Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias do rato in vitro

Resumo

Aqui, estabelecemos um método de baixo custo e fácil de operar que direciona a diferenciação rápida e eficiente das células-tronco embrionárias para os neurônios. Este método é adequado para popularização entre laboratórios e pode ser uma ferramenta útil para a pesquisa neurológica.

Resumo

A diferenciação neural das células-tronco embrionárias do camundongo (mESCs) é uma ferramenta potencial para elucidar os principais mecanismos envolvidos na neurogênese e potencialmente ajudar na medicina regenerativa. Aqui, estabelecemos um método eficiente e de baixo custo para diferenciação neuronal dos mESCs invitro, utilizando a estratégia de triagem combinatória. Sob as condições aqui definidas, a formação do corpo embrionário de 2 dias + protocolo de indução de ácido retinóico de 6 dias permite diferenciação rápida e eficiente dos mESCs em células precursoras neurais (NPCs), como visto pela formação de A2lox bem empilhados e neuritas semelhantes a 129 derivativos que são nestin positivos. O estado saudável dos corpos embrionários e o ponto de tempo em que o ácido retinóico (RA) é aplicado, assim como as concentrações de RA, são críticos no processo. Na diferenciação subsequente dos NPCs em neurônios, o N2B27 médio II (suplementado pelo meio neurobásal) poderia suportar melhor a manutenção e maturação a longo prazo das células neuronais. O método apresentado é altamente eficiente, de baixo custo e de fácil operação, podendo ser uma poderosa ferramenta para pesquisa em neurobiologia e biologia do desenvolvimento.

Introdução

As células-tronco embrionárias (ESCs) são pluripotentes e podem se diferenciar em células precursoras neurais (NPCs) e, posteriormente, em neurônios sob certas condições¹. A neurogênese baseada em ESC fornece a melhor plataforma para imitar neurogênese, servindo assim como uma ferramenta útil para estudos de biologia do desenvolvimento e potencialmente auxiliar na medicina regenerativa^2,3. Nas últimas décadas, muitas estratégias foram relatadas para induzir neurogênese embrionária, como o método transgênico⁴, utilizando pequenas moléculas⁵....

Protocolo

1. Cultura de células-tronco embrionárias do rato

1. Prepare 0,1% de pratos ou pratos de cultura celular revestido de gelatina.
   1. Adicione 2 mL de gelatina esterilizada de 0,1% (0,1% w/v em água) a pratos de cultura celular de 60 mm. Arrase suavemente para garantir até mesmo o revestimento dos pratos da cultura celular.
   2. Coloque os pratos em uma incubadora de CO₂ de 5% a 37 °C e deixe o revestimento por 1h.
   3. Remova a solução de gelatina de 0,1% antes de semear as células.
      NOTA: Depois de remover a gelatina, não há necessidade de secar ou lavar os pratos revestidos.
2. Cultura de células-tronco embrioná....

Resultados

Formação corporal embrionária de 2 dias + a indução de RA de 6 dias funciona melhor na direção da diferenciação de mESCs em NPCs (Fase I). Para determinar o protocolo ideal que melhor promove a diferenciação de mESCs em NPCs (Fase I), 7 protocolos foram testados tanto em A2lox quanto em 129 mESCs(Tabela 1) e o status de diferenciação de cada grupo foi monitorado por microscópio leve. Como mostrado na Figura 3A, a maioria dos derivados A2lox e 129 em formação de corpo embrion.......

Discussão

No presente estudo, estabelecemos um método simples e eficaz para diferenciação neuronal dos mESCs, com baixo custo e materiais de fácil obtenção. Neste método, 2 dias de formação corporal embrionária seguida de 6 dias de indução de RA podem efetivamente promover a diferenciação de mESCs em NPCs (Fase I-protocolo 3). Para a diferenciação da fase II, o N2B27 médio II (Fase II-protocolo 3) induz mais efetivamente a diferenciação dos NPCs em neurônios. Para garantir o sucesso, mais atenção deve ser dada a várias etapas crít.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo anti-nestina [Rat-401]	Abcam	Ab11306	armazenado a -80 &graus; C, evite o congelamento e descongelamento repetidos
anticorpo Anti-β-Tubulina III produzido em coelho	Sigma Aldrich	T2200	armazenado a -80 ° C, evite congelamento e descongelamento repetidos
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	armazenado a -20 ° C e proteger da luz
B-27 Suplemento (50X), soro livre	Gibco	17504044	armazenado a -20 ° C, e proteger da luz
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	armazenado a -20 ° C
Coverslips	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	armazenado a -20 ° C e proteger da luz
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	armazenado a 4 &graus; C
Soro fetal bovino	HyClone	SH30084.03	armazenado a -20 & C, evite o congelamento e descongelamento repetidos
Microscopia de fluorescência	Gelatina Olympus	CKX53
Gibco		CM0635B	armazenada à temperatura ambiente
Suplemento GlutaMAX	Gibco	35050061	armazenado a 4 ° Tampão
Beyotime	P0103	da diluição do anticorpo da coloração de C Immunol	armazenado em 4 ° C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	armazenado a 4 > C
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	armazenado a -20 ° C, evite o congelamento e descongelamento repetidos
Fator Inibidor de Leucemia humano	Sigma	L5283	armazenado a -20 ° C
Meio de Montagem Com DAPI - Aquoso, Fluoroshield	Abcam	ab104139	armazenado a 4 ° C e proteger da
luz MEM Solução de aminoácidos não essenciais	Gibco	11140076	armazenado a 4 ° C
N-2 Suplemento (100X)	Gibco	17502048	armazenado a -20 ° C e proteger da luz
Soro de cabra normal	Jackson	005-000-121	armazenado a -20 ° C
Meio Neurobasal	Gibco	21103049	armazenado a 4 &graus; C
Prato bacteriano não adesivo	Corning	3262
Phosphate Buffered Saline (1X)	HyClone	SH30256.01B	armazenado a 4 ° C
Solução de penicilina/estreptomicina	HyClone	SV30010	armazenado a 4 > C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	armazenado a -20 ° C
Ácido retinóico	Sigma	R2625	armazenado a -80 &graus; C e proteger da cepa leve
129 Células-tronco embrionárias de camundongo	Cyagen	MUAES-01001	Mantido em sistema de cultura livre de alimentador
Stem-Cellbanker (DMSO livre)	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	armazenado a -20 ° C, evite o congelamento e descongelamento repetidos
Solução de tripsina 0,25% (1X)	HyClone	SH30042,01	armazenado a 4 °; C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoetanol	Gibco	21985023	armazenado a 4 & C e proteger da luz
4% de paraformaldeído	Beyotime	P0098	armazenado a -20 ° C
6 - placa de poço	Corning	3516
Placa de cultura de células de 60 mm		de 430166
	Corning NUNC	339650

do preliminar Tubo de centrífuga de 15 ml