O objetivo do protocolo é comparar diferentes condições de revestimento de matriz extracelular (ECM) para avaliar como o revestimento diferencial afeta a taxa de crescimento de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Em particular, pretendemos estabelecer condições para obter o crescimento ideal das culturas de iPSC.
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Artigo de método
Medindo a confluência de iPSCs usando um sistema automatizado de imagem.
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este estudo se concentra em entender como o crescimento de iPSCs em diferentes substratos de revestimento de ECM pode afetar a confluência celular. Um protocolo para avaliar a confluência de iPSC em tempo real foi estabelecido sem a necessidade de contar células em suspensão de célula única para evitar qualquer perturbação do crescimento. Um sistema de análise de imagens de alto conteúdo foi usado para avaliar a confluência de iPCS em 4 ECMs diferentes ao longo do tempo de forma automatizada. Diferentes configurações de análise foram usadas para avaliar a confluência celular de iPSCs aderentes e apenas uma pequena diferença (em 24 e 48 horas com laminina) foi observada se uma máscara de 60, 80 ou 100% foi aplicada. Também mostramos que a laminina leva à melhor confluência em comparação com Matrigel, vitronectina e fibronectina.
Introdução
As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são obtidas a partir de células somáticas e podem ser diferenciadas em diferentes tipos de células. Eles são frequentemente usados como um sistema para modelar a patogênese da doença ou realizar triagem de medicamentos, e também oferecem o potencial para ser usado no contexto da medicina personalizada. Como as iPSCs têm grande potencial, é importante caracterizá-las completamente para uso como um sistema modelo confiável. Mostramos anteriormente a importância do cultivo de iPSCs em um ambiente hipóxico, pois essas células dependem da glicólise e um ambiente aeróbio pode causar desequilíbrioredox1
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Protocolo
1. Revestimento de 96 placas de poço
NOTA: Diferentes revestimentos foram testados na mesma placa, mas poços separados (consulte Arquivo Suplementar).
- Diluir o Matrigel 1:100 em DMEM. Adicionar 100 μL por poço às 96 placas de poço e incubar por 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, remova a solução e lave os poços com 100 μL de DMEM duas vezes.
- Laminina diluída (20 μg/mL, LN-521) em PBS (com cálcio e magnésio). Adicionar 100 μL ao poço e incubar a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, realize duas lavagens com DMEM antes de semear as células.
- Vitronectina diluída (10 μg/mL) em tampão de dilu....
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Resultados
Neste estudo, investigamos a confluência de iPSCs quando cultivadas em diferentes condições de revestimento. Usando um citômetro, fomos capazes de obter resultados prontamente informativos em triplicados em 5 dias. Como as iPSCs dificilmente se ligam a recipientes plásticos e um revestimento é necessário para suportar sua proliferação, decidimos monitorar a confluência de iPSCs humanas, pois é indicativa da saúde da cultura celular e pode refletir em seu potencial de diferenciação. Após a expansão in vitro, semeamos as i.......
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Discussão
O uso de iPSCs para modelagem de doenças e futura triagem de medicamentos, juntamente com sua possível aplicação em medicina de precisão, torna-a uma tecnologia de grande relevância e, por essa razão, acreditamos que é necessário entender claramente a condição de cultura in vitro que melhor se assemelha à situação fisiológica das células-tronco embrionárias. Neste contexto, testamos diferentes revestimentos de ECM usando iPSCs do tipo selvagem, a fim de entender as condições que permitem que as células permaneçam em um e.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
O estudo foi apoiado por bolsas da Fondazione Bambino Gesù e Ricerca Corrente (Ministério da Saúde italiano) para C.C. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Enrico Bertini (Departamento de Neurociência, Unidade de Doenças Neuromusculares e Neurodegenerativas, Laboratório de Medicina Molecular, Hospital de Pesquisa Infantil Bambino Gesù), Dra. Stefania Petrini (Centro de Núcleo de Microscopia Confocal, Laboratórios de Pesquisa, Hospital de Pesquisa Infantil Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Departamento de Onco-hematologia, Terapia Genética e Celular, Hospital de Pesquisa Infantil Bambino Gesù) e Roberta Ferretti (Departamento d....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pipetas Sorológicas Stripette de 10 mL, Poliestireno, Embaladas individualmente em papel/plástico, Ferramenta Corning | 4488 | ||
| Tubos de centrífuga cônicos de polipropileno (PP) de alta clareza de 15 mL Ferramenta | Falcon | 352097 | |
| 1x PBS (Com Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (sem Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | |
| Medium 5 mL Stripette Pipetas sorológicas, poliestireno, embaladas individualmente em papel/plástico, ferramenta estéril | Corning | 4487 | |
| Microplaca de cultura celular, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Suporte |
| Placa de cultura celular, 6 poços | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST - READ 102 | Biosigma | BVS100 | |
| Tool Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectina | Merck | FC010 | Revestimento |
| Glicerol | Sigma | G5516 | Reagente |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagente |
| Laminina 521 | Tecnologias de Células-Tronco | 77003 | Revestimento |
| L-Glutamina (200 mM) | Reagente | Gibco LS25030081 | |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | |
| Coating Fibroblastos embrionários de camundongo (MEF) | Life Technologies | A24903 | Revestimento |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Suplemento |
| Medium MTESR1 | Stem Cell Technologies | 85852 | |
| Penicilina-Estreptomicina Média (10.000 U/mL) | Reagente Gibco | 15140122 | |
| Faloidina | Sigma | P1951 | Reagente |
| Vitronectina | Stem Cell Technologies | 7180 | Revestindo |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagente |
Referências
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated hu....
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Reimpressões e permissões
