Avaliação da oxidação celular usando uma proteína fluorescente verde específica do compartimento subcelular

Summary

Este protocolo descreve a avaliação do status de redox específico do compartimento subcelular dentro da célula. Uma sonda fluorescente sensível ao redox permite uma análise racionmétrica conveniente em células intactas.

Abstract

A medição do equilíbrio de oxidação/redução intracelular fornece uma visão geral do estado fisiológico e/ou fisiofisiológico de um organismo. Os tiais são especialmente importantes para iluminar o status de redox das células através de suas relações reduzidas de dithiol e dissulfeto oxidado. Proteínas fluorescentes que contêm cisteína projetadas abrem uma nova era para biosensores sensíveis ao redox. Uma delas, a proteína fluorescente verde sensível ao redox (roGFP), pode ser facilmente introduzida em células com transdução adenoviral, permitindo que o status de redox dos compartimentos subcelulares seja avaliado sem interromper os processos celulares. Cisteínas reduzidas e cistinos oxidados de roGFP têm máxima de excitação em 488 nm e 405 nm, respectivamente, com emissão de 525 nm. Avaliar as proporções dessas formas reduzidas e oxidadas permite o cálculo conveniente do equilíbrio de redox dentro da célula. Neste artigo de método, foram utilizadas células cancerígenas de mama humanas triplas-negativas (MDA-MB-231) para avaliar o estado de redox dentro da célula viva. As etapas do protocolo incluem transdução de linha celular MDA-MB-231 com adenovírus para expressar roGFP citosomico, tratamento com H₂O₂, e avaliação da razão cisteína e cistina com citometria de fluxo e microscopia de fluorescência.

Introduction

O estresse oxidativo foi definido em 1985 por Helmut Sies como "uma perturbação no equilíbrio prooxidante-antioxidante em favor do primeiro"¹, e uma infinidade de pesquisas foi conduzida para obter o estado de redox específico da doença, nutrição e envelhecimento dos organismos^1,,2,,3. Desde então, a compreensão do estresse oxidativo tornou-se mais ampla. Testar as hipóteses do uso de antioxidantes contra doenças e/ou envelhecimento mostrou que o estresse oxidativo não só causa danos, mas também tem outros papéis nas células. Além disso, os cientistas ....

Protocol

NOTA: Este protocolo foi otimizado para células MDA-MB-231 confluentes de 70%-80%. Para outras linhas celulares, o número de células e a multiplicidade de infecção (MOI) devem ser reotimizados.

1. Preparação de células (dia 1)

1. Mantenha a linha celular MDA-MB-231 em frascos de 75 cm² com 10 mL do meio Eagle modificado (DMEM) modificado de Dulbecco suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% CO_2.
   NOTA: DMEM suplementado com 10% de FBS, 37 °C e atmosfera umidificada de 5% de CO₂ são utilizados para todas as incubações de apego e tratamento em todo o pr....

Results

O estado redox de CyS/CySS é facilmente avaliado com roGFPs transduzidas. A sonda fluorescente quantifica a razão entre as formas reduzidas e oxidadas (comprimentos de onda de excitação 488 nm e 405 nm, respectivamente). Os dados de fluorescência podem ser obtidos tanto por citometria de fluxo quanto por microscopia.

Um grande número de células pode ser adquirida de forma consistente e conveniente usando citometria de fluxo. A análise consiste em 3 etapas principais: 1) selecionar a população .......

Discussion

O equilíbrio tiol/dissulfeto em um organismo reflete o estado redox das células. Organismos vivos têm glutationa, cisteína, tialis proteicos e tiols de baixo peso molecular, todos afetados pelo nível de oxidação e ecoam o estado redox das células⁴. RoGFPs projetados permitem a quantificação sem interrupções do equilíbrio thiol/dissulfeto através de seus resíduos CyS⁷. A propriedade racionmétrica do roGFP fornece medições de redox confiáveis para células de mamíferos. roGFP .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% Tripsina-EDTA	Gibco da Life Sciences	25200-056	Lâmina
câmara de 4 poços	Thermo Scientific	154526	Material de semeadura de células para imagens fluorescentes
Tubos de 5 ml com tampa de filtro de células	Falcon	352235	Tubo de suspensão de célula única para análise de citometria de fluxo
Placa de 6 poços	Corning	353046	Material de semeadura celular para análise de citometria de fluxo
Tubos cônicos de 15 ml	MidSci	C15B	Cultura de células
75 cm2 frascos de cultura de tecidos com tampa ventilada	Corning	4306414	Cultura de células
RoGFP específico para citosol adenoviral	ViraQuest	VQAd roGFP	roGFP construct gentilmente cedido pelo Dr. Schumaker
Classe II, Tipo A2 Gabinete	de Capuz de SegurançaThermo Scientific	1300 Series A2	Cell culture
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227	Contagem de células
Countess cell counter chamber slides	Invitrogen	C10283	Cell counting
DMEM	Gibco by Life Sciences	11995-065 Cultura de	células
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	Cultura de células
Ponteiras de pipeta filtradas, estéreis, 20 µ l	Fisherbrand	02-717-161	Cultura de células
Pontas de pipeta filtradas, estéreis, 1000 µ l	Fisherbrand	02-717-166	cultura de células
	BD Biosciences	LSRFortessa	Instrumento equipado com filtros passa-banda FITC e BV510 para análises de citometria de fluxo
Microscópio Fluorescente	Grupo de Microscopia Avançada (AMG)	Evos FL	Imagem fluorescente
Peróxido de hidrogênio 30%	Fisher Scientific	H325-100	Controle positivo
Light Cube, Custom	Life Sciences	CUB0037	Imagem fluorescente de células que expressam roGFP (ex 405 nm)
Light Cube, GFP	Thermo Scientific	AMEP4651	Imagem fluorescente de células que expressam roGFP (ex 488 nm)
MDA-MB-231	Coleção Americana de Cultura de Tecidos	HTB-26	Linha celular de câncer de mama epitelial humano
Tubos de microcentrífuga, 2 ml	Grenier Bio-One	623201	Cultura de células
PBS	Gibco by Life Sciences	10010-023	Cultura de células
Controlador de pipeta	Drummond	Hood Mate Modelo 360
Pipeta serológica, 1 ml	Fisherbrand	13-678-11B	Pipeta serológica de cultura celular
, 5 ml	Fisherbrand	13-678-11D	Pipeta
sorológica de cultura celular, 10 ml	Incubadora	cultura de células	13-678-11E
Incubadora	Thermo Scientific	HERACell 150i	CO2 para cultura de células
Coloração azul de tripano 0,4%	Invitrogen	T10282	Contagem de células