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Triagem direta de cultura líquida para avaliar a produção de proteínas heterólogas usando um mutante auxotrófico de Aspergillus oryzae

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DOI:

10.3791/61219

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12 de maio de 2020

 , 
1Honda Research Institute Japan Co., Ltd.

Neste artigo

Resumo

Um método de triagem de cultura líquida direta (DLC) foi desenvolvido que reduz significativamente o tempo necessário para a transformação de protoplastos mediada por polietilenoglicol (PEG) do fungo filamentoso, Aspergillus oryzae, quando empregado para avaliação da produção secretora de proteínas heterólogas. Este método aumenta drasticamente o rendimento do protocolo de avaliação.

Resumo

Aspergillus oryzae, um fungo filamentoso, é um dos hospedeiros mais amplamente utilizados para aplicações industriais, incluindo a produção em larga escala de proteínas. Um método de transformação de protoplastos mediado por polietilenoglicol (PEG) é geralmente usado para a introdução de genes heterólogos em A. oryzae. O método convencional normalmente requer três semanas para a triagem de transformadores favoráveis. Aqui, é introduzida uma nova técnica, o método de triagem de cultura líquida direta (DLC), que reduz o tempo de triagem para seis dias em um formato de frasco de 200 mL ou para 10 dias em um formato de microplaca de 24 poços. O método de triagem DLC garante a aquisição de transformantes positivos e a avaliação da produção secretora de proteínas heterólogas em uma única etapa, ao contrário do método de triagem convencional, onde duas etapas separadas são necessárias para o mesmo. O protocolo para transformação de protoplastos mediada por PEG de A. oryzae é descrito, que consiste em cinco etapas: preparação de suspensão de esporos frescos, pré-cultivo, preparação de protoplastos, introdução de DNA e triagem de DLC. Para obter resultados bem-sucedidos na triagem de DLC, é fundamental usar um meio rico em nutrientes com pressão osmótica otimizada. O protocolo deve popularizar ainda mais o uso de A. oryzae como hospedeiro de escolha na produção industrial de proteínas.

Introdução

O Aspergillus oryzae é um microrganismo importante na indústria alimentícia japonesa que tem sido utilizado há mais de 1.000 anos na produção de alimentos fermentados, como saquê (vinho de arroz), shoyu (molho de soja) e missô (pasta de soja)1,2. Tem a capacidade de secretar uma grande quantidade de proteínas, como proteases e amilases3. Informações de sequência do genoma para A. oryzae também estão disponíveis4. Além disso, técnicas de engenharia genética poderosas e praticamente úteis foram estabelecidas para este fungo 5,6,7,8,9,10. Transformantes favoráveis têm sido usados como hospedeiros para a produção secretora de proteínas heterólogas 11,12,13,14.

Eletroporação, transformação mediada por Agrobacterium e transformação de protoplastos mediada por polietilenoglicol (PEG) são as técnicas utilizadas para a introdução de genes heterólogos em A. oryzae 15,16,17. O método de transformação de protoplastos mediado por PEG tem sido amplamente utilizado desde que foi relatado pela primeira vez para Neurospora crassa em 197918. Neste método, os protoplastos são preparados e misturados com PEG e o gene heterólogo que deve ser introduzido nas células. As paredes dos protoplastos são comprometidas enzimaticamente, o que torna as células vulneráveis ao estresse físico e às alterações da pressão osmótica19,20. O método convencional de triagem empregado na produção secretora de proteínas heterólogas inclui três etapas: aquisição de transformantes positivos (em placa de ágar mole), seleção de transformantes verdadeiros e falsos (em placa de ágar) e avaliação da produção secretora de proteínas heterólogas (em cultura líquida); cada uma dessas etapas leva sete dias (Figura 1). Assim, o método convencional normalmente requer cerca de três semanas.

O tempo necessário para a triagem de células transformadas de A. oryzae é muito maior do que o necessário para outros microrganismos comumente usados em pesquisas de biotecnologia, tornando o processo mais complicado. Por exemplo, ao usar Escherichia coli como hospedeiro, leva aproximadamente dois dias desde a introdução do DNA até a confirmação de seu efeito21.

Para contornar a limitação associada ao uso de A. oryzae , como mencionado acima, é introduzido um novo método de triagem de cultura líquida direta (DLC), que permite uma triagem mais rápida e simples para avaliação da produção secretora de proteínas heterólogas (Figura 1). No método DLC, um mutante auxotrófico de uridina e um meio líquido rico em nutrientes são usados. Usando este método, a etapa de triagem pode ser concluída dentro de seis dias após a introdução do DNA nos protoplastos em um formato de frasco de 200 mL ou dentro de 10 dias em um formato de microplaca de 24 poços. Além disso, a preparação demorada e trabalhosa de meios de placa de ágar não é necessária neste método. Há uma enorme vantagem em usar o método recém-descrito, especialmente considerando o fato de que o método convencional requer dois meios diferentes: a placa de ágar mole para aquisição de transformantes positivos, que requer manuseio cuidadoso e controle de temperatura, e placa de ágar sólido para seleção de transformantes verdadeiros.

figure-introduction-1
Figura 1: Esquema da transformação de protoplastos mediada por polietilenoglicol (PEG) do fungo filamentoso, Aspergillus oryzae.
(Painel superior) Método de triagem convencional. (Painel inferior) Método de triagem de cultura líquida direta (DLC). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocolo

1. Preparação da suspensão fresca de esporos

  1. Inocular 20 μL de uma suspensão de esporos estoque (1 x 107 esporos / mL) no centro de uma placa de cultura contendo meio Czapek-Dox (CD) com uridina 20 mM (autoclavada a 121 ° C por 20 min, Tabela 1).
  2. Incubar a 30 °C durante 7 dias para promover a formação de esporos.
  3. Adicione 1,5 ml de solução Tween 20 a 0,01% (autoclavada a 121 °C durante 20 min) à placa de cultura que contém os esporos e suspenda os esporos raspando com um espalhador de células.
  4. Colete a suspensão de esporos em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL usando uma pipeta.
  5. Conservar a suspensão a 4 °C até à utilização.
    NOTA: Use a suspensão de esporos no procedimento a seguir dentro de 2 semanas. Para fazer um caldo para armazenamento de longo prazo, adicione glicerol à suspensão de esporos até uma concentração final de 15% e armazene a -80 °C.

2. Pré-cultura

  1. Adicionar 100 ml de meio polipeptona-dextrina (PD) (Tabela 2) num balão Erlenmeyer de 500 ml e autoclavá-lo a 121 °C durante 20 min.
  2. Depois de confirmar que a temperatura do meio é reduzida, adicione a solução de uridina, esterilizada passando por um filtro com poros de 0,22 μm, até uma concentração final de 20 mM.
  3. Adicione 200 μL da suspensão de esporos (1 x 107 esporos / mL) preparada na etapa 1.4 e incube a 30 ° C com agitação a 120 rpm por 36 h.

3. Preparação de protoplastos

  1. Colha a biomassa fúngica preparada na etapa 2.3 em um filtro de vidro com poros de 30 μm (autoclavado a 121 ° C por 20 min).
  2. Despeje 100 mL de água destilada (DW) (autoclavada a 121 °C por 20 min) no filtro de vidro e mexa várias vezes com uma espátula (autoclavada a 121 °C por 20 min).
  3. Após a lavagem com DW, despeje 100 mL de tampão cloreto de sódio (NaCl) (autoclavado a 121 ° C por 20 min, Tabela 3) no filtro de vidro e mexa várias vezes com uma espátula.
  4. Transfira cerca de 1−2 mL (volume úmido) das células para um tubo cônico de 50 mL usando uma espátula (autoclavada a 121 ° C por 20 min).
  5. Depois de adicionar 15 mL da solução enzimática (esterilizada passando por um filtro de poros de 0,22 μm, Tabela 4) a um tubo cônico de 50 mL, adicione tampão NaCl até que o volume total atinja 30 mL.
  6. Feche a tampa e sele com filme de parafina. Incubar a 30 °C com agitação a 60 rpm durante 2 h.
  7. Flua a solução resultante através de um filtro de células de 70 μm conectado ao tubo cônico de 50 mL para remover os micélios que não reagiram.
  8. Centrifugar a solução de protoplasto num tubo cónico de 50 ml a 2.150 x g e 4 °C durante 20 min.
  9. Descarte cuidadosamente o sobrenadante para evitar que o pellet se desloque. Adicione 1 mL de solução esterilizada gelada B (autoclavada a 121 ° C por 20 min, Tabela 5) e suspenda suavemente os protoplastos precipitados por pipetagem.
  10. Transfira os protoplastos suspensos para um tubo estéril de 1,5 mL.
  11. Centrifugar a 2,220 x g e 4 °C durante 5 min e retirar o sobrenadante. Em seguida, adicione 1 mL de solução gelada B e suspenda suavemente o pellet pipetando.
  12. Repita a etapa 3.9.
  13. Usando um hemocitômetro, meça o número de protoplastos ao microscópio.
  14. Prepare uma suspensão de protoplastos (1−3 x 107 protoplastos / mL) na solução B e armazene-a no gelo até o uso.
    NOTA: Use a suspensão de protoplasto imediatamente no procedimento a seguir.

4. Introdução de DNA para produção secretora de proteína

  1. Usando um plasmídeo contendo um de DNA para produção secretora de proteína como molde, amplifice o fragmento de DNA necessário para a produção secretora por PCR.
  2. Preparar a amostra de ADN a utilizar para transformação através do processamento do produto PCR utilizando um kit de purificação PCR.
  3. Adicione 1 mL da solução de protoplasto, 200 μL de solução C (autoclavada a 121 ° C por 20 min, Tabela 6) e 50 μL da amostra de DNA (0,5 − 1 μg / μL) em um tubo cônico estéril e pré-resfriado de 15 mL e misture a solução suavemente por pipetagem.
    NOTA: A solução C é altamente viscosa e pode ser difícil de manusear; Assegure uma mistura completa por pipetagem.
  4. Incube o tubo no gelo por 30 min.
  5. Adicione 1,5 mL de solução C, misture delicadamente pipetando e, em seguida, deixe a solução em temperatura ambiente por 20 a 30 min.

5. Triagem direta de cultura líquida

NOTA: Seleccionar o sistema de cultura utilizando balões Erlenmeyer (ponto 5.1) ou microplacas (ponto 5.2).

  1. Sistema de cultura em balão Erlenmeyer de 200 mL
    1. Adicione 50 mL de meio PD contendo 0,8 M de sorbitol a um frasco Erlenmeyer de 200 mL e esterilize em autoclavagem a 121 °C por 20 min.
    2. Depois de confirmar que a temperatura do meio é reduzida, adicione a suspensão de protoplastos preparada na etapa 4.5 a uma concentração final de 1 x 105 protoplastos / mL.
    3. Incubar a cultura durante 6 dias a 30 °C com agitação a 120 rpm.
    4. Colete 1 ml do meio e conserve num tubo de 1,5 ml a 4 °C. Armazene a amostra de cultura a -20 ° C, se não for analisada imediatamente.
    5. Misture 20 μL de amostra de cultura e 20 μL de tampão de amostra de dodecil sulfato de sódio (SDS) (Tabela 7) em um tubo de 1,5 mL e ferva a 95 ° C por 5 min.
    6. Após o resfriamento em gelo, carregue 20 μL da amostra fervida e 5 μL de padrão de proteína pré-fabricada em um gel pré-moldado e analise a produção secretora da proteína heteróloga alvo por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE)10.
  2. Sistema de cultura usando uma microplaca de 24 poços
    1. Adicione a suspensão de protoplasto preparada na etapa 4.5 ao meio PD esterilizado contendo sorbitol 0,8 M até uma concentração final de 1 x 105 protoplastos / mL e misture suavemente por pipetagem.
    2. Adicionar 1 ml da solução preparada no passo 5.2.1 a três alvéolos numa microplaca de 24 poços.
    3. Colocar a tampa e incubar a 30 °C, agitando a 175 rpm durante 10 dias.
    4. Colete 1 mL de meio e armazene em tubo de 1,5 mL a 4 ° C. Armazene a amostra de cultura a -20 ° C, se não for analisada imediatamente.
    5. Misture 20 μL da amostra de cultura e 20 μL de tampão de amostra SDS em um tubo de 1,5 mL e ferva a 95 ° C por 5 min.
    6. Após o resfriamento no gelo, carregue 20 μL da amostra fervida e 5 μL de padrão de proteína pré-fabricada em um gel pré-moldado e analise a produção secretora da proteína heteróloga alvo por SDS-PAGE10.

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Resultados

Os resultados para a introdução do de expressão de DNA que codifica Talaromyces cellulolyticus cellobiohydrolase (CBH: GenBank Accession Number E39854) em um auxotrófico de uridina da cepa HO422 de A. oryzae e a triagem para a produção secretora da proteína heteróloga são descritos abaixo.

Preparação da suspensão fresca de esporos

O rendimento final da suspensão de esporos de uma placa de ágar foi de 1 mL (1...

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Discussão

Desenvolvemos um sistema que permite a triagem de transformantes de A. oryzae mais rapidamente do que o método convencional, através da realização de cultura líquida dos protoplastos. O aspecto mais crítico deste método é a pressão osmótica do meio líquido. A pressão osmótica adequada para cultura líquida foi otimizada com sorbitol. O crescimento da cepa HO4 de A. oryzae foi mais ativo na presença de 0,8 M de sorbitol (Figura 3A). No método...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Rinkei Okano pela ajuda com os experimentos. Os autores agradecem ao professor Katsuya Gomi, da Universidade de Tohoku, e ao professor Masayuki Machida, do Instituto de Tecnologia de Kanazawa, pelas valiosas discussões. Este trabalho foi financiado pelo Honda Research Institute Japan Co., Ltd.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 M NaOHNACALAI TESQUE, INC.37421-05
1 M Tris-HCl (pH 7,5)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation318-90225
1 M Tris-HCl (pH 6,8)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation2106-100
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mLAS ONE Corporation1-1600-03
Tubo de centrífuga cônico de 15 mLBecton, Dickinson and Company352196
2- mercaptoetanolBio-Rad Laboratories, Inc.
1610710 Microplaca de 24 poçosAGC TECHNO GLASS CO., LTD.3820-024
Tubo de centrífuga cônico de 50 mLBecton, Dickinson and Company352070
70-µ Filtro de célula mBecton, Dickinson and Company352350
ÁgarFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation010-15815
AutoclaveTOMY SEIKO CO., LTD.LSX-700
Azul de bromofenolFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation021-02911
CaCl2FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation038-24985
Casamino acidFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation393-02145
Celulase R-10Cosmo Bio Co., Ltd.16419
Hidrato de dextrinaFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation044-00585
D-SorbitolFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation191-14735
e-PAGELATTO CORPORATIONE-T/R1020LUsado para gel pré-moldado em SDS-PAGE
Dispositivo de eletroforeseATTO CORPORATIONWSE-1150Usado para SDS-PAGE
FeSO4· 7H2OFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation098-01085
Filtro de vidro 17G3Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd.
GlicerolFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation070-04941
HemocitômetroFunakoshi Co., Ltd.521-10
Centrífuga refrigerada de alta velocidadeKUBOTA CORPORATION7780Utilizada para centrifugação de amostras em tubos de centrífuga cônicos de 50 mL
IncubadoraTAITEC CORPORATION.G· BR-200Utilizado para cultura líquida de frascos e preparação de protoplastos
IncubadoraTAITEC CORPORATION.BR-43FLUsado para cultura líquida de microplacas e cultura de placas
KClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation163-03545
KH2PO4NACALAI TESQUE, INC.28721-55
Enzima de liseSigma-AldrichL1412-10G
MgSO4· 7H2OFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation131-00405
Micro centrífuga refrigeradaKUBOTA CORPORATION3740Usado para centrifugação de amostras em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL
MicroscópioLeica MicrosystemsDMI6000 B
NaClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation190-13921
NaH2PO4· 2H2ONACALAI TESQUE, INC.31718-15
NaNO3FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation195-02545
Parafilm MBemis Company, IncKit de purificação de PCR PM-996
QIAGEN K.K28104
Placa de PetriSumitomo Bakelite Co., Ltd.MS-11900Usado como placa de cultura
PolietilenoglicolSigma-AldrichP3640-500G
Peptona polipeptonaBecton, Dickinson and Company211910
Escadas de proteínaBio-Rad Laboratories, Inc.161-0377Usado como marcador de peso molecular em SDS-PAGE
Dodecil sulfato de sódioBio-Rad Laboratories, Inc.
Filtro estérilMerck KGaASLGP033RB
SacaroseNACALAI TESQUE, INC.30404-45
Tween 20Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.T0543
UridinaSigma-AldrichU3750-25G
YatalaseTakara Bio Inc.T017
00000941471610301

Referências

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