizada e imparcial. A análise multiparamétrica de imagens confocais de lapso de tempo ao vivo de MTs marcados com EB1-GFP foi realizada em dendritos e no NMJ de larvas de Drosophila e encontrou diferenças marcantes nos comportamentos de MT. A dinâmica da MT foi analisada após o knockdown da proteína associada à MT (MAP) dTACC, um regulador chave do desenvolvimento da sinapse de Drosophila, e identificou mudanças estatisticamente significativas na dinâmica da MT em comparação com o tipo selvagem. Esses resultados demonstram que essa nova estratégia para a análise multiparamétrica automatizada da dinâmica de MT pré e pós-sináptica no nível do polímero reduz significativamente os critérios de human-in-the-loop. Além disso, o estudo mostra a utilidade deste método na detecção de comportamentos distintos de MT após o knockdown de dTACC, indicando uma possível aplicação futura para telas funcionais de fatores que regulam a dinâmica de MT in vivo. Aplicações futuras deste método também podem se concentrar na elucidação do tipo de célula e/ou comportamentos de MT específicos do compartimento, e imagens correlativas multicoloridas de EB1-GFP com outros marcadores celulares e subcelulares de interesse.

Introdução

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As células se organizam para formar estruturas funcionais por meio da coordenação de alterações intra e intercelulares via morfogênese. Um exemplo notável de morfogênese é o desenvolvimento da estrutura neuronal altamente especializada. Os neurônios exibem uma polarização notável, na qual estendem dois tipos de processos estrutural e funcionalmente distintos, dendritos e axônios1, que podem atingir comprimentos imensos. A complexidade do desenvolvimento neuronal surge não apenas do tamanho dos dendritos e axônios, mas também da dificuldade em formar suas geometrias intrincadamente ramificadas 2,3. A morfogênese neuronal e suas consequências na aprendizagem e na memória4 motivam a investigação contínua de seu controle genético e dos mecanismos biológicos celulares subjacentes. Tais mecanismos incluem, mas não estão limitados a, transporte de membrana intracelular e os muitos rearranjos do citoesqueleto necessários para mudanças na morfologia neuronal 1,2,3.

Estudos de morfogênese neuronal produziram uma variedade de técnicas avançadas de visualização. Métodos estáticos, como microscopia eletrônica ou microscopia de fluorescência de sondas fixas, são amplamente utilizados para realizar análises morfológicas e estruturais de alta resolução. No entanto, além dos artefatos que são inevitáveis a qualquer método de preservação, a visualização estática não pode capturar as mudanças dinâmicas que sustentam a morfogênese. Assim, muitos insights fundamentais se originaram da microscopia de fluorescência de lapso de tempo de tecidos vivos. Os primeiros trabalhos de Lichtman e colegas 5,6,7 utilizaram imagens in vivo do sistema nervoso de mamíferos para investigar a regeneração/degeneração do axônio, organização dos componentes sinápticos e transporte axonal de longo alcance. Além disso, estudos seminais em explantes neuronais primários foram críticos para estabelecer a importância da dinâmica dos microtúbulos (MT) para o alongamento e motilidade axonal 8,9. Crucialmente, os primeiros estudos de explantes neuronais estabeleceram o uso de proteínas da família de ligação final (EBs) marcadas com fluorescência para obter informações valiosas sobre a dinâmica de MT mais extremidade no desenvolvimento de neurônios no nível de polímeros MT individuais10. Esses estudos surgiram de observações de que o membro da família EB EB1 localiza-se preferencialmente em MT mais extremidades11 em S. cerevisiae12 e em células cultivadas13. Desde então, EB1 e outras proteínas de rastreamento de ponta plus (+TIPs)14,15 têm sido amplamente utilizadas em estudos in vivo de instabilidade dinâmica deMT16, inclusive no contexto do desenvolvimento neuronal17.

Drosophila é um modelo poderoso para estudos de imagem in vivo da dinâmica da MT durante o desenvolvimento neuronal devido às vastas ferramentas genéticas e de imagem disponíveis para estudos de moscas18,19 bem como às semelhanças em estrutura e função entre Drosophila e neurônios vertebrados1. Um estudo inicial importante da junção neuromuscular (NMJ) de larvas de Drosophila realizou imagens não invasivas repetidas de um marcador de membrana fluorescente através da cutícula translúcida de animais intactos para documentar a morfogênese terminal pré-sináptica20. Usando um método semelhante para obter imagens de larvas inteiras e vivas de Drosophila, foi fornecida uma demonstração inicial de análise subcelular em nível de partícula do movimento processivo de cargas motoras nos axônios21. Mais recentemente, estudos meticulosos de Rolls e colegas nos dendritos sensoriais de larvas intactas de Drosophila 22,23,24,25,26,27 caracterizaram a dinâmica pós-sináptica MT plus-end realizando rastreamento de partículas e análise de EB1 marcada com proteína fluorescente verde (GFP). Tais estudos em Drosophila 22,23,24,25,26,27 e outros sistemas 28,29,30,31,32 avançaram significativamente a compreensão do comportamento de polímero único de MT mais extremidades nos dendritos de neurônios em desenvolvimento 33.

Apesar dos impressionantes estudos in vivo da dinâmica pós-sináptica da MT22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , tem havido muito menos estudos comparáveis da dinâmica pré-sináptica da MT no terminal do axônio em desenvolvimento. A dinâmica da MT na larva de Drosophila NMJ foi estudada usando microscopia de manchas fluorescentes (FSM) e recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP) 34 . Essas técnicas avaliam a cinética geral da tubulina, mas não o comportamento de extremidades individuais de MT plus. No momento em que este livro foi escrito, houve uma única investigação de MT mais extremidades individuais no Drosophila NMJ: Este estudo combinou imagens de lapso de tempo ao vivo com análise manual de quimógrafos para caracterizar uma população de MTs dinâmicos rotulados como EB1-GFP "pioneiros" que pareciam distintos de uma população mais ampla de MTs estabilizados35. Essa falta de pesquisa sobre a dinâmica pré-sináptica da MT pode ser devida, pelo menos em parte, à anatomia: embora seja relativamente simples obter imagens de dendritos devido à sua proximidade com a cutícula larval, os NMJs são obstruídos por outros tecidos, dificultando a aquisição de imagens com relação sinal-ruído suficiente para análise em nível de partícula. No entanto, dada a importância bem estabelecida dos MTs pré-sinápticos para a morfogênese e estabilização sináptica36, bem como suas ligações com distúrbios do neurodesenvolvimento e neurodegenerativos37, preencher essa lacuna entre a compreensão dos MTs pré e pós-sinápticos provavelmente produzirá informações valiosas.

Um desafio adicional para a análise da dinâmica de MT in vivo em geral, em contraste com a análise in vitro ou ex vivo, são as ferramentas de software automatizadas limitadas que podem extrair parâmetros dinâmicos de dados in vivo. Atualmente, uma das técnicas mais populares e poderosas para análise de extremidades MT plus marcadas com +TIP é o plusTipTracker38,39, um software baseado em MATLAB que permite o rastreamento e análise automatizados de vários parâmetros dinâmicos. Notavelmente, o plusTipTracker mede não apenas o crescimento do MT, mas também o encolhimento e os resgates: enquanto os rótulos +TIP, como EB1-GFP, se associam apenas às extremidades positivas do crescimento, o plusTipTracker pode inferir algoritmicamente as taxas de encolhimento e os eventos de resgate. No entanto, embora o plusTripTracker tenha sido aplicado com muito sucesso a muitos contextos, incluindo a análise multiparamétrica anterior da dinâmica de MT ex vivo em células Drosophila S240, o plusTipTracker não é ideal para análise de dados in vivo, devido à sua menor relação sinal-ruído. Como resultado, estudos in vivo da dinâmica plus-end em dendritos 22,23,24,25,26,27 e no NMJ35 de Drosophila têm se baseado na geração manual e análise de quimógrafos usando software como o ImageJ41, ou em estratégias semiautomatizadas que envolvem vários componentes human-in-the-loop.

Este estudo apresenta um fluxo de trabalho experimental e analítico que reduz a sobrecarga experimental e analítica necessária para realizar análises não invasivas em nível de polímero da dinâmica pré-sináptica de MT em dendritos sensoriais e no terminal do axônio motor de larvas de terceiro ínstar de Drosophila. O protocolo utiliza larvas imobilizadas e intactas e, portanto, evita lesões conhecidas por desencadear respostas ao estresse, bem como outras condições não fisiológicas que podem perturbar a dinâmica da MT in vivo. Para rotular MT dinâmicos plus-ends, EB1-GFP é expresso pan-neuronalmente usando o sistema Gal4 / UAS 42, permitindo a visualização de MTs em dendritos e NMJ com um único driver. Embora algumas etapas iniciais estejam inevitavelmente sujeitas à tomada de decisão humana, como a seleção de espécimes de animais e a identificação de regiões a serem visualizadas, as etapas após a aquisição de dados são amplamente automatizadas. Crucialmente, a otimização de um novo software permitiu uma análise automatizada e imparcial que exigia o mínimo de intervenção humana. Embora outros métodos de rastreamento de partículas estejam disponíveis 43,44,45, este estudo utiliza um software proprietário porque era algoritmicamente adequado para enfrentar os desafios específicos desse conjunto de dados específico. O software agora está disponível para os usuários para uma variedade de aplicações. Especificamente, o uso da filtragem de difusão que melhora a coerência46 é parte integrante da segmentação automatizada e da remoção de fundo, e algoritmos personalizados são implementados especificamente para automatizar a detecção e o rastreamento de partículas. Essa estratégia poderia lidar efetivamente com a baixa relação sinal-ruído inerente aos dados deste estudo, bem como outros desafios, como o movimento de cometas EB1-GFP através de diferentes planos focais. Embora não seja viável testar exaustivamente o desempenho deste software em relação a todos os outros softwares de análise de partículas, o desempenho da estratégia atual igualou ou se aproximou do desempenho humano padrão. Além disso, até onde os autores sabem, não houve nenhum outro software especificamente treinado em dados in vivo de dendritos sensoriais e do terminal pré-sináptico. Dado que o desempenho dos algoritmos de análise de imagem é muitas vezes altamente específico para os dados para os quais foram projetados e que a visão computacional generalizada ainda não é possível, espera-se que o treinamento do software descrito para os dados in vivo específicos de interesse seja a abordagem mais sólida algoritmicamente.

Dado o extenso trabalho em MTs dendríticos 22,23,24,25,26,27, bem como a qualidade consistente dos dados que podem ser adquiridos a partir deste sistema, a estratégia de aquisição de imagem e análise de software foi validada pela primeira vez em dendritos sensoriais de Drosophila. É importante ressaltar que foi descoberto em dendritos que o uso de diferentes drivers neuronais de Gal4, mesmo em fundos de tipo selvagem idênticos, resulta em diferenças significativas na dinâmica EB1-GFP devido a diferenças no fundo genético, enfatizando a importância de usar um único driver Gal4 para resultados consistentes. Essa estratégia foi usada em seguida para análise multiparamétrica da dinâmica EB1-GFP no terminal pré-sináptico da JNM. Para ilustrar ainda mais o valor investigativo deste método, esta estratégia de imagem e software foi usada para avaliar a dinâmica EB1-GFP pré e pós-sináptica após o knockdown de dTACC, o homólogo de Drosophila da família TACC (bobina enrolada ácida transformadora) altamente conservada47,48. Trabalhos anteriores em células Drosophila S240, bem como trabalhos de Lowery e colegas no cone de crescimento Xenopus 49,50,51, mostraram que os membros da família TACC regulam a dinâmica MT plus-end. Além disso, evidências recentemente relatadas de imagens de imunofluorescência confocal e de super-resolução mostraram que o dTACC é um regulador chave de MTs pré-sinápticos durante a morfogênese neuronal52, levantando a questão de saber se o dTACC regula a dinâmica de MT ao vivo. Este relatório demonstra um método que pode realmente detectar diferenças nos comportamentos de MT ao vivo após o knockdown do dTACC. Assim, este estudo apresenta um método in vivo que pode efetivamente identificar e caracterizar os principais reguladores da dinâmica da MT dentro do neurônio em desenvolvimento, particularmente no compartimento pré-sináptico.

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Protocolo

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1. Geração de espécimes de Drosophila

  1. Selecione um marcador MT plus-end adequado. Este estudo utilizou EB1 marcado com GFP, um marcador positivo bem caracterizado com um sinal fortee claro 11,12. As alternativas incluem outros +TIPs, como EB310,13, CLASP/Orbit53 e CLIP-17054.
  2. Obtenha ou gere moscas com o marcador MT sob controle de um promotor de UAS (por exemplo, UAS-EB1-GFP).
  3. Escolha o driver Gal4 específico do tecido apropriado. Este estudo usou o driver pan-neuronal elaV-Gal458,59 para conduzir a expressão em dendritos sensoriais e no NMJ e 221-Gal460,61 para expressão específica de dendritos.
  4. Criar moscas utilizando técnicas normais de criação de moscas55,56. Recomenda-se que as moscas sejam mantidas em incubadoras umidificadas a 25 °C para uma expressão ideal de Gal4/UAS.
  5. Usando técnicas genéticas padrãode moscas 55,56, realizar cruzamentos para gerar moscas para expressar o marcador MT plus-end nas células / tecidos desejados.
    NOTA: Para qualquer combinação de driver Gal4 e transgene, o projeto experimental deve incluir experimentos de prova de conceito e validação para caracterizar o sistema e evitar a superexpressão de artefatos.

2. Configuração do equipamento

  1. Configure uma estação de trabalho, incluindo moscas, reagentes anestésicos, materiais de construção de lâminas, estereomicroscópio e fonte de iluminação, perto do microscópio confocal (ou seja, na mesma sala) para minimizar o tempo gasto entre a preparação da amostra e a imagem para prolongar a saúde e a viabilidade das larvas.
  2. Prepare o anestésico misturando uma mistura de clorofórmio a 9% (0,1 mL de clorofórmio e 1,0 mL de óleo halocarbônico) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Para evitar a separação, misture bem invertendo o tubo antes de preparar cada nova lâmina.
  3. Prepare a lâmina de vidro: Corte quatro tiras de fita dupla-face (~15 mm de largura). Alinhe duas das peças na lâmina de vidro, deixando um espaço de ~5 mm entre as tiras. Coloque as duas peças restantes em cima das duas primeiras para dobrar a espessura da fita (Figura 1C).
  4. Adicione uma gota grande (~ 100 μL) de mistura de clorofórmio / óleo na lâmina de vidro no espaço de 5 mm entre os pedaços de fita (Figura 1C).

3. Preparação de amostras larvais para imagem

  1. Encha um recipiente (por exemplo, um prato de 6 poços) com 1x PBS.
  2. Colete larvas de3º ínstar do frasco para moscas usando uma pinça ou um instrumento semelhante. Identifique as larvas no estágio adequado por seu comportamento de rastreamento e pela presença de 9 a 12 ganchos de boca serrilhados proeminentes. Use um estereomicroscópio para auxiliar no estadiamento das larvas (Figura 1D).
  3. Coloque uma larva no PBS e mova-a suavemente para lavar quaisquer restos de comida ou outros detritos. Seque a larva suavemente em um tecido delicado.
  4. Anestesiar a larva colocando-a em clorofórmio / gota de óleo na lâmina da seção 2 (Figura 1C).
    NOTA: A orientação dorsal/ventral da larva não é crítica porque os neurônios sensoriais e motores podem ser detectados através da cutícula translúcida, ajustando a platina do microscópio para o plano focal adequado, independentemente da orientação da amostra.
  5. Coloque uma lamínula # 1,5 por cima. Cole a lamínula na fita aplicando uma leve pressão, imobilizando assim a larva sem danificá-la (Figura 1C).
  6. Sele a câmara com vaselina ou esmalte.

4. Imagem confocal de lapso de tempo de amostras vivas

  1. Prepare o microscópio confocal e a lente objetiva de 60x com imersão em óleo. Coloque a amostra no palco (Figura 1A,B).
  2. Use o software de aquisição para configurar experimentos.
    NOTA: Para este estudo, cada série de imagens foi adquirida em um único plano focal, em oposição a uma pilha z.
    1. Defina a duração do lapso de tempo para 30 s em um intervalo de 2 s, para um total de 16 quadros.
    2. Defina a exposição e a intensidade do laser para garantir sinal suficiente, evitando saturação e fotobranqueamento.
    3. Para imagens EB1-GFP, o laser de 488 nm foi ajustado para um tempo de exposição de 100 ms e intensidade de 30%. Esses valores podem variar para diferentes usos deste protocolo e devem ser modificados empiricamente.
  3. Use as oculares do microscópio para encontrar a larva em iluminação verde de campo amplo. Encontre os dendritos ou NMJs ajustando o estágio lentamente. Não exponha a larva à iluminação (campo amplo ou confocal) por mais tempo do que o necessário.
    1. Os dendritos aparecem como finas teias de nervos verde-brilhantes facilmente distinguíveis de feixes de axônios longos e espessos (Figura 1E).
    2. As NMJs aparecem como grupos de botões individuais verde-brilhantes, com aproximadamente 5 μm de diâmetro, nas extremidades de feixes longos e espessos de axônios que divergem do cordão nervoso (Figura 1F).
  4. Usando o feed da câmera ao vivo, foque rapidamente na região de interesse usando iluminação de 488 nm. Pare imediatamente a iluminação assim que o foco adequado for encontrado para evitar fototoxicidade.
  5. Inicie a aquisição da imagem. Os cometas EB1 são reconhecíveis como pontos brilhantes e móveis.
  6. Consulte os protocolos publicados anteriormente para obter detalhes adicionais e diretrizes sobre imagens ao vivo de fluorescência57.

5. Processamento e análise de imagem baseados em software

  1. Analise cada arquivo de vídeo individualmente. No software (interface do usuário mostrada na Figura 2), selecione Arquivo | Importação | Sequência de imagens e arraste os arquivos TIF na caixa exibida. Visualize o vídeo.
  2. No menu Parâmetros de detecção , ajuste os parâmetros do software para garantir a detecção apenas de pontos claramente visíveis e evitar a detecção de objetos espúrios. Por exemplo, a redução da intensidade das partículas resulta em maior sensibilidade do software aos pontos, mas aumenta os potenciais falsos positivos. Os valores precisos dos parâmetros variam empiricamente. As descrições dos parâmetros de detecção e rastreamento estão disponíveis com os autores mediante solicitação.
  3. Aplique a receita de rastreamento de partículas de neurônio para analisar a imagem usando o botão From beginning (seta azul, Figura 2B). O software produzirá resultados para os parâmetros de rastreamento listados na Tabela 1 para a Planilha de Resultados (caixa verde, Figura 2B). Para facilitar a análise e interpretação posteriores, os resultados podem ser armazenados em software de planilha usando a função Exportar encontrada na seção Planilha de Resultados .
  4. Navegue com o cursor até o ponto detectado na etapa anterior e clique com o botão esquerdo do mouse para selecionar ou desmarcar. Vários pontos podem ser selecionados simultaneamente usando Ctrl + clique com o botão esquerdo.
    NOTA: Dependendo dos objetivos e aplicações do projeto, heurísticas adicionais podem ser usadas para filtrar os pontos. Por exemplo, pontos com um tempo de vida inferior a 8 a 10 s (4 a 5 quadros) podem ser omitidos porque não apresentam informações suficientes sobre todo o evento de crescimento. A necessidade de tais heurísticas varia empiricamente. Detalhes adicionais sobre a funcionalidade do software estão disponíveis com os autores, mediante solicitação.

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Resultados

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As moscas foram criadas a partir de estoques estáveis que expressam constitutivamente o transgene UAS-EB1-GFP pan-neuronalmente (elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP)58,59 ou em neurônios sensoriais (221-Gal4; UAS-EB1-GFP)60,61. EB1 foi escolhido para este estudo porque se localiza especificamente nas extremidades de crescimento e se dissocia imediatamente após a pausa e encolhimento...

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Discussão

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Este artigo discute um protocolo para realizar imagens intravitais não invasivas da dinâmica da MT nos dendritos e na NMJ durante o desenvolvimento. A entrada humana é necessária durante as etapas experimentais, como na seleção de animais para imagem, e pode introduzir vieses no processo de coleta de dados que não podem ser razoavelmente removidos. Assim, um dos principais objetivos do protocolo é minimizar o viés sempre que possível, realizando análises automatizadas com um novo softwar...

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Divulgações

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Os autores Hoyin Lai, Michael Jones, Hideki Sasaki, Luciano A.G. Lucas, Sam Alworth (anteriormente) e James Shih-Jong Lee são funcionários da DRVision Technologies LLC, que produz o software usado neste protocolo.

Agradecimentos

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Agradecemos aos nossos colegas do laboratório Van Vactor e da DRVision, além dos Drs. Max Heiman, Pascal Kaeser, David Pellman e Thomas Schwarz pela discussão útil. Agradecemos à Dra. Melissa Rolls por fornecer generosamente o elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 e 221-Gal4; Estoques UAS-EB1-GFP usados neste estudo. Agradecemos às Dras. Jennifer Waters e Anna Jost, do Nikon Imaging Center em Harvard, pela experiência em microscopia de luz. Este trabalho é financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (F31 NS101756-03 para VTC, SBIR 1R43MH100780-01D para JSL).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mLEppendorf21008-959Preparação de amostras
1000 µ L Pontas de pipeta TipOneUSA Scientific1111-2721Preparação de amostras
200 µ L TipOne pontas de pipetaUSA Scientific1120-8710Preparação de amostras
221-Gal4 moscasBloomington Drosophila Stock Center (EUA)26259Drosophila genética/cruzamentos
60x Lente objetivaNikonPlan Apo 60x ÓleoAquisição
de imagem Placa de 6 poçosBD Falcon353224Preparação de amostras
AgarMoorAgar41084Comida de Drosophila
AiviaDRVision LLCOtimizado como parte deste estudo
Clorofórmio (estabilizado com amilenos)Sigma-AldrichC2432Preparação de amostras
Pistola de CO2 (para seleção de moscas para cruzamentos)Genesee54-104Genética de Drosophila/cruzamentos
Borbulhador de CO2 (para seleção de moscas para cruzamentos)Genesee59-180Genética/cruzamentos de Drosophila
Câmera CCD refrigeradaHamamatsuORCA-R2Aquisição de imagem
FubáGenesee62-101Alimento Drosophila
Água Destilada AlimentoDrosophila
Fita dupla faceUísquePreparação
amostras Frascos de DrosophilaGenesee32-109Alimentos Drosophila
Plugues de Drosophila (plugues de espuma para frascos)Genesee59-200Drosophila food
Dumont #5 Biologie Inox ForcepsFine Science Tools11252-20Preparação
da amostra elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 voaGift of Melissa Rolls (Penn State University)N/AGenética/cruzamentos de Drosophila
Etanol (95%)VWR75811-022Drosophila food
Iluminador/fonte de luz de fibra óptica para estereomicroscópioNikonNI-150Preparação
de amostras Flypad (para seleção de moscas para cruzamentos)Genesee59-172Genética/cruzamentos de Drosophila
Forma: Câmara/Incubadora AmbientalThermoFisher3940Drosophila, genética/cruzamentos,
Óleo de halocarbono 700Sigma-AldrichH8898Preparação de amostras
Óleo de imersãoNikonMXA22168Aquisição de imagens
Kimwipe Toalhetes DelicadosFisher Scientific34120Preparação de amostras
Módulo de fusão a laserEspectral Fonteluminosa da aquisição da imagem da pesquisa aplicada LMM-5
aquisiçãoconfocalde LumencorSOLA 54-10021
Automatização & da microscopia de MetaMorph da aquisição da imagem Software de análise de imagemDispositivosAquisição de imagem
Micro Cover Glasses, Quadrado, N.º 1 1/2 (#1.5)VWR48366-205 Preparação deamostras
Microscópio invertido motorizado com sistema de focagem perfeitaNikonTI-ND6-PFS-SAquisição de imagem
Platina motorizada e obturadoresPréviaProscan IIIAquisição
de imagemTesoura multiusosScotchMMM1428Preparação de amostras
VernizSally Hansen784179032016 074170382839Preparação de amostras
Filtro ópticoChromaET480/40mAquisição de imagens
P1000 PipetmanGilsonF123602Preparação de amostras
P200 PipetmanGilsonF123601Preparação de amostras
PBS (10X) ph 7.4ThermoFisher70011044Preparação de amostras
Ácido propiônicoFisherA258-500Drosophila food
Unidade de scanner confocal de disco giratórioYokagawaCSU-X1Aquisição de imagem
EstereomicroscópioNikonSMZ800NPreparação de amostras
Açúcar (sacarose)Genesee62-112Alimento para Drosophila
Superfrost SlideVWR48311-600Preparação de amostras
TegoseptGenesee20-258Alimento para Drosophila
UAS-dtacc-RNAi voaViena Drosophila Resource Center (Viena, Áustria)VDRC-101439Genética/cruzamentos de Drosophila
Vaselina vaselina vaselinaDVOCB311003Preparação
de amostrasWinsor & Pincel Newton Regency Gold 520, Tamanho 0Grampos5012000Genética/cruzamentos de Drosophila
LeveduraVWRTorula Levedura IC90308580Drosophila alimento
Dichroic YokogawaSemrockDi01-T405/488/568/647-13x15x0.5Aquisição de imagem
de para a moleculares

Referências

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