Artigo de método

Bloqueando o fluxo linfático suturing afferent vasos linfáticos em camundongos

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DOI:

10.3791/61178

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14 de maio de 2020

 ,  , 
1Department of General Surgery, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin Medical University, 2Inflammation Research Network, Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Snyder Institute for Chronic Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Neste artigo

Resumo

Um protocolo para bloquear o fluxo linfático por sutura cirúrgica de vasos linfáticos diferentes é apresentado.

Resumo

Os vasos linfáticos são fundamentais na manutenção do equilíbrio dos fluidos teciduais e na otimização da proteção imunológica, transportando antígenos, citocinas e células para drenar linfonodos (LNs). A interrupção do fluxo linfático é um método importante ao estudar a função dos vasos linfáticos. Os diferentes vasos linfáticos do footpad murine aos linfonodos popliteis (pLNs) são bem definidos como as únicas rotas para drenagem linfática para as pLNs. Suturar esses vasos linfáticos diferentes pode impedir seletivamente o fluxo linfático para as PLNs. Este método permite a interferência no fluxo linfático com danos mínimos às células linfáticas do endotelial linfático no pLN drenante, os vasos linfáticos aferentes, bem como outros vasos linfáticos ao redor da área. Este método tem sido usado para estudar como a linfática impacta as venules endoteliais altas (HEV) e a expressão da quimioterapia na LN, e como o linfático flui através do tecido adiposo ao redor da LN na ausência de vasos linfáticos funcionais. Com o reconhecimento crescente da importância da função linfática, este método terá aplicações mais amplas para desvendar ainda mais a função dos vasos linfáticos na regulação do microambiente LN e respostas imunológicas.

Introdução

A organização espacial do sistema linfático fornece suporte estrutural e funcional para remover eficientemente o fluido extracelular e transportar antígenos e células que apresentam antígenos (APCs) para as LNs drenantes. Os vasos linfáticos iniciais (também chamados de capilares linfáticos) são altamente permeáveis devido às suas junções intercelulares descontínuas, que facilitam a coleta efetiva de fluidos, células e outros materiais dos espaços extracelulares circundantes1. Os vasos linfáticos iniciais se fundem na coleta de vasos linfáticos, que possuem junções intercelulares apertadas, uma membrana contínua do porão e cobertura muscular linfática. Os vasos linfáticos de coleta são responsáveis pelo transporte de linfáticos coletados para as LNs drenantes e, eventualmente, o retorno da linfática à circulação2,3. Os vasos linfáticos coletores que impulsionam linfáticos para a LN drenante são os vasos linfáticos diferentes4,5,6,7. A obstrução de vasos linfáticos diferentes pode bloquear o fluxo linfático para as LNs, que é uma técnica útil ao estudar a função do fluxo linfático.

Estudos anteriores mostraram que o fluxo linfático desempenha um papel significativo no transporte de antígenos e APCs, bem como na manutenção da homeostase da LN. É bem compreendido que os APCs derivados do tecido, tipicamente ativados células dendríticas migratórias (DCs), viajam através dos vasos linfáticos a diferentes para a LN para ativar as células T8. A ideia de que antígenos de forma livre, como micróbios ou antígenos solúveis, fluem passivamente com linfáticos para a LN para ativar APCs residentes em LN vem ganhando aceitação na última década9,10,11,12. Antígenos de forma livre que viajam com linfático levam minutos após a infecção para viajar para a LN, e a ativação celular residente em LN pode ocorrer dentro de 20 minutos após a estimulação. Isso é muito mais rápido do que a ativação de DCs migratórios, que leva mais de 8h para entrar na drenagem LN9. Além de transportar antígenos para iniciar a proteção imunológica, o linfo também transporta citocinas e DCs para a LN para manter seu microambiente, e para suportar a homeostase das células imunes13,14. Anteriormente, o bloqueio do fluxo linfático suturando os diferentes vasos linfáticos demonstrou que a linfática é necessária para manter o fenótipo HEV necessário para suportar a célula T homeostática e a célula B para a LN15,16,17. CCL21 é uma quimiocina crítica que direciona o posicionamento de células DC e T na LN8,18. O bloqueio do fluxo linfático interrompe a expressão CCL21 na LN e potencialmente interrompe o posicionamento da célula DC e T e/ou a interação na LN19. Assim, o bloqueio do fluxo linfático pode revogar direta ou indiretamente o acesso de antígeno/DC à LN drenante, interrompendo o microambiente LN que regula as respostas imunes na LN. Para melhor investigar a função do fluxo linfático, é apresentado um protocolo experimental(Figura 1) para bloquear o fluxo linfático em camundongos, suturando os vasos linfáticos a diferentes do bloco de pé para o pLN. Este método pode ser uma técnica importante para estudos futuros sobre a função linfática em condições saudáveis e doentes.

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Protocolo

Todo o trabalho animal precisa ser aprovado pela comissão de ética institucional e governamental e manejo de animais.  Esta é uma cirurgia de não sobrevivência.

1. Preparação de materiais

  1. Prepare 100 mL de 70% de etanol misturando 70 mL de 100% de etanol com 30 mL de água estéril. Autoclave todas as ferramentas cirúrgicas antes da cirurgia e mantenha as ferramentas em 70% de etanol antes e durante a cirurgia para manter a esterilização.
  2. Prepare um aparelho de injeção.
    1. Corte ~30 cm de tubos de polietileno (0,28 mm de diâmetro). Conecte a ponta de uma agulha de 30 G x 1/2 (agulha A) a uma extremidade do tubo de polietileno. Desaloja cuidadosamente outra agulha de 30 G x 1/2 (agulha B) e conecte o lado quebrado à outra extremidade do tubo de polietileno.
    2. Conecte a agulha A a uma seringa tuberculina de 1 mL.
      NOTA: Para este tubo de polietileno, 1,6 cm de fluido na tubulação corresponde a 1 μL20.
  3. Prepare uma mistura de cetamina/xilazina 10:1 (10 mg/mL cetamina e 1 mg/mL de xilazina) em soro fisiológico (bacteriostático 0,9% [w/v] cloreto de sódio). Prepare a solução recentemente antes do uso.

2. Preparação do animal para cirurgia

NOTA: Use camundongos de 6 a 10 semanas. Tanto camundongos fêmeas quanto machos podem ser usados. Neste estudo, foram utilizados camundongos C57BL/6 de 6 a 10 semanas de idade. Este método pode ser adaptado para outras cepas de camundongos.

  1. Anestesiar o mouse injetando 250 μL da mistura cetamina/xilazina intraperitoneally. Espere até o rato dormir completamente. Certifique-se de que o mouse não reaja a uma pitada de dedo do dedo do dedo para detectar anestesia completa.
  2. Raspe a pele ao redor das pernas com cortadores de cabelo.
  3. Aplique o creme depilatório ao redor da perna e espere por 5 minutos. Limpe a pele residual e o creme depilatório usando um tecido úmido e limpe a perna com água estéril. Pulverizar 70% de etanol ao redor da perna para esterilizar a área de operação. O etanol está restrito ao local da incisão.

3. Sutura cirúrgica de vasos linfáticos a diferentes

NOTA: A perna direita é suturada, e a perna esquerda é usada como controle falso. O protocolo de sutura linfática (etapas 3.1-3.8) leva de 20 a 30 min.

  1. Mantenha o mouse em uma posição propensa e fixe-o com fita cirúrgica para expor a área de operação na perna direita.
  2. Indeje intradermicamente 5 μL de 1% de corante azul Evans ou 9 cm do fluido do aparelho de injeção tubo no footpad. Massageie suavemente o footpad para ajudar Evans azul a entrar nos vasos linfáticos.
    NOTA: A seringa de insulina não é fácil de controlar para injeção de pequeno volume. O volume pode ser controlado com mais precisão usando o aparelho de injeção. Os vasos linfáticos são visualizados por corante azul sob a pele. Com treinamento extensivo, ambos os vasos linfáticos diferentes podem ser vistos a olho nu como vasos transparentes no tecido adiposo, paralelo à artéria Saphenous. Com treinamento extensivo, é possível suturar os vasos sem injetar corante Evans Blue nos casos em que há preocupações de possíveis distúrbios do corante.
  3. Sob um microscópio dissecando, escolha um local de incisão 5 mm da borda inferior da fossa popliteal. Faça uma pequena incisão (~5 mm) na pele com uma tesoura. Utilizando fórceps de operação fina, estique a incisão e exponha os vasos linfáticos coletados(Figura 1A).
    NOTA: Se necessário, um pequeno fragmento de pele pode ser removido para expor os vasos linfáticos.
  4. Identifique tanto os vasos linfáticos diferentes que levam às pLNs sob o microscópio de dissecção(Figura 1B).
    NOTA: Existem dois vasos linfáticos diferentes do bloco de rodas até o pLN. Ambos precisam ser suturados para bloquear completamente o fluxo linfático.
  5. Utilizando um suporte de agulha, insira cautelosamente a agulha de sutura (0,7 métrica ou menor) entre o vaso linfático diferente e a artéria saphenous e puxe a agulha suavemente ao redor do vaso linfático diferente. Puxe suavemente a corda de sutura e deixe cerca de 2 cm da corda de sutura para trás. Use o suporte de agulha para ajudar a amarrar a corda firmemente para suturar um vaso linfático com o nó de um cirurgião(Figura 1C).
    NOTA: O tecido sob a incisão pode secar com exposição prolongada ao ar. Tornar a incisão o menor possível e realizar a sutura rapidamente (ou seja, dentro de 5 minutos) impedirá que o tecido seque. Mantenha a umidade do tecido aplicando um pequeno volume de soro fisiológico com um cotonete.
  6. Massageie suavemente o footpad para garantir que nenhum corante Evans Blue passe pelo local da sutura e, em seguida, corte o excesso de corda com uma tesoura.
  7. Realize as mesmas etapas de sutura (ou seja, etapas 3.5 e 3.6) no outro vaso linfático diferente(Figura 1D). Feche a incisão da pele com a mesma sutura utilizada para suturar os vasos na etapa 3.5(Figura 1E).
  8. Para o controle falso, injete intradermicamente 5 μL de 1% de corante azul Evans no footpad esquerdo e massageie o footpad para visualizar os vasos linfáticos. Abra a pele com uma excisão e feche a ferida sem suturar o vaso(Figura 1F).
  9. Opcionalmente, monitore os ratos operados por 2-4 h. O lado da sutura da perna deve mostrar edema com Evans Blue espalhado para a coxa, enquanto a perna de controle mostrará corante azul Evans restrito no footpad. Se os ratos acordarem, uma mistura adicional de cetamina/xilazina será injetada para manter anestesiada até a eutanásia.

4. Rastreamento do fluxo linfático

  1. Imediatamente após a cirurgia, injete intradermicamente 10 μL de isothiocianato de fluoresceína (FITC) no footpad tanto do controle quanto da perna linfática suturada.
  2. Eutanize os camundongos com 400 μL de mistura de cetamina/xilazina e realize a luxação cervical quando os camundongos estiverem totalmente anestesiados.
  3. Coletar pLNs da fossa popliteal e remover cuidadosamente o tecido adiposo perinodal ao redor das pLNs sob o microscópio de dissecção em 2, 6 e 12 h após a injeção FITC.
  4. Incorpore as pLNs com a área do seio medular voltada para o lado do criomold no composto de temperatura de corte ideal (OCT)(Figura 1G,H).
  5. Prepare seções congeladas de 20 μm usando um criotome.
  6. Imagem das crioseções sob um microscópio confocal para determinar a distribuição FITC.

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Resultados

A sutura do vaso linfático tem sido usada em estudos anteriores15,16,17,19, onde serviu como uma importante ferramenta para estudar a função do fluxo linfático antes que a biologia molecular dos vasos linfáticos fosse melhor compreendida. O bloqueio do fluxo linfático interrompe a homeostase LN, o que leva os HEVs a perder a expressão genética crítica necessária para o melhor linfócito para a L...

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Discussão

O bloqueio do fluxo linfático terá amplas aplicações na manipulação do fornecimento de antígenos ao LN em condições saudáveis e doentes. É possível usar este método para controlar o tempo de entrega de antígenos, a fim de estudar como o fluxo linfático contínuo regula a resposta imune na drenagem de LNs. Este método de interrupção do fluxo linfático também pode ser usado para estudar como a linfática impacta a compartimentação celular, ativação celular, migração celular e interações célula-célula no LN.

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Ava Zardynezhad pela revisão do manuscrito. Este trabalho é apoiado pelo Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR, PJT-156035), e pela Fundação Canadense de Inovação para AFIN (32930), e pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China para Yujia Lin (81901576).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,9% de solução salina de cloreto de sódioBaxterJB1323
100% etanolGreenfield GlobalUniversity of Calgary serviços de distribuição UN1170.
Creme depilatórioNairNair Sensitive Formula Creme para Depilação; me com Óleo de Amêndoa Doce e Óleo de Bebê, 200 ml. Ou produto similar.
corante azul EvansSigma Life ScienceE2129-10GPara 1 ml de corante azul Evans, adicione 0,1 g de azul Evans a 10 ml de PBS. A solução Evens Blue será filtrada através de filtros de 0,22 mm e mantida estéril em alíquotas de 1ml.
Isômero I de isotiocianato de fluoresceína (FITC)Sigma Life ScienceF7250-1G
Fórceps Dumont #3WPI500337
Fórceps Dumont #5WPI500233
Aparelho de injeçãoConecte uma extremidade da tubulação de polietileno a 30G &vezes; ½ agulha. Coloque uma seringa de 1 ml de TB na agulha. Desalojar o eixo da agulha de mais 30G &vezes; ½ agulha. Insira a extremidade romba do 30G &vezes; ½ eixo da agulha na outra extremidade do tubo. O diâmetro interno desta tubulação é de 0,28 mm. Assim, 1,6 cm de fluido na tubulação é 1 μl.
Seringa de insulinaBecton Dickinson and Company (BD)329461
IRIS Forcep retaWPI15914
IRIS scissorsWPI14218-G
CetaminaNarketanDIN 02374994Os fornecedores de cetamina e xilazina geralmente estão sob regulamentação institucional e governamental.
Agulhas (26Gx3/8)Becton Dickinson and Company (BD)305110
Agulhas (30Gx1/2)Becton Dickinson and Company (BD)305106
Paton Needle HolderROBOZRS6403Reto, Sem Trava; Serrilhado
Fosfato Tamponado Salino (PBS)Sigma Life ScienceP4417-100TAB
Tubo de polietilenoBecton Dickinson and Company (BD)427401
Fita cirúrgica (1,25cmx9,1m)Transpore1527-0
Fita cirúrgica (2,5cmx9,1m)Transpore1527-1
SuturaDavis and Geck CYANAMID Canada11/040,7 monofilamento métrico polipropileno
Seringa (1ml)Becton Dickinson and Company (BD)309659
VANNAS scissorsWorld Precision Instruments (WPI)14122-G
XylazineRompunDIN02169606Os fornecedores de cetamina e xilazina geralmente estão sob regulamentação institucional e governamental.
Equipamento
Microscópio de dissecaçãoOlympusOlympus S261 (522-STS OH141791) com fonte de luz: Olympus Highlight 3100
Microscópio confocalLeicaSP8

Referências

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